申请/专利权人：北海道公立大学法人札幌医科大学;尼普洛株式会社

申请日：2016-12-26

公开（公告）日：2023-12-12

公开（公告）号：CN108367027B

主分类号：A61K35/28

分类号：A61K35/28;A61P7/04;A61P9/10

优先权：["20151225 JP 2015-254410"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.12.12#授权;2019.01.04#实质审查的生效;2018.08.03#公开

摘要：提供用于降低与对闭塞血管的再开通疗法例如，药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂的施予，对血栓的物理性去除相伴的脑出血风险、更有效地治疗缺血性血管障碍的新手段。本发明为含有间充质干细胞的、缺血性血管疾病的治疗用药物，其特征在于，与对闭塞血管的再开通疗法联合使用。更详细而言，本发明为缺血性血管障碍的治疗用药物，其特征在于，降低与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险，并且使得其可应用时间延长。

主权项：1.间充质干细胞在制备用于降低与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险的药物中的用途，其特征在于，所述药物与对闭塞血管的再开通疗法联合使用。

全文数据：脑梗塞的治疗用药物技术领域[0001][相关申请][0002]作为本申请的优先权基础的日本特愿2015-254410号（2015年12月25日提出申请）的说明书中记载的内容被包括进本说明书中。[0003][技术领域][0004]本发明涉及含有间充质干细胞的、缺血性血管疾病的治疗药。更详细而言，本发明涉及能够降低与血栓溶解疗法等对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险、使得其可施予时间延长的缺血性血管疾病的治疗药。背景技术[0005]脑梗塞是指由于脑动脉的闭塞或狭窄而引起脑缺血，造成脑组织坏死或接近坏死的状态的病况。针对脑梗塞尤其是急性期或超急性期的脑梗塞）、心肌梗塞而言，为了防止由缺血导致的坏死，血栓溶解或对血栓的物理性去除成为治疗的第一选择。然而，对闭塞血管的再开通存在经常伴有脑出血风险的问题。[0006]与尿激酶等其他血栓溶解剂相比，t-PA静脉注射疗法的血栓溶解活性更高，出血风险也更低，因此在超急性期或急性期脑梗塞的再开通治疗中成为标准治疗。但是，由t-PA带来的治疗效果随着时间经过而降低，并且出血风险升高，因此，通常必须在发病后4.5小时以内开始该治疗。因此，为了减少出血风险、延长可利用t-PA进行治疗的时间，人们需要抑制内皮障碍的新治疗手段。[0007]另一方面，间充质干细胞MesenchymalStemCell:MSC具有保护脑（实质及血管）的作用是已知的。已使用实验性梗塞模型确认了脑梗塞后施予MSC可减少梗塞体积、改善行动机能非专利文献1〜3、专利文献1。另外，利用静脉施予MSC对脑梗塞患者进行治疗也多有实施，运动机能、损伤部位的改善也已有报道非专利文献4、专利文献2。[0008]现有技术文献[0009]专利文献[0010]专利文献l:W02002000849号[0011]专利文献2:W02009002503号[0012]非专利文献[0013]非专利文献i:iihoshiS.等，BrainRes_2004;1007:l-9.[00M]非专利文献2:NomuraT•等，Neuroscience.2005;136:161-169.[0015]非专利文献3:HonmaT•等，Exp.Neurol.2006;199:56-66•[0016]非专利文献4:H〇nmou0•等,Brain.2011;134:1790-1807.发明内容[00171发明所要解决的课题[0018]本发明的课题在于，提供针对与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血的新治疗方法。特别在于，提供用于降低与血栓溶解疗法相伴的脑出血风险、对与缺血性血管疾病相伴的运动机能及高级机能的障碍加以治疗的手段。[0019]用于解决课题的手段[0020]本发明的发明人发现，针对一过性大脑中动脉闭塞模型（其是通过向动脉插入栓塞线而诱导得到的），通过将MSC的静脉施予与利用rt-PA的血栓溶解疗法联合使用，出血性梗塞被显著抑制、经时性运动机能也显示出良好的改善。