申请/专利权人：中国人民解放军海军军医大学第一附属医院

申请日：2019-08-15

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN110384705B

主分类号：A61K31/56

分类号：A61K31/56;A61K45/06;A61P3/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2023.10.17#著录事项变更;2020.09.04#实质审查的生效;2019.10.29#公开

摘要：本发明公开了山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物中的应用，体内实验和体外实验表明，五环三萜类化合物山楂酸或其衍生物，或其天然、合成或半合成的含山楂酸的混合物或者含有所述酸的组合物对于2型糖尿病胰岛β细胞损伤具有明显的治疗作用，其作用机制为山楂酸依赖于AMPKmTOR通路调控的自噬，可用于制备预防、治疗、辅助治疗2型糖尿病不伴或伴有胰岛β细胞损伤的药物。本发明山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物中的用途归功于山楂酸或其衍生物通过依赖于AMPK‑mTOR通路调控的胰岛细胞自噬的作用机制，且该新的作用机制从未被报道过，与山楂酸现有药物用途的作用机制也完全不同。

主权项：1.山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物中的应用，其特征在于，所述的山楂酸用于制备激活胰岛β细胞自噬药物；所述山楂酸通过AMPK-mTOR通路进行调控。

全文数据：山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛细胞损伤药物中的应用技术领域本发明涉及药物的新适应症技术领域，具体地说，是山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛细胞损伤药物中的应用。背景技术糖尿病DiabetesMellitus，DM是一种严重危害人类健康的常见内分泌代谢性疾病，全球DM患病率呈上升趋势，IDF最新研究显示目前全球有4.25亿糖尿病患者。2013年我国成人2型糖尿病Type2DiabetesMellitus，T2DM患病率为10.4％。T2DM的发病主要与胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗相关，胰岛β细胞凋亡和功能障碍是造成胰岛素分泌不足的重要原因，保护胰岛β细胞，改善β细胞功能是目前T2DM研究的重点和热点。T2DM患者胰岛β细胞数量减少有多种因素，包括糖脂毒性和淀粉样蛋白在胰腺的沉积，通过氧化应激和内质网应激引起胰岛β细胞凋亡。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是一种高度保守的机体自我保护机制，在生物合成、细胞发育、机体稳定、组织重塑和疾病发生中起着重要作用，与T2DM、肿瘤、神经退行性疾病等有关。近年研究表明，自噬受到糖、脂毒性及炎性因子的影响，细胞自噬失调可导致胰岛素分泌降低，自噬和胰岛β细胞的关系越来越受到关注和重视。自噬的发生过程有多种基因参与，这些基因称为自噬相关基因Atg，Atg的编码蛋白参与了自噬的诱导、产生、成熟和再循环。Atg8在哺乳动物称为LC3，自噬启动后，LC3转位到自噬体膜即LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于前自噬体和自噬体，是自噬体的标志分子。同时，自噬的激活还受到一些信号途径的调控，目前关注较多的是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mammaliantargetofrapamycin，mTOR信号通路。mTOR作为氨基酸aminoacid、腺苷三磷酸adenosinetriphosphate，ATP、生长因子growthfactor、胰岛素等的感受器，对细胞生长具有重要的调节作用。mTOR和自噬相互制约，相互影响，形成负反馈调节回路，使细胞处于合成代谢与分解代谢的稳态。