申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2023-10-12

公开（公告）日：2024-01-05

公开（公告）号：CN117343896A

主分类号：C12N5/075

分类号：C12N5/075;A01N1/02

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.01.23#实质审查的生效;2024.01.05#公开

摘要：本发明提供一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法。取绵羊卵巢，获卵丘卵母细胞复合体，经体外成熟培养22‑24h得绵羊成熟卵母细胞，分为对照组、新鲜处理组、冷冻组和冷冻处理组，对照组和新鲜处理组依次经孤雌激活和体外胚胎培养，而冷冻组和冷冻处理组须在孤雌激活前经冷冻解冻及恢复培养处理，新鲜或冷冻处理组添加左旋肉碱和甜菜碱，通过此法获得体外胚胎。本发明利用代谢组学挖掘出绵羊卵母细胞到胚胎发育过程中的关键代谢物左旋肉碱和甜菜碱，确认其具有调节氧化应激与渗透压应激功能，添加入体外成熟培养液，解冻液，恢复液，孤雌发育液和体外胚胎培养液中，显著提高冷冻解冻绵羊成熟卵母细胞的体外囊胚发育率。

主权项：1.一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1.获取当日宰杀绵羊卵巢，置入30℃含200IUmL青霉素和200IUmL链霉素生理盐水中，清洗3次后，转入盛有检卵液的100mm培养皿中，划破卵巢表面直径2-5mm的卵泡，显微镜下挑选COCs，经体外成熟培养液洗涤3-5次；步骤2.COCs转入体外成熟培养液中，于5％CO2，95％空气，温度为38.5℃的CO2培养箱内培养22-24h；再将COCs转入含0.1％透明质酸酶的检卵液中，脱去颗粒细胞，挑选成熟卵母细胞，备用；步骤3.挑选一部分备用成熟卵母细胞先转入基础液中平衡5min，后转入冷冻平衡液中停留5min，再将其转移至冷冻保存液中并装载在Cryotop上，投入液氮，时间控制在1min内；步骤4.液氮中取出Cryotop，将含有卵母细胞的一端直接插入解冻液Ⅰ中停留1min，所获卵母细胞转入解冻液Ⅱ中停留5min，后转入解冻液Ⅲ停留3min，最后依次转入基础液停留5min和恢复液培养2h；步骤5.将步骤3中剩余的成熟卵母细胞或步骤4中解冻恢复2h后的成熟卵母细胞转入孤雌激活液的A液中孵育5min，后于体外胚胎培养液洗涤3次，再转入孤雌激活液的B液中，培养箱中孵育2-3h；步骤6.从培养箱中取出激活卵母细胞，于体外胚胎培养液洗涤3次，再转入体外胚胎培养液中培养，此刻记为第0天起始点，分别于第2天和第7天统计卵裂率和囊胚率；步骤7.实验液体的配置：基础液：TCM199+20％FBS；检卵液：TCM199+0.42gLNaHCO3+0.01gL肝素钠+0.05gL青霉素+0.065gL链霉素+1％FBS；体外成熟培养液：TCM199+0.5IUmLFSH+0.5IUmLLH+1μgmLE2+50μgmL庆大霉素+4mmolL丙酮酸钠+50μmolLL-胱氨酸；孤雌激活液：A液:DPBS+0.5μmolLIonomycin+3mgmLBSA；B液：IVC液+2mmolL6-DMAP；体外受精液：SOF+2％EAA+1％NEAA+10μmolL肝素钠+6mgmLBSA；体外胚胎培养液：SOF+2％EAA+1％NEAA+0.48mgmLMyo-inositol+1mmolLL-谷氨酰胺+6mgmLBSA；SOF配方：6.29mgmLNaCl+0.534mgmLKCl+0.162mgmLKH2PO4+0.6μLmL乳酸钠+0.089mgmLMgSO4+2.1mgmLNaHCO3+0.0357mgmL丙酮酸钠+0.299mgmLCaCl2·2H2O；冷冻平衡液，基础液+7.5％DMSO+7.5％EG；冷冻保存液，基础液+15％DMSO+15％EG+0.5molL海藻糖；解冻液：解冻液Ⅰ，基础液+1molL海藻糖；解冻液Ⅱ，基础液+0.5molL海藻糖；解冻液Ⅲ，基础液+0.25molL海藻糖；恢复液：体外胚胎培养液。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 四川农业大学 一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法

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