[0021]BP，本发明涉及以下的⑴〜（18[0022]1缺血性血管疾病的治疗用药物，所述药物含有间充质干细胞，其特征在于，所述药物与对闭塞血管的再开通疗法联合使用；[0023]2如上述（1所述的药物，其特征在于，降低与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险；[0024]3如上述1或⑵所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括选自血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、及血液凝固抑制剂的施予、以及对血栓的物理性去除中的任意一种或两种以上；[0025]⑷如上述1〜⑶中任一项所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括血栓溶解剂的施予；[0026]⑸如上述⑷所述的药物，其中，血栓溶解剂为纤溶酶原激活物；[0027]⑹如上述3〜⑸中任一项所述的药物，其特征在于，使得血栓溶解剂的可施予时间延长；[0028]⑺如上述⑴〜⑹中任一项所述的药物，其中，缺血性血管疾病为缺血性脑血管疾病或心肌梗塞；[0029]⑻如上述⑴〜⑹中任一项所述的药物，其中，缺血性血管疾病为超急性期或急性期的缺血性脑血管疾病或急性心肌梗塞；[0030]9如上述⑴〜⑻中任一项所述的药物，其中，间充质干细胞为来自骨髓的间充质干细胞；[0031]10用于预防与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血的药物，所述药物含有间充质干细胞。[0032]11如上述（10所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括选自下述中的任意一种或两种以上:血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、及血液凝固抑制剂的施予、以及对血栓的物理性去除；[0033]12如上述（1〇或（11所述的药物，其中，闭塞血管的再开通疗法包括血栓溶解剂的施予；[0034]13如上述12所述的药物，其中，血栓溶解剂为纤溶酶原激活物；[0035]14如上述（11〜（13中任一项所述的药物，其特征在于，使得血栓溶解剂的可施予时间延长；[0036]15如上述10〜（14中任一项所述的药物，其用于缺血性血管疾病的患者；[0037]16如上述（15所述的药物，其中，缺血性血管疾病为缺血性脑血管疾病或心肌梗塞；[0038]17如上述（15或（16所述的药物，其中，缺血性血管疾病为超急性期或急性期的缺血性脑血管疾病或心肌梗塞；[0039]18如上述（10〜（17中任一项所述的药物，其中，间充质干细胞为来自骨髓的间充质干细胞。[0040]发明效果[0041]根据本发明，可实现以下协同效应:在减少与t-PA疗法等对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险的同时，提高MSC的治疗效果运动机能的改善、梗塞病变的减少）。另外，通过减少脑出血风险，从而能够使得t-PA疗法通常被认为要在发病4.5小时内进行等血栓溶解疗法的可应用时间延长。附图说明[0042][图1]图1不出了实验方案（experimentalprotocol的概要。大脑中动脉闭塞middlecerebralarteryocclusionMCA060分钟后获得而1，随机分成4组后，对闭塞进行再开通并施予rt-PA或生理盐水闭塞后90分钟），再30分钟后施予培养基或MSC。[0043][图2]图2示出了将rt-PA疗法和MSC施予联用之后的急性出血发病情况。A:各组生理盐水+培养基、rt-PA+培养基、生理盐水+MSC、rt-PA+MSC的图像，B:第一天的脑出血发病率，C:第一天基于T2WI-MRI评价得到的出血体积林P0•01，*P〇•05，图基事后检验Tukey’spost-hoctest。[0044][图3]图3示出了明胶酶谱法Gelatinzymography的结果。A:MMP_9的表达量左起为分子标记Makar、伪实验Sham，对侧:生理盐水+培养基、rt_PA+培养基、生理盐水+MSC、rt-PA+MSC，同侧：生理盐水+培养基、rt-PA+培养基、生理盐水+MSC、rt-PA+MSC。B:利用光密度测定法densitometry测定得到的MMP-9活性林P〇_〇1，图基事后检验）。[0045][图4]图4示出了利用MRI分析得到的缺血病变部位的特性。A:各组的闭塞前的DWI第1栏）、再开通后第4天第2栏）、再开通后第7天第3栏）、再开通后第14天第4栏）、再开通后第28天第5栏的T2WHDWI闭塞前及再开通后第1、4、7、14、21、28天时基于12评1评价得到的各组的病变体积。C:基于PWI评价得到的rCBF林P〇.〇1，仲〇.〇5，图基事后检验。[0046][图5]图5表示运动平板treadmill负荷试验的结果。针对各组，示出了再开通后第1天、第4天、第7天、第14天、第M天、第2S天时大鼠在运动平板上所能行进的最大速度**P0.01，*P0.05,图基事后检验）。