mTOR上游的磷酸腺苷活化蛋白激酶adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK是一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶。AMPK激活目前被认为能抑制mTOR的活性，从而激活自噬。中医学认为，在T2DM的漫长病史中，每有瘀血阻络贯穿其中，所谓“久病入络”，“久病必瘀”，络瘀、脉瘀是T2DM并发症的一条病机主线，络瘀贯穿消渴的全过程。在中医血瘀理论的指导下，具有活血化瘀作用的中药复方及单药有效成分对T2DM及其并发症的干预研究也越来越受到重视。作为药食同源的植物，山楂Hawthorn，蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBgevarmajorN.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果实其味酸、甘，性微温，归脾、胃、肝经，具有活血化瘀、消食化积的功效，被用于血脂异常、高血压病、冠心病及2型糖尿病的治疗。山楂其化学成分主要有黄酮类化合物和三萜酸类化合物两大类，之前其有效降糖成分的研究多集中在黄酮类化合物，三萜类化合物较少。其中所含的三萜类化合物山楂酸maslinicacid，MA，别名：2alpha,3beta-2,3-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸，马斯里酸，2a-羟基齐墩果酸。其分子式为C30H48O4，相对分子量为472.7，结构式如图1所示。山楂酸主要来源于山楂、红枣、橄榄、石榴、鼠尾草和枇杷叶等。迄今，已有许多专利涉及山楂酸的医药用途，如抗肿瘤，皮肤外用脱色，增强胰岛素敏感性，抗炎、抗HIV、抗菌和抗氧化，治疗和COX-2环氧化酶-2活化作用有关的病变等，可用于肿瘤、皮肤病、糖尿病防治、肥胖及心血管疾病等。其主要的作用机制包括诱导细胞凋亡，抑制糖原磷酸化酶和丝氨酸蛋白酶，影响COX-2表达，抑制CYP2E1、NF-κB和MAPK通路；使半胱天冬酶的表达激活正常化，提高Bcl-2Bax值，减少细胞凋亡。药理研究发现MA对糖原磷酸化酶glycogenphosphorylase，GP有中等强度的抑制作用，而GP是将糖原降解成葡萄糖的关键酶，在调节糖原代谢中具有关键作用。另有研究发现每天以10mgkg或30mgkg剂量的MA对自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠进行灌胃，连续2周后发现小鼠空腹血清血糖、血清胰岛素水平均降低。刘军等又进一步探讨了山楂酸抗糖尿病的分子机制，发现MA可诱导胰岛素受体β亚基Insulinreceptor，IRβ，丝苏氨酸激酶serine-threoninekinase，AKT，糖原合成酶激酶-3GlycogenSynthaseKinase3，GSK3β磷酸化和抑制GP水平而降低血糖，但是对于山楂酸对胰岛β细胞的保护作用和机制，并未提及。本发明山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物中的用途归功于山楂酸或其衍生物通过依赖于AMPK-mTOR通路调控的胰岛β细胞自噬的作用机制，且该新的作用机制从未被报道过，与山楂酸现有药物用途的作用机制也完全不同。发明内容本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物的新用途。本发明的第二个目的是，提供一种治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤的药物。为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：山楂酸或其衍生物在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物中的应用。作为本发明的一个优选技术方案，所述山楂酸或其衍生物在制备激活胰岛β细胞自噬药物中的应用。作为本发明的一个优选技术方案，所述山楂酸或其衍生物在制备调控AMPK-mTOR通路药物中的应用。