申请/专利权人：吉林大学

申请日：2022-01-31

公开（公告）日：2024-02-20

公开（公告）号：CN114410688B

主分类号：C12N15/867

分类号：C12N15/867;C12N15/113;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.20#授权;2022.05.20#实质审查的生效;2022.04.29#公开

摘要：本发明公开了一种lncRNAPeln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法，方法为：第一步、利用染色质lncRNA原位逆转录测序CLIST‑seq方法筛选与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNA，并验证其在各组织中的表达；第二步、构建lncRNAPeln1过表达质粒并通过慢病毒包装后感染目的细胞；第三步、过表达lncRNAPeln1对三胚层分化的影响：诱导iPSC分化，设三个实验组；第四步、过表达lncRNAPeln1对iPSC‑分化胰岛细胞效率的影响。有益效果：本发明采用过表达lncRNAPeln1的方式，提高了iPSC向内胚层分化的比例；本发明采用过表达lncRNAPeln1的方式,提高了体外定向诱导iPSC向胰岛β样细胞分化的效率，能够提高约38％。为优化或建立iPSC向胰岛β样细胞高效、定向分化方案奠定理论基础，推动诱导干细胞产品治疗糖尿病的临床转化。

主权项：1.一种lncRNAPeln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法，其特征在于：其方法包括如下步骤：第一步、利用染色质lncRNA原位逆转录测序CLIST-seq方法筛选与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNA，并验证其在各组织中的表达，具体步骤如下：步骤一、收集转染了Cas9-Oct4质粒的mFBC并用2%甲醛固定；步骤二、裂解细胞膜，收集细胞核；步骤三、细胞核内RNA逆转录；步骤四、Cas9-gRNA复合体的分离；步骤五、Cas9-gRNA-lncRNA复合物的分离；步骤六、lncRNA的提取；步骤七、样品质量验证；步骤八、文库的建立与扩增；步骤九、lncRNA文库分析及筛选；步骤十、lncRNAPeln1在各组织中的表达；取小鼠肺、大脑、血管、肌肉脾脏、肾脏、肝脏、胰腺、脂肪和心脏器官组织提取RNA，逆转录成cDNA，利用RT-PCR验证lncRNAPeln1在各组织中的表达情况；其中Peln1的核苷酸序列为序列1中第22至606位所示的核苷酸序列；第二步、构建lncRNAPeln1过表达质粒并通过慢病毒包装后感染目的细胞；第三步、过表达lncRNAPeln1对三胚层分化的影响：诱导iPSC分化，设三个实验组，第一组为空白对照，即iPSC；第二组为转入对照质粒，即iPSC+对照质粒；第三组为过表达lncRNAPeln1组，即iPSC+Peln1，在诱导分化前将lncRNAPeln1及对照质粒分别转染至iPSC中然后用拟胚体的方法诱导分化，在诱导分化的第0、2、4、6和8天分别收集细胞，设计引物检测三胚层特异标记物，比较不同组间各胚层标志物表达情况；第四步、过表达lncRNAPeln1对iPSC-分化胰岛细胞效率的影响：利用三部诱导法诱导iPSC向胰岛细胞分化，设三个实验组，第一组为空白对照，第二组为转入对照质粒，第三组为过表达lncRNAPeln1，在诱导分化前将lncRNAPeln1及对照质粒分别在相同的条件下转入iPSC中，然后诱导分化，观察三组的诱导效率及形成胰岛细胞的质量有无差别，利用免疫荧光染色对诱导初期及后期的细胞进行胰岛素及C-肽分泌情况的检测，统计染色阳性细胞数，比较诱导效率。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 吉林大学 一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法

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