具体实施方式[0047]1.缺血性血管疾病治疗药[0048]本发明涉及缺血性血管疾病的治疗用药物，所述药物含有间充质干细胞，其特征在于，所述药物与对闭塞血管的再开通疗法例如，药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂的施予、对血栓的物理性去除联合使用。[0049][间充质千细胞][0050]本发明中使用的所谓间充质干细胞，是在间充质组织的间质细胞中微量存在的、具有多分化能力及自我复制能力的干细胞，已知其不仅可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等结缔组织细胞，还具有分化为神经细胞、心肌细胞的分化能力。[0051]作为间充质干细胞的来源，可举出骨髓、末梢血、脐带血、胚胎、脑等，优选来自骨髓的间充质干细胞骨髓间充质干细胞）、尤其是人骨髓间充质干细胞。来自骨髓的间充质干细胞具有以下优点：由于1可期待显著的效果、2副作用的危险性低、3可期待充分的供体细胞的供给、4可实现为非侵入性治疗的自体移植，因此，5感染症的风险低、6不存在对免疫排斥反应的担忧、7没有伦理性问题、8容易被社会接受、9容易作为普通医疗而广泛普及。并且，骨髓移植疗法是已得到临床现场应用的治疗，其安全性也已被确认。另外，来自骨髓的干细胞的迀移性高，除了向局部移植之外，其还可通过静脉内施予到达目标损伤组织，从而可期待其治疗效果。[0052]细胞可以是由ES细胞、诱导多能干细胞iPS细胞等）分化诱导出的细胞，也可以是经过株系化的细胞，还可以是从生物体分离、增殖而得到的细胞。细胞可来自异体细胞，也可来自自体细胞，来自自体细胞来自患者自身的细胞的间充质干细胞是优选的。[0053]本发明中使用的间充质干细胞优选为未分化的状态。这是因为，未分化的状态的细胞的增殖率及导入生物体内后的存活率高。本发明的发明人还开发出了此类细胞的获得方法，其详细内容记载于TO2009002503号中。[0054]本发明的发明人开发出的上述方法中，使用含有人血清优选为自体血清）、且不含或仅以极低浓度含有抗凝剂肝素等的培养基，使在实质上不与抗凝剂肝素等接触的条件下从骨髓液等中分离得到的细胞进行增殖。[0055]培养基中的细胞密度对细胞的性质及分化的方向性带来影响。在间充质干细胞的情况下，培养基中的细胞密度大于8,500个cm2时，细胞的性质将发生变化，因此，优选以至多为8,500个cm2以下的方式进行传代培养，更优选地，在达到5,500个cm2以上的时间点进行传代培养。[0056]本发明的发明人开发出的上述方法中使用含有人血清的培养基，因此，考虑到血清供体的负担，期望尽可能减少培养基更换的次数，培养基更换可进行例如至少每周1次、更优选每周1〜2次。[0057]就培养而言，重复进行传代培养直到细胞总数成为108个以上。需要的细胞数量可根据使用目的而变化，认为用于治疗例如脑梗塞等缺血性脑疾病的移植所需要的间充质干细胞的数量为1〇7个以上。根据本发明的发明人开发出的方法，经12天左右可得到107个间充质干细胞。[0058]增殖后的MSC也可根据需要而采用冷冻保存等手法例如，利用-152°C的深冻冰箱deepfreezer保存至使用为止。冷冻保存中使用含有血清优选为人血清，更优选为自体血清）、葡聚糖、DMS0的培养基RPMI等哺乳动物细胞用的培养基作为冷冻保存液。例如，可将细胞悬浮于冷冻保存液（其含有:经过通常的过滤灭菌的RPMI20.5mL、从患者采集的自体血清20.5mL、葡聚糖5mL、DMS05mL中并于-150°C冷冻保存。例如，作为DMS0可使用NiproCorporation制的Cryoserv，葡聚糖可使用大塚制药制的低分子葡聚糖L注射液LOWMOLECULARDEXTRANLINJECTION，但不限于这些。[0059]本发明的药物中含有的MSC的细胞数量越多越理想，但考虑到针对对象的施予时间、培养所需要的时间，为显示出效果的最小量是实用的。因此，在本发明的药物的优选方式中，间充质干细胞的细胞数量为107个以上，优选为5X107个以上，更优选为1〇8个以上，进一步优选为5X108个以上。[0060]本发明的药物优选为非口服施予制剂，更优选为非口服全身施予制剂、尤其是静脉内施予制剂。作为适合非口服施予的剂型，可举出溶液性注射剂、悬浮性注射剂、乳浊性注射剂、使用时配制型注射剂等注射剂、移植物等。非□服施予用制剂为水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态，例如，可与药理学上允许的载体或介质等适当组合，制剂化为合适的单元施予形态，该药理学上允许的载体或介质具体而言有灭菌水、生理盐水、培养基尤其是RPMI等用于培养哺乳动物细胞的培养基）、PBS等生理缓冲液、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、赋形剂vehicle、防腐剂、粘结剂。