申请/专利权人：长江大学

申请日：2023-10-20

公开（公告）日：2023-12-15

公开（公告）号：CN117233311A

主分类号：G01N30/88

分类号：G01N30/88

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.01.02#实质审查的生效;2023.12.15#公开

摘要：本发明公开了一种基于多组学分析揭示乙酰化修饰在银杏类黄酮生物合成中的重要性的方法，包括如下步骤：1植物材料准备；2代谢样品提取；3RNA提取、Illumina测序和转录组数据分析；4银杏组织的比较蛋白质组学分析；5赖氨酸乙酰组分析；6载体构建与定点突变；7蛋白质印迹分析；8去乙酰化酶抑制剂TSA处理及总黄酮含量的测定。本申请通过对银杏根、茎和叶的转录组、代谢组、蛋白质组和赖氨酸乙酰组的联合分析，阐明Kac修饰对类黄酮生物合成和代谢的影响机制，试图从多组学角度解释乙酰化在类黄酮积累中的作用。为进一步探索植物黄酮类化合物的代谢调控机制和银杏黄酮类化合物产业的发展提供了依据。

主权项：1.一种基于多组学分析揭示乙酰化修饰在银杏类黄酮生物合成中的重要性的方法，其特征在于，包括如下步骤：1植物材料准备：选择的是生长在长江大学植物园四个月大的‘家佛手’银杏幼苗，分别收集银杏幼苗的根、茎、叶，清洗干净后迅速吸干表面水分，然后立即置于液氮中，最后储存于-80℃的冰箱中用于进一步分析；2代谢样品提取：1生物样品放置于冻干机中真空冷冻干燥；2利用研磨仪30Hz研磨1.5min至粉末状；3称取100mg的粉末，溶解于1mL70％甲醇提取液中；4每30min涡旋一次，每次持续30s，共涡旋6次，样本置于4℃冰箱过夜；512000rpm离心10min后，吸取上清，用微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MSMS分析；3RNA提取、Illumina测序和转录组数据分析：1使用RNA-seq的RNA提取试剂盒提取银杏根、茎、叶的总RNA；2委托武汉迈特维尔生物科技有限公司进行cDNA合成、对原始数据进行cDNA文库归一化、第二代测序和组装，Trinity组装的转录序列用作后续分析的参考序列，使用RSEM软件将从IlluminaHiSeq高通量测序平台获得的干净读数映射到参考序列，然后标准化为FPKM作为测量转录物表达水平的指标，以|log2FC|≥1和FDR0.05为标准筛选差异表达基因DEG，并根据GO和COG数据库和KEGG途径进行分析，以获得不同组织间DEG的详细描述；4银杏组织的比较蛋白质组学分析：1蛋白提取：使用液氮将样品研磨至粉末，然后在各组样品中加入粉末4倍体积酚抽提缓冲液超声裂解，加入等体积的Tris-HCl缓冲液pH8.0平衡酚，4℃，5500g离心10min，取上清转移至新的管子中并加入5倍体积的0.1M乙酸铵甲醇混合溶液，混匀后置于-20℃或-80℃环境中过夜沉淀，蛋白沉淀分别用甲醇和丙酮洗涤2-3次，最后沉淀用8M尿素进行复溶，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定；2胰酶酶解：各样品蛋白取等量进行酶解，用裂解液将体积调整至一致，缓慢加入终浓度20％三氯乙酸TCA，涡旋混匀，4℃沉淀2h，4500g，离心5min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2-3次，晾干沉淀后加入终浓度200mM的四乙基溴化铵缓冲溶液TEAB，超声打散沉淀，以胰蛋白酶：蛋白＝1:50的比例加入胰蛋白酶，酶解过夜，加入二硫苏糖醇DTT使其终浓度为5mM，56℃还原30min，之后加入碘乙酰胺IAA使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min；3生物信息学分析：使用Maxquantv.1.6.15.0搜索引擎对照Ginkgo_biloba_3311数据库对所得的MSMS数据进行处理，并通过UniProtwww.uniprot.org.br在Swiss-Prot数据库中进行肽段鉴定。UniProt-GOAhttp:www.ebi.ac.ukGOA、InterProdomainhttp:www.ebi.ac.ukinterpro和KEGG通路数据库用于注释已鉴定蛋白质的GO功能、结构域和蛋白质通路，并对GO功能、KEGG途径和蛋白质结构域进行了功能富集分析，使用WoLFPSORT软件预测所鉴定蛋白质的亚细胞定位；以|log2FoldChange|≥1.5P0.05为标准，鉴定差异表达蛋白DEPs；5赖氨酸乙酰组分析：1蛋白质提取和胰蛋白酶消化的步骤4所述，将肽段溶解在IP缓冲溶液中，转移上清液至提前洗涤好的乙酰化树脂中，放置于4℃环境的旋转摇床上，温和摇晃并过夜孵育；2孵育结束后依次使用IP缓冲溶液洗涤树脂4次，去离子水洗涤2次；3最后使用0.1％三氟乙酸洗脱液，将树脂结合的肽段洗脱下来，共洗脱3次，收集洗脱液并真空冷冻抽干；4抽干后按照C18ZipTips说明书除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析；5二级质谱数据使用Maxquant1.6.15.0进行检索。检索参数设置：数据库为Ginkgo_biloba_331141309条序列，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率FDR，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为TrypsinP；漏切位点数设为4；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；Firstsearch和Mainsearch的一级母离子质量误差容忍度分别设为20.0ppm和20ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为20.0ppm，将半胱氨酸烷基化CarbamidomethylC设置为固定修饰，可变修饰为['AcetylProteinN-term','OxidationM','AcetylK']，定量方法设置为LFQ，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％；6载体构建与定点突变：1利用基因序列合成了C3H、F3’5’H和CCoAOMT的全长编码序列；2通过将AAG改为CAG产生C3HK422Q和F3'5'HK367Q、F3'5'HK392Q的定点突变；将AAA改变为CAA产生CCoAOMT的CCoAOMTK144Q的定点突变，利用突变蛋白以模拟C3H、F3'5'H和CCoAOMT的乙酰化修饰；通过将AAG改为AGG产生C3HK422R和F3'5'HK367R、F3'5'HK392R的定点突变；将AAA改为AGA产生CCOAOMTK144R的定点突变，以模拟C3H、F3'5'H，和CCOAOMT蛋白的去乙酰化修饰；3将野生型和突变型C3H、F3′5′H和CCoAOMTCDS克隆到pET-SUMO载体中，带有NotI和CpoI限制位点；4然后使用0.1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷IPTG作为诱导剂，在大肠杆菌Rosetta菌株中表达重组的C3H-His-SUMOtag、F3'5'H-His-SSUMOtag和CCOAOMT-His-SUMOtag蛋白，并纯化该蛋白用于后续分析；7蛋白质印迹分析：为了检测C3H、F3'5'H和CCoAOMT重组蛋白乙酰化的存在，使用10μL样品的纯化蛋白进行免疫检测；8去乙酰化酶抑制剂处理及总黄酮含量的测定：1以4个月大的银杏幼苗作为研究对象，共选择36株长势一致的独立幼苗进行TSA抑制剂处理；2用30mL处理液喷洒每个幼苗的叶片，每24h处理一次，共处理3次，每个处理有三个生物重复，每个重复处理四棵银杏幼苗；3在第三次处理24h后收集根、茎和叶的组织样本，并用冷蒸馏水冲洗，然后立即将其冷冻在液氮中，并在-80℃的冰箱中储存，用于进一步分析；4采用高效液相色谱法测定黄酮类化合物的含量。

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