申请/专利权人：新乡医学院

申请日：2023-09-11

公开（公告）日：2023-12-22

公开（公告）号：CN117269488A

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N33/535;G01N33/577

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.01.09#实质审查的生效;2023.12.22#公开

摘要：本发明公开了一种阴道毛滴虫双抗体夹心ELISA检测方法，包括制备抗的多克隆抗体，以抗rTvCP39‑2大鼠多抗作为捕获抗体，抗rTvCP39‑1兔多抗作为检测抗体，建立阴道毛滴虫双抗体夹心ELISA检测方法，该检测方法包括以下步骤：捕获抗体包被，封闭，加入抗原，加入检测抗体，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，显色，终止反应，读数。该方法基于ELISA技术，以TvCP39蛋白作为检测阴道毛滴虫的靶抗原，成功建立阴道毛滴虫双抗体夹心ELISA检测方法，该方法灵敏性高，特异性强，且可以直接检测阴道分泌物样本，检测周期短，适合批量检测临床样本中阴道毛滴虫。

主权项：1.一种阴道毛滴虫双抗体夹心ELISA检测方法，包括提取阴道毛滴虫总RNA，反转录获得cDNA，扩增得到目的基因片段TvCP1、TvCP2、TvCP3、TvCP4及TvCP39，其特征在于：克隆TvCP1、TvCP2、TvCP3、TvCP4及TvCP39基因，构建原核表达载体，表达、纯化TvCP1、TvCP2、TvCP3、TvCP4及TvCP39重组蛋白rTvCP1、rTvCP2、rTvCP3、rTvCP4和rTvCP39，免疫大鼠制备抗TvCP1、TvCP2、TvCP3、TvCP4及TvCP39的多克隆抗体，并通过免疫印迹筛选出TvCP39作为免疫检测抗原，将TvCP39分段表达得到TvCP39-1和TvCP39-2重组蛋白，制备抗rTvCP39-1、rTvCP39-2的多克隆抗体，最后以抗rTvCP39-2大鼠多抗作为捕获抗体，抗rTvCP39-1兔多抗作为检测抗体，建立阴道毛滴虫双抗体夹心ELISA检测方法，该检测方法包括以下步骤：S1、捕获抗体包被：将抗rTvCP39-2大鼠多抗用0.01molLPBS稀释至0.58μgmL，按100μL孔加入酶标板，先放入37℃培养箱孵育2h后,再转移至4℃冰箱中包被过夜；S2、封闭：用移液器吸走孔内液体，并在干净纱布上拍干孔内残留液体，每次每孔加入200μLPBS-T缓冲液洗涤3min，重复洗涤3次；加入5％脱脂奶粉作为封闭液，每孔加入200μL，用封板膜进行封板，将酶标板转移至37℃培养箱中封闭2h；S3、加入检测样品：将临床采集的阴道分泌物按每孔100μL加入酶标板中，用封板膜进行封板，将酶标板转移至37℃培养箱中孵育1h；S4、加入检测抗体：按一定比例将抗rTvCP39-1兔多抗稀释至0.45μgmL，按100μL孔加入酶标板中；用封板膜进行封板，将酶标板转移至37℃培养箱中孵育1h；S5、加入辣根过氧化物酶标记的二抗：将山羊抗兔IgG-HRP抗体稀释2000倍，按每孔100μL加入酶标板；用封板膜进行封板，将酶标板转移至37℃培养箱中孵育1h；S6、显色：按100μL孔加入TMB底物溶液，将酶标板转移至37℃培养箱中避光反应15min；S7、终止反应：每孔加入100μL提前配制好的2molLH2SO4溶液，终止显色；S8、读数：用酶标仪在10min内完成读数OD＝450nm。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 新乡医学院 一种阴道毛滴虫双抗体夹心ELISA检测方法

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