[0061]作为注射用的水溶液，可举出例如生理盐水、培养基、PBS等生理缓冲液，含有葡萄糖、其他助剂的等渗液，例如可举出D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠等，还可与适当的助溶剂、例如醇具体而言，乙醇、多元醇、丙二醇、聚乙二醇）、非离子性表面活性剂例如聚山梨醇酯80、HC0-50等并用。[0062][缺血性血管疾病][0063]本发明的药物用于治疗缺血性血管疾病。缺血性血管疾病是指由于动脉血流的减少而呈现出局部性血管病例如，变性、闭塞）的状态，可举出例如缺血性脑血管疾病、缺血性心脏病。[0064][缺血性脑血管疾病][0065]本发明的药物用于治疗缺血性脑血管疾病。如前所述，MSC具有保护脑实质及血管的作用是已知的，其己被用于通过静脉施予来治疗脑梗塞等缺血性脑血管疾病。[0066]作为缺血性脑血管疾病，可举出例如脑梗塞例如，动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞atherothromboticbraininfarction、脑血栓、脑栓塞、腔隙性脑梗塞（lacunarinfarction、BAD分支动脉粥样硬化病，BranchAtheromatousDisease、Trousseau综合征、血液凝固异常、动脉解离、静脉梗塞、血管炎、抗磷脂抗体综合征）、及一过性脑缺血发作TIA等。[0067][缺血性心脏病][0068]本发明的药物也用于治疗心肌梗塞等缺血性心脏病。心肌梗塞是指向心脏供给氧、营养的冠状动脉血管发生闭塞、狭窄，血液的流量下降、心肌成为缺血状态而坏死的状〇[0069]本发明的药物适于将应用对闭塞血管的再开通疗法尤其是血栓溶解疗法）的超急性期8小时以内）或急性期8小时〜24小时）的缺血性脑血管疾病、急性心肌梗塞发病起3天以内），应用时期可根据患者的症状适当判断。[0070][血栓溶解剂][0071]对于缺血性血管疾病尤其是急性期或超急性期的缺血性脑血管疾病、心肌梗塞）而言，为了防止由缺血导致的坏死，利用血栓溶解或血栓的物理性去除等的对闭塞血管的再开通成为治疗的第一选择。[0072]血栓溶解剂可举出尿激酶、尿激酶原、组织纤溶酶原激活物（tissue-piasminogenActivator:t-PA、那沙普酶nasaruplase、链激酶等。[0073]目前使用的t-PA均为重组型t-PArt-PAat-PA中，除了具有与天然型t-PA相同的氨基酸序列的阿替普酶alteplase、替索激酶tisokinase以外，还有为了延长半衰期而进行了氨基酸改变的帕米普酶pamiteplase等。目前，作为在日本销售的含有t-PA的药物，ACTIVACIN注册商标注射液、GRTPA注册商标注射液、Cleactor注册商标注射液已有市售，前二者向缺血性脑血管疾病及急性心肌梗塞的应用已获得许可。并且，最后一者向急性心肌梗塞和急性肺栓塞症的应用已获得许可。[0074]血栓溶解剂可通过溶解血栓来改善缺血、防止脑组织的坏死，但另一方面，其伴有出血的风险。另外，尿激酶的可施予时间为发病6小时以内，t-PA的可施予时间为发病4.5小时以内，其可施予时间有限。[0075]t-PA通过使溶解血纤维蛋白（其是血栓的主要成分）的纤溶酶活化而具有比其他血栓溶解剂更高的血栓溶解能力，因此，目前成为血栓溶解疗法的第一选择。另外，t-PA兼有作为血小板凝集抑制剂及血液凝固抑制剂的作用。然而，如前文所述，脑出血风险和短暂的可施予时间4.5小时限制了其应用。[0076]本发明的药物通过与包含血栓溶解剂的药物、尤其是包含t-PA的药物联合使用，从而能够降低其脑出血风险、且能够使其可施予时间延长。[0077][血小板凝集抑制剂抗血小板药][0078]血小板凝集抑制剂抗血小板药可通过抑制血小板的凝集来预防血栓形成。作为血小板凝集抑制剂，可举出例如阿司匹林、氯卩比格雷（clopidogrel、西洛他卩坐、噻氯匹定等，但不限于这些。[0079][血液凝固抑制剂抗凝剂][0080]血液凝固抑制剂抗凝剂可通过抑制凝血因子的功能来预防血栓形成。作为血液凝固抑制剂，可举出例如肝素、低分子肝素、阿加曲班、达那肝素钠、达肝素、那屈肝素、贝米肝素、磺达肝素fondaparinux、阿加曲班等抗凝血酶剂等，但不限于这些。[0081]本发明的药物可在对闭塞血管的再开通疗法之前应用，也可在对闭塞血管的再开通疗法之后应用，还可同时地应用。本发明的药物MSC可利用静脉施予这种简便的方法而容易地到达患部。[0082][对血栓的物理性去除][0083]关于对血栓的物理性去除的方法，可举出利用血管内手术等的机械性血栓回收疗法、颈动脉内膜剥离术等，但不限于这些。另外，也可以为通过旁路手术、支架治疗、球囊治疗、抽吸治疗、利用超声波等的粉碎等进行的血流再通等。