申请/专利权人：中国科学院亚热带农业生态研究所

申请日：2023-12-12

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN117821294A

主分类号：C12N1/20

分类号：C12N1/20;C12N1/04;C12R1/41

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.23#实质审查的生效;2024.04.05#公开

摘要：本发明公开了一种具有固氮且耐寒耐旱性能的根瘤内生菌分离、筛选及培养方法，包括：找寻长势良好的典型豆科植物；配置培养基；根瘤采集及处理；菌株的分离与纯化；菌株的生理生化测定以及菌株保存；依次进行菌株固氮能力检测、菌株的固氮酶活性测定、菌株耐寒性检测以及菌株耐旱性检测；菌株回接验证：将菌株与大豆种子在温室内进行回接，以不接种菌处理为对照，验证菌株的固氮、耐寒以及耐旱性能。本发明能筛选出具有抗旱抗寒且具有固氮特性的根际有益细菌，运用到实践中能帮助大豆植株渡过在幼苗时期遭遇温度骤降，干旱等逆境，能显著增加生物量和产量等。

主权项：1.一种具有固氮且耐寒耐旱性能的根瘤内生菌分离、筛选及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1找寻长势良好的典型豆科植物；2配置培养基：培养基包括YMA固体培养基、LB液体培养基、YMA液体培养基、无氮源液体培养基、固氮培养基；3根瘤采集及处理：每种结瘤植物随机选取多株，用剪刀剪下根瘤，装入离心管中，编号记录；用流水冲洗干净去除表面泥沙后，吸取根瘤表面的水分，置于冰箱保存；自来水冲洗后挑选饱满的根瘤，灭菌处理；4菌株的分离与纯化：在超净台内，将表面灭过菌的根瘤用无菌镊子夹破，将根瘤挤出液在YMA固体培养基上划线，恒温培养，待细菌长出后，在无菌环境下挑取单一菌落进行革兰氏染色镜检；5菌株的生理生化测定：参照《常见细菌系统鉴定手册》测定分离菌株的生理生化；6菌株保存：将菌液接种于LB液体培养基培养，期间每隔12h测定菌液D600值及相对应的pH值，重复三次；将所得菌液用移液枪转移至装有20％灭菌甘油的冷冻保存管中，摇晃均匀后放置于实验室超低温冰箱-80℃冷冻保存；7菌株固氮能力检测：将冷冻保存的纯化菌株解冻，接种至LB液体培养基培养，然后转移至YMA固体培养基上再进行复活和纯化，重复三次；将活化后的菌株分别接种在YMA固体培养基和固氮培养基上，每个菌株各做三次重复，观察不同培养基上的同种菌株的生长情况，筛选出的具有固氮能力的菌株；8菌株的固氮酶活性测定：把具有固氮能力的菌株接种到无氮源液体培养基中培养，测定OD600，取10ml注入100ml培养瓶中，盖上橡胶塞，往瓶中抽出10％的空气，然后往瓶中打入同等体积的乙炔气体，恒温培养结束后，抽取瓶中30ml气体至顶空瓶中，使用带有火焰离子化检测器的气相色谱仪进行乙烯气体浓度测定，筛选出具有较好固氮酶活性的菌株；9菌株耐寒性检测：将活化成功的菌株进行培养，使用LB液体培养基进行培养，设置好相对应的培养箱温度，比较不同温度下各个菌株的生长情况即OD600值的下降幅度，筛选出具有较好耐寒性的菌株；10菌株耐旱性检测：评估菌株在不同PEG6000渗透势下的OD600值变化情况，筛选出具有较好耐旱性的菌株；11菌株回接验证：将菌株与大豆种子在温室内进行回接，以不接种菌处理为对照，验证菌株的固氮、耐寒以及耐旱性能。

全文数据：

权利要求：

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