进一步地，所述山楂酸或其衍生物作为药物的唯一活性成分或与其他治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物共同作为活性成分。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤的药物，所述药物的主要活性成分为治疗有效量的山楂酸或其衍生物。作为本发明的一个优选技术方案，所述药物还包括与山楂酸同时施用后对治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤有积极作用的药物成分和或使山楂酸稳定性提高的药学上可接受的成分。作为本发明的一个优选技术方案，所述药物还包括药学上可接受的载体。作为本发明的一个优选技术方案，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的山楂酸或其衍生物和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。更优选地，所述的药学上可接受的载体包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂。作为本发明的一个优选技术方案，所述的药物为口服制剂，包括片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸或口服液体。“药学上可接受”是指并非在生物学上或其它方面实质上不希望的物质，即可将所述物质给药于个体，而不会导致任何实质上不希望的生物影响或以有害的方式与包含这种物质的组合物的任何组分相互作用。“载体”也被称为“赋形剂”，包括药剂学中的任何常用赋形剂，并应基于相容性和希望的剂型的释放分布性质来选择。示例性载体物质包括，例如，乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂等。“药学上接受的载体”可包括，例如，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、糊精-麦芽糖复合剂、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。可采用本领域公知的方法，将所述药物组合物制备成为口服制剂，如片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸或口服液体等。在得知本发明的山楂酸的治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤效果以后，本领域技术人员可采用多种常规方法来将其他含有山楂酸的原料加工成合成或半合成的含山楂酸的混合物或者含有山楂酸的组合物。所述的加工包括但不限于：粉碎、水提取、有机溶剂提取等。更具体的，所述的加工例如包括步骤：称取、粉碎、煎煮等。体外实验表明，MA可以显著取消FFA对INS-1细胞活性的抑制，减少FFA诱导的INS-1细胞凋亡，以30uM浓度效果最强；此外，MA能显著增加INS-1细胞的自噬小体数量，尤其是自噬溶酶体的数量，促进INS-1细胞的自噬流水平；同时发现，MA能显著激活AMPK磷酸化水平，抑制mTOR磷酸化水平，进一步应用AMPK抑制剂compoundC和siRNA基因敲除后AMPKα，证实了MA激活的INS-1细胞自噬水平，部分依赖于AMPK-mTOR通路调控；为了进一步验证，应用自噬抑制剂3-MA对自噬进行干预，发现3-MA显著加重FFA诱导的INS-1细胞凋亡水平，并且3-MA可以完全取消山楂酸对INS-1细胞凋亡的抑制作用。体内实验证明，MA7mgkg、21mgkg剂量对2型糖尿病GK大鼠模型具有明显的治疗作用，更重要的是，山楂酸副作用小，无肝、肾毒性，具有无可比拟的安全性。综上，山楂酸是可以用于制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤的药物，且通过部分依赖AMPK-mTOR途径激活胰岛细胞自噬而实现这一保护作用，具有良好的开发前景。附图说明图1是山楂酸结构式。图2是不同浓度MA对胰岛细胞的影响；其中，A为CCK8检测INS-1细胞活性，B为AnnexinVPI流式检测INS-1细胞凋亡水平。