[0084][协同效应][0085]本发明的药物通过与对闭塞血管的再开通疗法例如，药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂的施予，对血栓的物理性去除联合使用，能够减少与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险。特别是就血栓溶解剂而言，其可施予时间短而导致其应用受限，本发明的药物能够延长血栓溶解剂的可施予时间。例如，通过联合使用本发明的药物，可期待t-PA的可施予时间延长至少4.5小时、6小时、8小时、12小时、24小时或24小时以上。[0086]此外，血栓溶解剂通过改善微循环而提高MSC的治疗效果，从而使得由MSC所带来的运动机能的改善、组织修复效果与单独施予的情况相比显著增大。由此，包含血栓溶解剂的药物与本发明的药物的联合使用可获得无法由单独施予预测到的协同效应。[0087]2.与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血的预防药[0088]本发明还提供含有间充质干细胞的、用于预防与对闭塞血管的再开通疗法例如，药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂的施予，对血栓的物理性去除等相伴的脑出血的药物。如前所述，对缺血性血管疾病的闭塞血管的再开通疗法伴有脑出血风险，本发明的药物通过对丽P基质金属蛋白酶，Matrixmetalloproteinase-9的活化加以抑制，能够抑制与其相伴的内皮障碍，使脑出血风险降低。[0089]3.缺血性血管疾病的治疗方法[0090]本发明提供缺血性血管疾病的治疗方法，其特征在于，将对闭塞血管的再开通疗法药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂）的施予，血栓的物理性去除等与含有MSC的药物进行联合使用。在一个实施方式中，闭塞血管的再开通疗法包括t-PA等血栓溶解剂的施予、或血栓的物理性去除。另外，作为对象的疾病优选为脑梗塞等缺血性脑血管疾病、心肌梗塞等缺血性心脏病，更优选为超急性期或急性期的缺血性脑血管疾病脑梗塞等及急性心肌梗塞。[0091]另外，本发明提供降低或预防与尤其是缺血性脑血管疾病、缺血性心脏病的）血栓溶解疗法相伴的脑出血的方法，其特征在于，将对闭塞血管的再开通疗法药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂）的施予，对血栓的物理性去除等）与含有MSC的药物进行联合使用。在一种实施方式中，对闭塞血管的再开通疗法包括t-PA等血栓溶解剂的施予、或对血栓的物理性去除。另外，作为对象的疾病优选为脑梗塞等缺血性脑血管疾病、心肌梗塞等缺血性心脏病，更优选为超急性期或急性期的缺血性脑血管疾病脑梗塞等及急性心肌梗塞。[0092]此外，本发明也提供使尤其是缺血性脑血管疾病的）血栓溶解疗法的可施予时间延长的治疗方法，其特征在于，将闭塞血管的再开通疗法药物包含血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、血液凝固抑制剂）的施予，血栓的物理性去除等）与含有MSC的药物进行联合使用。[0093]尤其是，本发明的药物通过预防与血栓溶解剂例如，t-PA的施予相伴的脑出血、并使其可施予时间延长，从而使得以往无法应用血栓溶解疗法的患者能够应用血栓溶解疗法。本发明的药物可通过MSC所具有的组织再生•修复效果来改善与缺血性脑血管疾病相伴的运动机能疾病、促进梗塞病变部位的治愈，而血栓溶解剂可通过改善微循环来进一步提高这种MSC本来的效果。[0094]这样，本发明的药物通过保护血管内皮、抑制内皮障碍，从而在降低脑出血风险、实现安全的对闭塞血管的再开通疗法例如，血栓溶解疗法、血栓的物理性去除的同时，还具有作为MSC本来的功能的梗塞部位的组织修复、和伴随其的运动机能及高级机能疾病的改善效果，实现前所未有的缺血性血管疾病治疗。[0095]实施例[0096]以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。[0097]1.方法[0098]1来自大鼠骨髓的间充质干细胞的制备[0099]实验按照札幌医科大学的动物实验管理规定来实施。根据以往报道，将从成熟SD大鼠的大腿骨得到的骨髓用杜氏改良Eagle培养基Dulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM稀释成25ml，添加经过加热灭活的10%roS、2mM的1_谷氨酰胺、l〇〇Uml青霉素、O.lmgml链霉素，在5%C02气氛下于37°C孵育3天KimS.等，BrainReS.2006;1123:27-33•UkaiR.等，J_Neurotrauma_2〇〇7;24:5〇8-f52〇.。