申请/专利权人：大连工业大学

申请日：2022-02-18

公开（公告）日：2024-02-02

公开（公告）号：CN114717250B

主分类号：C12N15/53

分类号：C12N15/53;C12N15/80;C12N15/67;C12N15/65;C12P19/40;C12N1/15;C12R1/645

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.02#授权;2022.07.26#实质审查的生效;2022.07.08#公开

摘要：本发明公开了一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用。本发明利用根癌农杆菌介导遗传转化技术将过表达葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶编码基因gsdA和或6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA的重组载体导入蛹虫草中，构建蛹虫草重组菌株，强化了胞内NADPH的供应，经液体深层发酵虫草素发酵产量显著提高。过表达gsdA的重组菌株液体发酵第20d虫草素产量达到了191.95mgL，较野生型蛹虫草产量提高150.86％；过表达gndA的重组菌株液体发酵第20d虫草素产量达到了764.48mgL，较野生型蛹虫草产量提高1034.02％。本发明提出的基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌构建重组工程菌株的方法，为高产虫草素的蛹虫草菌株的选育提供了新的方向。

主权项：1.一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法，其特征在于：蛹虫草重组菌株构建方法如下：S1.提取蛹虫草Cordycepsmilitaris的mRNA，逆转录制备cDNA，以cDNA为模板克隆gsdA或gndA基因；基因gsdA具有如SEQIDNO.3所示序列，基因gndA具有如SEQIDNO.4所示序列；S2.将目的基因gsdA或gndA与线性化载体pDHt-SK-BenA连接后，转入大肠杆菌感受态细胞中，经PCR扩增、酶切、基因测序验证筛选转化子，获得含重组载体pDHt-SK-BenA-gsdA或pDHt-SK-BenA-gndA的大肠杆菌；S3.液体培养S2得到的含重组载体的大肠杆菌，提取质粒，将所述重组载体转入根癌农杆菌AGL-1感受态细胞中，利用含50-100μgmL羧苄青霉素及50-100μgmL卡那霉素的YEB固体培养基进行培养并筛选转化子，经PCR扩增、酶切验证后，获得含重组载体pDHt-SK-BenA-gsdA或pDHt-SK-BenA-gndA的根癌农杆菌；S4.将步骤S3得到的含重组载体pDHt-SK-BenA-gsdA或pDHt-SK-BenA-gndA的根癌农杆菌在IM液体培养基中诱导培养后，与蛹虫草菌孢子悬液在IM固体培养基上共培养，同时覆盖含头孢噻肟和苯菌灵的M-100固体培养基，筛选蛹虫草转化子并进一步在含头孢噻肟和苯菌灵的M-100固体培养基上进行二次筛选，经PCR扩增、基因测序验证，得到过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因gsdA或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA的蛹虫草重组菌株；目的基因gsdA或gndA为通过PCR技术以蛹虫草cDNA为模板扩增得到，PCR扩增所用引物对为gsdA-F：5’-ATGATGCACAAGACCATTAAGAACA-3’；gsdA-R：5’-TTACAGCTTGTTGCTAGAGTTGTTGT-3’；gndA-F：5’-ATGTCTGGTCCTGTTGCTCGA-3’；gndA-R：5’-TTAAGCCTGGTAGGTAGAGGCAG-3’；线性化载体为含有苯菌灵抗性基因BenA的表达载体pDHt-SK-BenA，BenA基因序列如SEQIDNO.5所示。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 大连工业大学 一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD