申请/专利权人：成都大熊猫繁育研究基地

申请日：2023-12-22

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN117736981A

主分类号：C12N5/0775

分类号：C12N5/0775;C12Q1/02;A01N1/02

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.09#实质审查的生效;2024.03.22#公开

摘要：本发明公开了大熊猫精液冷冻保护添加剂外泌体的制备方法，用于大熊猫精液的添加剂，涉及一种外泌体的制备技术领域，包括外泌体的制备、外泌体浓度筛选和精液冷冻方法，本发明所使用的外泌体是由脐带间充质干细胞培养液分离得到，不用额外采集大熊猫精液提取外泌体，对于大熊猫更加适用，使用的外泌体浓度为50ugmL，为大熊猫精液冷冻保护的最佳浓度，本发明所用到的外泌体，其获取方式为非损伤性的，不会对大熊猫造成伤害，更加符合动物福利的要求，研究的用于大熊猫精液的冷冻保存，可实现大熊猫遗传物质的高效保存。

主权项：1.大熊猫精液冷冻保护添加剂外泌体的制备方法，其特征在于：1外泌体的制备包括以下步骤：S1:用完全培养基培养第4代的大熊猫脐带来源的间充质干细胞uc_MSCs，融合度达80％时，弃去完全培养基，用PBS缓冲液清洗贴壁细胞；S2:加入不含FBS的低糖DMEM，培养48h后收集细胞上清；S3:将收集到的100mL细胞上清进行4℃，300g，离心30min，以去除细胞；再以2000g，离心30min去除细胞碎片；S4：将S3完成的上清液移至新的离心管，然后离心去除较大的囊泡并进行过滤；S5：收集过滤液，再以4℃，100000g，离心70min，去除上清；S6:用10mL预冷的PBS缓冲液重悬后，再次以4℃，100000g，离心70min，去除上清并用150μLPBS重悬得到外泌体，在-80℃冰箱保存备用。2外泌体浓度筛选：S1:精液采集后，取1×108个大熊猫精子，600g离心15min，用1mLINRA96冷冻液重悬后，分为4等份置于4个2mL的离心管中；S2:向每个离心管中添加外泌体，使四个离心管中的外泌体最终浓度分别为：0ugmL，25ugmL，50ugmL，100ugmL，然后放置在4℃保存16h后，进行CASA检测活力。3精液冷冻的方法：先取2×108个大熊猫精子，分为两等份，进行1000rmin离心，实验组用1mLINRA96冷冻液添加50ug外泌体重悬；对照组用1mLINRA96冷冻液重悬。然后用0.25mL细管进行精液灌装并封口，用泡沫盒盛装液氮，并将冷冻架放入泡沫盒中充分预冷。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 成都大熊猫繁育研究基地 大熊猫精液冷冻保护添加剂外泌体的制备方法

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