培养直至汇合状态（confluent，用膜蛋白酶-EDTA将黏附细胞剥离，以1X104个细胞ml的密度传代培养3次，得到间充质干细胞MSC〇[0100]⑵脑梗塞模型[0101]作为脑梗塞模型，使用大鼠一过性大脑中动脉闭塞tMCAO模型。根据以往报道，用氯胺酮75mgkg及甲苯噻嗪xylazine10mgkg将成熟雄性SD大鼠（280〜330g:n=171麻醉，从颈外动脉插入20.0〜22.0mm的栓塞线M0N0S0F，诱导出一过性大脑中动脉闭塞（HonmaT•等，Exp.Neurol.2006;199:56_66_SasakiM•等，MethodsMol.Biol.2009;549:187-195.。[0102]3实验方案图1[0103]在诱发一过性大脑中动脉闭塞60分钟后，拍摄DWI-MRI，评价初始梗塞体积。将初始梗塞体积不满足基准（220〜370mm3的动物从实验中排除。DWI-MRI拍摄30分钟后，除去插入的栓塞线，将大鼠随机地分成以下4组。[0104]组1生理盐水+培养基;n=43[0105]再开通后立刻静脉施予通常的生理盐水食盐水；1ml，在30分钟后施予新鲜的培养液DMEM;lml。[0106]组2rt-PA+培养基;n=48[0107]再灌注后立刻静脉施予^?々（1〇11^1^;11111，在3〇分钟后施予新鲜的培养基_M;lml。[0108]组3生理盐水+MSC;n=42[0109]再开通后立刻静脉施予通常的生理盐水食盐水；lml，在30分钟后静脉施予MSCs1•0X106个细胞）（用新鲜的培养基DMEM使总量成为lml〇[0110]组4rt-PA+MSC;n=38[0111]该组中，再开通后立刻静脉施予rt-PA10mgkg;lml，静脉施予MSCs1.OX106个细胞）（用新鲜的培养基DMEM使总量成为lml。[0112]每天向所有大鼠腹腔内施予环孢菌素A10mgkg。静脉施予全部从左大腿静脉实施。[0113]⑷MRI及梗塞体积的测定[0114]用氯胺酮75mgkg及甲苯噻嗪（10mgkg将大鼠麻醉，拍摄MRI。根据以往报道，使用具备7-Teslar、内径（borediameter为18cm的竖式超导磁体（OxfordMagnetTechnologies的NMR波谱仪UNITY-INOVAOxfordInstruments进行MRI拍摄（HonmaT.等，Exp.Neurol.2006;199:56-66.，KomatsuK•等，BrainRes_2010;1334:84-92.。[0115]在一过性大脑中动脉闭塞60分钟后拍摄DWI-MRI，在闭塞后1、4、7、14、21及28天测定T2WI-MRI。使用ScionImage，VersionBeta4.0_2ScionCorporation由MRI图像计算缺血病变区域。对从大脑采集的连续图像的高信号区域进行分析，确定病变体积mm3。针对各切片，将在DWI-MRI及T2WI-MRI中信号强度比相反侧的脑的损伤高1.25倍的高度损伤部位作为梗塞病变区域，考虑切片厚度1mm而计算梗塞体积。在T2WI-MRI位于低信号区域时对脑出血的存在进行计量。将初始梗塞体积不满足基准的动物从实验中排除。[0116]灌注成像（Perfusion-weightedimaging:PWI使用T2加权（TR=13ms，TE=6.0ms梯度回波序列Gradientechosequence进行测定。PWI测定在从大脑中动脉闭塞的再开通起2小时后实施。在基于PWI的脑血流量CBF图像map中，为了测定血流，选择距前囟Bregma0.4mm的大脑片brainsiice冠状切片。感兴趣区R01:60X60像素设为缺血脑半球的梗塞病变周边区域。R01相对于前囟的相对定位为DWI-MRI:尾侧0.3mm、外侧1.25mm、深度0.1mm。使用PerfusionSolver软件将各R0I中的局部脑血流量rCBF进行定量化。以梗塞脑半球与非梗塞脑半球的比率的形式求arCBF率。[0117]5明胶酶谱法[0118]使用在一过性大脑中动脉闭塞1天后从大鼠中取出的脑组织，实施明胶酶谱法。开通后立刻将脑试样在含有蛋白酶抑制剂的10倍量的溶解缓冲液（l5〇mMNaCl、l%SDS、〇.1%脱氧胆酸及50mMTris-HC1，pH7.5中于冰上进行均质化，在离心力:9000g、15分钟、4°〇的条件下离心后，收集上清液，于-8〇°C保存直至使用。使用ThermoBCAProteinAssayPierce测定总蛋白质浓度，使用明胶酶谱法试剂盒PrimaryCell测定MMP基质金属蛋白酶-9的活性。[0119]⑹运动平板负荷试验[0120]在一过性大脑中动脉闭塞之前，使大鼠在设定为倾斜20°、速度20米分钟的运动平板MuromachiInc.上每周跑动2天、每天跑动20分钟而进行习惯化。在一过性大脑中动脉闭塞后1、4、7、14、21及28天测定大鼠在运动平板上所能行进的最大速度。