图3是30μMMA与0.5mMMET对胰岛细胞的影响的对比；其中，A为CCK8法检测INS-1细胞活性，B为AnnexinVPI流式检测INS-1细胞凋亡水平，C为TUNEL法检测INS-1细胞凋亡水平。图4是山楂酸对胰岛β细胞自噬的激活作用；其中，A为Ad-GFP-RFP-LC3b病毒感染INS-1细胞后细胞自噬检测，B为WB检测自噬相关基因LC3II、P62和Beclin1蛋白的表达。图5是山楂酸对AMPK-mTOR信号通路的影响；其中，A为westernblot检测AMPK和mTOR蛋白磷酸化水平，B为应用AMPK特异性抑制剂CompoundC检测胰岛细胞自噬水平，C为应用AMPK特异性抑制剂CompoundC检测AMPK和mTOR蛋白磷酸化水平。图6是siRNA基因敲除AMPKα后山楂酸对AMPK-mTOR信号通路的影响；其中，A为siRNA基因敲除检测胰岛细胞自噬水平，B为siRNA基因敲除检测AMPKmTOR蛋白磷酸化水平。图7是自噬抑制剂对山楂酸保护胰岛β细胞的影响；其中，A为应用自噬抑制剂3-MA，CCK-8法检测细各组细胞活性，B为应用自噬抑制剂3-MA，Annexin-VPI流式细胞术，C为应用自噬抑制剂3-MA，TUNEL法检测细胞凋亡情况。图8是2W大鼠OGTT及AUC和4W大鼠OGTT及AUC。图9是2W大鼠ITT及AUC和4W大鼠OGTT及AUC。图10为光镜下胰岛细胞病理形态学和免疫组化检测LC-3II水平。图11是透射电子显微镜下GK大鼠胰腺细胞超微结构。图12是ELISA检测血清细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6表达。图13是WesternBlot检测组织LC-3II，phos-AMPK，AMPK，pmTOR，mTOR蛋白的水平。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物片剂的制备取山楂酸2份，加入淀粉8份，微晶纤维素2份，硬脂酸镁0.2份，混合均匀，加水溶解，将溶液浓缩至相对密度为1.12～1.1660℃的流浸膏；将上述流浸膏一步制粒，压片，包薄膜衣即得。实施例2治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物胶囊的制备取山楂酸2份，加入淀粉8份，微晶纤维素2份，硬脂酸镁0.2份，混合均匀，加水溶解，将溶液浓缩至相对密度为1.12～1.1660℃的流浸膏；将上述流浸膏一步制粒，装胶囊即得。实施例3治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物合剂口服液糖浆剂的制备取山楂酸2份，加入淀粉8份，微晶纤维素2份，硬脂酸镁0.2份，混合均匀，加水溶解，将溶液浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料，制成合剂、口服液或糖浆剂。实施例4山楂酸对胰岛β细胞保护作用的体外研究1材料与方法1.1实验细胞胰岛β细胞瘤细胞系INS-1细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。1.2实验药物及主要试剂山楂酸98％纯度购自上海莫奇公司，细胞培养试剂RPMI-1640培养基、DMEM培养基、二甲基亚砜DMSO溶液均购自Sigma公司，丙酮酸钠、2-巯基乙醇、0.25％胰蛋白酶Trypsin货号：25200056购自于美国ThermoFisher公司，CCK8试剂盒货号：CK04购自于日本东仁化学公司，AnnexinVPI细胞凋亡检测试剂盒货号：640914购自于美国Biolegend公司，RocheInsitucelldeathdetectionkit-POD法试剂盒、LipofectamineRNAiMax货号：13778-150、抗体LC-3II、Phos-AMPK、AMPK、Phos-mTOR、mTOR购自CST公司，Anti-Rabbit购自Sigma公司、HRP-GAPDH购自康成生物公司。