申请/专利权人：中南民族大学

申请日：2021-05-14

公开（公告）日：2024-02-02

公开（公告）号：CN113549644B

主分类号：C12N15/81

分类号：C12N15/81;C12N15/66;C12N15/62;C12N1/19;A23K10/14;C12R1/19;C12R1/84

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.02#授权;2021.11.26#实质审查的生效;2021.10.26#公开

摘要：本发明公开了一种共展示三种NSP酶的重组酵母及其制备方法和应用，所述重组酵母为以毕赤酵母细胞壁蛋白作为锚定蛋白，将木聚糖酶DSB、葡聚糖酶EGⅡ和果胶酶PG5三种NSP酶共同展示表达在毕赤酵母细胞表面，构建出三种NSP酶细胞表面共展示重组酵母工程菌，制备了三种NSP酶细胞表面共展示型全细胞催化剂，摇瓶发酵时该全细胞催化剂木聚糖酶酶活最高达13236Ug，葡聚糖酶酶活最高达2056Ug，果胶酶酶活最高达3227Ug。三种NSP酶共展示重组酵母工程菌可同时高效展示表达3种NSP酶，实现“一菌多酶”，与游离酶相比具有稳定性好、制备方法简单、易于回收和再生利用、降低生产成本等优势，且三种NSP酶共展示型全细胞催化剂降解处理饲粮原料小麦麸中NSP时，三种酶存在明显的协同促进作用。

主权项：1.一种共展示三种NSP酶的重组酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1经密码子优化后全基因合成三种NSP酶的基因，包括木聚糖酶DSB的基因、葡聚糖酶EGⅡ的基因和果胶酶PG5的基因；所述木聚糖酶DSB的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述葡聚糖酶EGⅡ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述果胶酶PG5的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；2从毕赤酵母X33基因组中PCR扩增获得锚定蛋白的基因，包括GCW61、GCW51和GCW21；所述GCW61的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；所述GCW51的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；所述GCW21的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；3将木聚糖酶DSB的核苷酸序列插入到表达载体的多克隆位点处，再将锚定蛋白GCW61的核苷酸序列也插入到表达载体的多克隆位点处，使木聚糖酶DSB的基因和锚定蛋白GCW61的基因形成融合基因DSB-GCW61，获得以GCW61为锚定蛋白的木聚糖酶DSB细胞表面展示表达重组质粒1；4将葡聚糖酶EGⅡ的核苷酸序列插入到表达载体的多克隆位点处，再将锚定蛋白GCW51的核苷酸序列也插入到表达载体的多克隆位点处，使葡聚糖酶EGⅡ的基因和锚定蛋白GCW51的基因形成融合基因EGⅡ-GCW51，获得以GCW51为锚定蛋白的葡聚糖酶EGⅡ细胞表面展示表达重组质粒2；5将果胶酶PG5的核苷酸序列插入到表达载体的多克隆位点处，再将锚定蛋白GCW21的核苷酸序列也插入到表达载体的多克隆位点处，使果胶酶PG5的基因和锚定蛋白GCW21的基因形成融合基因PG5-GCW21，获得以GCW21为锚定蛋白的果胶酶PG5细胞表面展示表达重组质粒3；6表达载体在启动子的起始位置处含有BglⅡ限制性内切酶位点，在终止子的末端含有BamHⅠ限制性内切酶位点，而BglⅡ和BamHⅠ是同尾酶，将重组质粒2用BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切获得表达盒1，将重组质粒1用BamHⅠ进行单酶切，将表达盒1插入重组质粒1的BamHⅠ位点获得共展示表达木聚糖酶DSB和葡聚糖酶EGⅡ的重组质粒；将重组质粒3用BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切获得表达盒2，将共展示表达木聚糖酶DSB和葡聚糖酶EGⅡ的重组质粒用BamHⅠ进行单酶切，将表达盒2插入共展示表达木聚糖酶DSB和葡聚糖酶EGⅡ的重组质粒的BamHⅠ位点获得共展示表达木聚糖酶DSB、葡聚糖酶EGⅡ和果胶酶PG5的重组质粒；7将共展示表达木聚糖酶DSB、果胶酶PG5和葡聚糖酶EGⅡ的重组质粒电转化至毕赤酵母X33中，得到共展示三种NSP酶的重组酵母。

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权利要求：

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