[0121]⑺统计分析[0122]只要没有特别记载，则所有数据均以平均值土标准偏差来表示，使用JMP统计分析软件JMP10，SASInstituteInc进行统计分析。利用AN0VA和图基事后检验来评价各组的差异。[0123]2.结果[0124]1rt-PA静脉施予后的出血[0125]较之其他三组而言，组2rt-PA+培养基）的急性出血发病率组1=9.5%，组2=50%，组3=3.6%，组4=10%卬0.01，八冊¥六：图28及出血体积组1=0.14±0.011111113;组2=3_20±1.54圓3;组3=0.01±0.01臟3;组4=0.48±0_39圓3，卩0.01，八购¥八：图2〇更高。需要注意的是，组4中，通过施予MSC，rt-PA疗法后的脑出血发病率低于组2发病率减少40%，p0.01，图基事后检验:体积减少2.72mm3，p0.05,图基事后检验）。这表明，通过静脉施予MSC，能够减少脑出血的发病和体积。[0126]⑵明胶酶谱法[0127]利用明胶酶谱法，确认到在同侧的脑中，组4rt-PA+MSC的丽P-9活性低于组2rt-PA+培养基）（p0.01，图基事后检验），组3生理盐水+MSC的MMP-9活性低于组1生理盐水+培养基）（P〇.01，图基事后检验：图3。丽?-9活性的上调up-regulation促进再开通后的出血。这些结果表明，通过静脉施予MSC能够使MMP-9活性降低、抑制出血。[0128]3利用MRI分析得到的缺血病变体积[0129]使用Dffl-MRI，针对4个试验组对缺血病变体积进行了评价。在60分钟第1栏拍摄DWI-MRI，在初始梗塞体积方面并未确认到差异组1=274±33mm3;n=9jJi2=279±27mm3;11=12，组3=267±38臟3;11=11，组4=276±38麵3;11=9，八1^^，？=0.75。在一过性大脑中动脉闭塞后1天第2栏）、4天第3栏）、14天第4栏）、28天第5栏拍摄了T2WI-MRI图4A。[0130]在所有组中，评价的缺血病变体积在一过性大脑中动脉闭塞后28天期间经时性缓缓减少（图4B。在MSC施予组中，在14天、21天、及28天，与施予培养基的组相比，显示出病变体积的大幅减少p0•01，图基事后检验：图4B。与施予rt-PA和培养基的组组2相比，施予了rt-PA和MSC的组组4的缺血病变体积在14天小22%，在21天小22%，在28天小25%。[0131]虽未体现统计意义上的差异，但第4、7、14、21、28天的缺血病变体积的减少在施予rt-PA和MSC的组组4中最大，缺血病变体积在28天期间在施予rt-PA和培养基的组组2最大（图4®。这些结果显示，即使实施了rt-PA疗法，通过施予MSC仍然能够使缺血病变体积减少。[0132]⑷脑血流的分析[0133]为了评价rCBF，通过使用基于PWI的CBF图像，得以对缺血病变部位处的血流动态变化进行进一步的定量分析。在一过性大脑中动脉闭塞的再开通1小时后，rt-PA疗法组间组2和组4的rCBF率、非rt-PA疗法组间（组1和组3的rCBF率分别相似，但rt-PA疗法组的rCBF率比非rt-PA疗法组高约23%图4C。这些结果显示，无论是否在rt-PA疗法后施予MSC，rt-PA疗法组中rCBF率均增加23%p0.01、ANOVA。[0134]⑸行动机能[0135]对大鼠在运动平板上所能行进的最大速度进行记录，结果，在一过性大脑中动脉闭塞前，所有大鼠均达到了70米分钟，但最大速度于闭塞后24小时降低。MSC施予组组3:n=11，组4:n=9在4〜28天期间显示出比非MSC施予组组1:n=9,组2:n=12更高的速度，而组4在7〜28天期间显示出比组3更高的速度。这些结果显示，通过将rt-PA疗法与MSC的静脉施予组合，与单独施予MSC相比，梗塞后的恢复得到了促进图5。[0136]3.讨论[0137]对在一过性大脑中动脉闭塞的急性期联合使用了MSC静脉施予的rt-PA疗法后的脑出血发病率及出血体积进行评价，由此表明，通过MSC的施予能够抑制血管内皮机能不全。在未联合使用MSC的rt-PA疗法组中，脑出血的发病率高、且梗塞体积也大，而通过针对一过性大脑中动脉闭塞后的rt-PA疗法联合使用MSC，能够使脑出血的发病率和梗塞体积这二者显著减少。[0138]rt-PA疗法后的出血的分子机制尚不明确，但在迄今为止的研究中，已知MMP-9参与急性梗塞后的再开通时的血管破坏。[0139]MSC具有保护脑的作用。并且，预测MSC的静脉施予可降低MMP-9的表达、对血管破坏加以防御。在脑梗塞的急性期即使施予了rt-PA，通过施予MSC，仍然能够对脑出血的发病率和梗塞体积这二者进行抑制。MSC的治疗效果与迄今为止的研究结果是一致的，但rt-PA疗法与MSC施予对于缺血梗塞的协同效应、即显著的机能改善和梗塞体积的减少是值得关注的结果。[0140]rt-PA施予组组2及组4中，在再开通2小时后，观察到病变部位的rCBF脑血流）增加。