1.3实验仪器台式水平离心机Eppendorf，5810R德国、Nanopure超纯水仪日本SANYO公司、低温高速离心机ThermoForma公司、图像分析软件QuantityOne美国bio-rad公司、荧光共聚焦显微镜等。1.4实验方法及分组细胞培养：胰岛β细胞瘤细胞系INS-1细胞在RPMI-1640培养基，加10％的新生牛血清中培养。培养条件：37℃，5％CO2。所有操作均按常规体外培养方法培养INS-1细胞。2.检测指标及结果2.1山楂酸对胰岛β细胞的保护作用2.1.1CCK8法检测胰岛细胞活性以游离脂肪酸FFA100mM，0h、6h、12h、24h诱导胰岛细胞凋亡，CCK8检测MA不同梯度处理对FFA诱导下INS-1细胞活性的影响。结果提示图2A，FFA处理可以显著抑制INS-1细胞活性，凋亡率随着时间延长而增加，10μM和30μM的MA可显著降低FFA对INS-1细胞活性的抑制P0.05，100μM的MA处理对FFA刺激下INS-1细胞活性无显著影响。2.1.2AnnexinVPI流式检测胰岛细胞凋亡水平AnnexinVPI流式检测MA浓度梯度处理对FFA刺激下INS-1细胞凋亡水平的影响，结果提示图2B，10μM和30μM的MA可以显著降低FFA诱导的INS-1细胞凋亡水平P0.05，100μM的MA对此无明显影响。2.1.3CCK8检测最佳浓度山楂酸处理胰岛细胞活性进一步评估最佳浓度30μMMA或者0.5mM二甲双胍MET处理对FFA刺激下INS-1细胞的活性。结果提示图3AMA和MET单独处理，对INS-1细胞活性无显著影响，但是经FFA诱导，MA对INS-1细胞的活性保护作用与0.5mMMET类似，与对照组相比均具有统计学意义P0.05。2.1.4AnnexinVPI流式和TUNEL实验评估最佳浓度山楂酸处理胰岛凋亡水平30μMMA或者0.5mMMET药物干预细胞，观察FFA刺激下INS-1细胞凋亡水平影响。结果提示图3B、C，MA和MET单独处理，对INS-1细胞凋亡水平无显著影响，但是经FFA处理，30μMMA对INS-1细胞凋亡的抑制作用与0.5mMMET类似，与对照组相比均具有统计学意义P0.05。2.2山楂酸对胰岛β细胞自噬的激活作用Ad-GFP-RFP-LC3b病毒感染INS-1细胞。每皿加入20μl滴度为1012pfuml的腺病毒Ad-GFP-RFP-LC3b，感染48小时，观察细胞荧光表达情况。6小时感染GFP-RFP-LC3II细胞自噬流指示腺病毒，经过MA或者MET处理之后，激光共聚焦荧光显微镜检测RFP-LC3II和GFP-LC3II的点，计算INS-1细胞中自噬小体和自噬溶酶体的比例，分析细胞自噬流水平。结果提示图4A，MA和MET处理，均能显著升高INS-1细胞的自噬小体数量，尤其是自噬溶酶体的数量，说明MA和MET处理可以显著促进INS-1细胞自噬流水平，与对照组相比，两组均具有统计学意义P0.05。WB检测自噬相关基因LC3II、P62和Beclin1蛋白的表达图4B。结果提示，MA和MET均能显著升高LC3II和Beclin1的含量，降低P62的含量，同样说明MA和MET处理可以显著促进INS-1细胞自噬流的水平，与对照组相比，两组均具有统计学意义P0.05。2.3山楂酸对AMPKmTOR途径的影响提前36小时感染GFP-RFP-LC3II细胞自噬流指示腺病毒，经过MA或者MET处理之后，WB检测AMPK和mTOR信号通路的激活情况。结果提示图5A，MA和MET处理均能显著激活AMPK磷酸化水平，抑制mTOR磷酸化水平，差异具有统计学意义P0.05，进一步提示AMPK-mTOR信号通路可能参与MAMET对INS-1细胞自噬的调控。为了进一步证明AMPK-mTOR信号通路在MAMET对INS-1细胞自噬的调控的作用。使用了AMPK的特异性抑制剂CompoundC，激光共聚焦结果发现图5B，MA和MET处理仍然能够显著升高INS-1细胞的自噬流水平，但是升高幅度明显低于未使用CompundC组。WB结果发现图5CCompoundC完全取消MA和MET对AMPK磷酸化水平的激活作用，部分取消了对mTOR磷酸化水平的抑制作用，并且完全取消MA和MET对自噬指标LC3II，P62和Beclin1表达的影响。2.4siRNA基因敲除AMPKα后山楂酸对AMPKmTOR途径的影响为了进一步验证AMPK-mTOR信号通路在MAMET对INS-1细胞自噬的调控的作用。