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申请/专利权人：零下十八度(北京)生物科技有限公司

摘要：本发明涉及到生物技术领域，具体为一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂。本发明通过将胶原蛋白和维生素E进行改性来提高其水溶性和生物活性，且改性胶原蛋白和改性维生素E具有协同促进细胞的增殖，能增强干细胞冰活体的修复和抗衰功效。本发明使用含有干细胞激活剂的培养基不仅能够激活间充质干细胞的活力潜能，释放高浓度的干细胞因子，而且细胞因子还含有集落刺激因子和其他重要的刺激因子，刺激了细胞持续不断的分泌细胞因子。此外，本发明使用半量换液的方法培养间充质干细胞，与传统培养法相比，可以提高细胞因子的浓度和表达量，干细胞因子群的促迁移效果也会明显增强。

主权项：1.一种修复抗衰老的干细胞因子群冰活制剂的制备方法，其特征在于：用含有改性维生素E和改性胶原蛋白的培养基培养间充质干细胞；其中，改性维生素E的结构式：；所述改性胶原蛋白的制备方法：将胶原蛋白与壳聚糖结合置于烧杯中，再加入甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70～80℃进行水浴加热30～40min，得到改性胶原蛋白；具体步骤为：S1、选取种子活细胞；S2、改性胶原蛋白：将100～110g胶原蛋白与60～70g壳聚糖结合置于烧杯中，再加入2.5～3.0g甘油，将烧杯放置于水浴锅中以70～80℃进行水浴加热30～40min，得到改性胶原蛋白；S3、改性维生素E：将100.4～112.4g海藻酸、20.1～20.3g氧化锌和0.5～1.0L去离子水加入反应器中，开搅拌，温度升至140～150℃后缓慢加入120.1～122.2g维生素E，维持温度在140～150℃反应5-7h后，每隔30min，取样测pH值，直至pH值在2~2.5不再变化，反应结束，过滤，得粗品待用，取50～100ml75%的无水乙醇于烧杯中，在水浴锅中水浴加热至70-75℃后取出，将粗品置于其中，搅拌至完全溶解后，在液氮恒温器里降温，降温速率10℃h，降至0℃，继续养晶3-4h，过滤，收集滤饼，干燥1-2h，得到改性维生素E；S4、绞股蓝生物活性物质的制备：精选优质绞股蓝，清洗3-4次后，置冷冻干燥机中进行冷冻干燥24～26h，将冻干的绞股蓝立即转移至-75～-85℃的超低温环境中10～12h，使其硬化变脆，将脆化后的绞股蓝先后经-60～-85℃的超低温微米级与纳米级研磨制粉，取10～15g绞股蓝纳米粉置于30～100ml的去离子水中，于35～37℃进行超声波抽提2～3h，超声频率为30～50Hz；对超声波处理后的溶液进行离心，离心转速为1000～3000rmin，收集上清液，在-10～-18℃的低温下冷凝干燥30～60min，获得绞股蓝高活性萃取物；S5、制备干细胞激活剂：取50～100g盐酸吡格列酮、20～100g步骤S2制备所得的改性胶原蛋白、20～100g步骤S3制备所得的改性维生素E、100～150g二甲基亚砜、5～10g步骤S4制备所得的绞股蓝高活性萃取物，1～5mg基质细胞衍生因子-1、140～100mg胰岛素样生长因子-1、pH＝7.0-7.2的磷酸盐缓冲液30～100ml于烧杯中，搅拌至完全溶解，获得干细胞激活剂待用；S6、制备含有干细胞激活剂的培养基：在MEM-α培养基中加入步骤S5制备所得的干细胞激活剂，确保干细胞激活剂的体积浓度为1％；S7、半量换液法培养间充质干细胞获得干细胞因子群：将步骤S1甄选的优质间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的MEM-α培养基中，培养至80％的融合度后，将培养液转移至离心机中以1000~3000rmin的转速离心8~16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，然后将间充质干细胞置于步骤S6制备所得的培养基中培养24～48h后转移培养液至离心机中以1000~3000rmin的转速离心8~16min，收集沉降的细胞，弃去培养基，取30～100mlpH＝7.0-7.2磷酸缓冲液清洗间充质干细胞，向间充质干细胞中加入60～100ml复方电解质溶液，培养24～48h，按半量体积收集培养上清液，然后再加入半量体积复方电解质溶液，培养24～48h，按半量体积收集培养上清液，重复半量加液和半量收集4～8次，将收集的培养上清液过滤浓缩至原体积的80%，纯化、除菌，获得干细胞因子群；S8、将步骤S7获得的干细胞因子群采用萃取分离技术，在-196℃条件下，去除已经失活的细胞，得到活细胞冰活体，然后在-18℃下冻存。

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