组2中，经过rt-PA施予而观察到rCBF增加，但没有治疗效果。因此，即使单纯改善脑血流也没有治疗效果。但是，与MSC组合后组4，可观察到治疗效果方面的协同效应。该治疗效果比单独施予MSC组3时高。由此，认为rt-PA疗法可通过改善微循环来协同性地提高MSC的治疗效果，对通过MSC实现的运动机能及梗塞病变的改善有所助益。[0141]对于包括脑梗塞在内的多种神经疾病，已在考虑细胞疗法的应用。rt-PA的使用是当前已确立的缺血梗塞数小时内的治疗方法。推测将来在临床中也会向朋丨安，urt-PA疗法的患者施予MSC。本研究结果支持该方案。即，MSC施予可减少由rt—PA导致的脑出血风险。此外，rt-PA疗法可提高MSC的治疗效果。[0142]本实施例中使用的一过性脑缺血模型是通过向脑血管插入栓塞子来诱发脑梗塞的模型，并且，在将血流阻断一定时间以上后，通过抽去物理性去除线从而物理性地使血流再开通。4个组中，组3生理盐水+MSC;n=42中确认到由MSC的施予带来的脑出血抑制效果，这表示，在通过物理性去除血栓而进行的对闭塞血管的再开通疗法中，MSC也具有抑制脑出血的效果。物理性去除有例如基于血管内治疗等的血栓去除、机械性血栓回收疗法、颈动脉内膜剥离术、旁路手术等，而本发明的方法同样也可适用于这些方法。[0143]此外，t-PA包括rt-PA还兼有作为血小板凝集抑制剂、及血液凝固抑制剂的效果，因此，本实施例表明，在利用血小板凝集抑制剂、及血液凝固抑制剂的闭塞血管的再开通中，MSC也具有抑制脑出血的效果。[0144]产业上的可利用性[0145]根据本发明，能够降低与闭塞血管的再开通疗法例如，包含血栓溶解剂、血小板凝^抑制剂、血液凝固抑制剂的药物的施予，血栓的物理性去除）相伴的脑出血风险，并且提尚缺血性血管疾病的治疗效果。本发明对于以脑梗塞、心肌梗塞为代表的缺血性血管疾病的治疗而言是有用的。[0146]本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请均作为参考而直接并入本说明书中。

权利要求：1.缺血性血管疾病的治疗用药物，所述药物含有间充质干细胞，其特征在于，所述药物与对闭塞血管的再开通疗法联合使用。2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，降低与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血风险。3.如权利要求1或2所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括选自下述中的任意一种或两种以上:血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、及血液凝固抑制剂的施予、以及对血栓的物理性去除。4.如权利要求1〜3中任一项所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括血栓溶解剂的施予。5.如权利要求4所述的药物，其中，血栓溶解剂为纤溶酶原激活物。6.如权利要求3〜5中任一项所述的药物，其特征在于，使得血栓溶解剂的可施予时间延长。7.如权利要求1〜6中任一项所述的药物，其中，缺血性血管疾病为缺血性脑血管疾病或心肌梗塞。8.如权利要求1〜6中任一项所述的药物，其中，缺血性血管疾病为超急性期或急性期的缺血性脑血管疾病或急性心肌梗塞。9.如权利要求1〜8中任一项所述的药物，其中，间充质干细胞为来自骨髓的间充质干细胞。10.用于预防与对闭塞血管的再开通疗法相伴的脑出血的药物，所述药物含有间充质干细胞。11.如权利要求1〇所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括选自下述中的任意一种或两种以上:血栓溶解剂、血小板凝集抑制剂、及血液凝固抑制剂的施予、以及对血栓的物理性去除。12.如权利要求10或11所述的药物，其中，对闭塞血管的再开通疗法包括血栓溶解剂的施予。13.如权利要求12所述的药物，其中，血栓溶解剂为纤溶酶原激活物。14.如权利要求11〜13中任一项所述的药物，其特征在于，使得血栓溶解剂的可施予时间延长。15.如权利要求10〜14中任一项所述的药物，其用于缺血性血管疾病的患者。I6•如权利要求15所述的药物，其中，缺血性血管疾病为缺血性脑血管疾病或心肌梗塞。17.如权利要求I5或I6所述的药物，其中，缺血性血管疾病为超急性期或急性期的缺血性脑血管疾病或急性心肌梗塞。18.如权利要求10〜17中任一项所述的药物，其中，间充质干细胞为来自骨髓的间充质干细胞。

百度查询： 北海道公立大学法人札幌医科大学;尼普洛株式会社 脑梗塞的治疗用药物

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