使用AMPK的特异性siRNA，激光共聚焦结果发现图6A，MA和MET处理仍然能够显著升高INS-1细胞的自噬流水平，但是升高幅度同样明显低于AMPK正常组。WB结果发现图6BAMPK干扰后，完全显著抑制AMPK磷酸化水平和总蛋白水平，同样部分取消对mTOR磷酸化水平的抑制作用，以及完全取消MA和MET对自噬指标LC3II，P62和Beclin1表达的影响。图5和图6应用AMPK抑制剂和siRNA基因敲除后结果提示，MA和MET激活的INS-1细胞自噬水平，部分依赖于AMPK-mTOR通路调控的自噬，可能还有其他机制参与，比如PINK1Parkin1调控的线粒体自噬。2.5自噬抑制剂对山楂酸保护胰岛β细胞的影响为进一步说明MA和MET诱导的自噬对INS-1细胞活性的影响，应用自噬特异性抑制剂3-MA，阻断自噬体与溶酶体的融合，对自噬进行干预。CCK8法检测细胞活性，结果提示3-MA和LP单独处理对INS-1细胞活性无显著影响，3-MA可以进一步加重FFA对INS-1细胞活性的抑制，并且3-MA可以完全取消MA对INS-1细胞活性的保护作用图7A。应用自噬特异性抑制剂3-MA，阻断自噬体与溶酶体的融合，Annexin-VPI流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡情况，结果提示图7B、C，3-MA和LP单独处理对INS-1细胞凋亡水平无显著影响，但是3-MA可以进一步显著加重FFA对INS-1细胞凋亡的激活，并且3-MA可以完全取消MA对INS-1细胞凋亡的抑制作用。这部分结果提示，自噬不仅参与了MA对INS-1细胞的保护作用，并且对于FFA诱导导致的INS-1细胞损伤具有重要作用，本底水平的自噬可以一定程度限制FFA诱导INS-1细胞损伤，如果自噬被完全抑制，FFA对INS-1细胞的损伤将进一步放大。实施例4山楂酸对自发性2型糖尿病GK大鼠胰岛细胞的治疗作用选用自发性2型糖尿病GK大鼠模型，并对模型成功者进行低、高剂量的山楂酸药物干预。于0、2W、4W进行葡萄糖耐量OGTT，胰岛素耐量测定ITT，光镜及电镜下观察胰岛细胞形态，ELISA法测定血清TNF-a、IL-6、IL-1β水平，WesternBlot检测组织中LC-3II，phos-AMPK，AMPK，pmTOR，mTOR蛋白水平，采用统计软件SPSS21.0进行分析，以明确山楂酸对自发性2型糖尿病GK大鼠胰岛细胞的治疗作用及可能的作用机制。1.材料1.1实验动物8周龄的SPF级GK雄性大鼠20只，8周龄的SPF级Wister雄性大鼠5只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SYXK沪2017-0008，饲养于第二军医大学动物中心。25℃恒温50％-70％湿度，SPF级饲养，每日12h光照维持，昼夜循环，自由进水进食。1.2实验用药及主要试剂山楂酸购自上海久知化学品有限公司纯度为95％，盐酸二甲双胍购自中美史克制药有限公司4mg片。ELISA试剂盒购自于苏州礼博公司，蛋白裂解液购自碧云天公司中国，货号：P0013C，RIPA裂解液中蛋白定量液购自碧云天公司中国，货号：P0006，抗体LC-3II、Phos-AMPK、AMPK、Phos-mTOR、mTOR购自CST公司，Anti-Rabbit购自Sigma公司、HRP-GAPDH购自康成生物公司。1.3实验仪器台式水平离心机Eppendorf，5810R德国、Nanopure超纯水仪日本SANYO公司、低温高速离心机ThermoForma公司、图像分析软件QuantityOne美国bio-rad公司、HitachiTEMsystem透射电子显微镜等。1.4实验方法1.4.1实验分组8周龄GK大鼠雄性20只，按体质量由小到大编号，分配随机数，根据随机数随机分为5组，分别为模型对照组、山楂酸低剂量组、山楂酸高剂量组、盐酸二甲双胍组；另取Wister雄性大鼠作为正常对照组，每组5只。适应性喂养1周，9周龄开始，GK大鼠喂饲GK饲料，保持模型稳定，Wister雄性大鼠喂饲普通饲料。1.4.2药物干预山楂酸溶解在CMC-NA中，配成混悬液，灌胃给药4周。其中正常对照组以1.5mLCMC-NA灌胃，低剂量山楂酸MA组以1.5mL山楂酸7mgkg·d灌胃，高剂量山楂酸MA组以1.5mL山楂酸21mgkg·d灌胃，盐酸二甲双胍Met组按1.5mL200mgkg·d剂量灌胃给药。2观察指标及结果2.1一般情况正常对照组wistar大鼠精神状态良好，反应灵敏，动作自如，皮毛有光泽，体质量稳定上升；模型组大鼠随周龄的增长逐渐出现精神萎靡，反应迟钝，皮毛失去光泽等表现，进食量、饮水量均有所增加，尿量增加明显；各药物干预组亦有类似模型组的表现，程度较轻。实验全程，无死亡大鼠，纳入统计的共25只大鼠。2.2大鼠体重分别于药物干预前，药物干预后1周、2周、3周、4周测定体重，称取体重前禁食不禁水12h，根据统计数据得出，各组大鼠体重差异无统计学意义。2.3葡萄糖耐量试验OGTT结果和葡萄糖曲线下面积实验前一天晚上6点禁食，第二天上午八点行OGTT，尾尖测0点空腹血糖，体重，根据体重灌胃葡萄糖，给糖剂量：1.5gkg。之后分别测15min、30min、60min、120min血糖。采用近似梯形的计算公式计算曲线下面积AUC。给药2周，15、30、60min、120min各组血糖比较无明显差异，山楂酸高剂量组、二甲双胍组在0min与GK组相比明显下降，差异具有统计学意义。给药4周，15、30、60、120min各组血糖比较无明显差异，山楂酸高剂量组和二甲双胍组在0min与GK组相比明显下降，差异具有统计学意义图8，P0.05。2.4胰岛素耐量测定ITT结果和曲线下面积实验当天8点禁食，下午2点尾尖采血测0点空腹血糖，腹腔注射胰岛素，浓度0.75Ukg，分别于30min、60min、90min、120min测定血糖。采用近似梯形的计算公式计算曲线下面积AUC。给药2周，30、60min、120min各组血糖比较无明显差异，山楂酸高剂量组在0min与GK组相比明显下降，差异具有统计学意义。给药4周，山楂酸高剂量组在0、60、90min与GK组相比明显下降，差异具有统计学意义图9，P0.05。2.5光镜下胰岛细胞病理形态学观察、免疫组化检测胰腺组织LC-3II水平Wistar大鼠胰岛结构完整，形态规则。GK组纤维组织破坏并萎缩，失去正常结构，腺泡与胰岛散在交错。山楂酸低、高剂量及二甲双胍组，胰岛结构改善。LC3组化结果说明，Wistar组胰岛LC3表达水平较低，GK糖尿病大鼠胰腺组织LC-3II水平显著升高，经过低，高剂量山楂酸及二甲双胍治疗后，能显著抑制LC-3II水平，结果提示山楂酸对胰岛组织的LC-3II激活具有抑制作用图10。2.6电镜下胰岛细胞超微结构观察大鼠胰腺组织经2.5％戊二醛固定液固定，经脱水、浸透、固化，用超薄切片机切片，HitachiTEMsystem透射电子显微镜观察、摄片。正常Wistar大鼠胰岛细胞及腺泡结构完整，染色质均匀，内质网形状规则。GK模型组，细胞形状不规则，染色质不均匀，呈现早期凋亡改变。山楂酸低、高剂量组细胞结构较为完整，内质网形状规则凋亡有明显改善，二甲双胍组结构改变，染色质均匀图11。2.7ELISA法测定细胞因子水平采集大鼠血清，ELISA测定细胞因子水平，结果说明图12，GK糖尿病大鼠血清中TNF-a、L-1β的水平显著升高，IL-6水平具有升高的趋势，但组间差异较大，差异无统计学意义；经过低、高剂量山楂酸治疗后，TNF-a、IL-1β的水平显著降低，两种剂量山楂酸治疗与Metformin的作用类似，无明显差异。2.8WesternBlot检测组织蛋白水平提取胰腺组织蛋白，WesternBlot检测组织LC-3II,phos-AMPK,AMPK,pmTOR,mTOR蛋白的水平，结果显示图13，GK糖尿病大鼠胰腺组织LC-3II水平显著升高，pAMPK信号通路显著激活，mTOR信号通路显著抑制，说明在GK大鼠胰腺组织中，mTOR-AMPK-LC-3II自噬通路被激活；经过低、高剂量山楂酸干预后，与Metformin作用类似，能显著抑制pAMPK信号通路和LC-3II水平；但是仅高剂量山楂酸可以显著升高mTOR通路水平，结果提示山楂酸对AMPK-LC-3II通路的调控作用部分依赖于mTOR，可能需要其他通路参与。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.山楂酸或其衍生物在制备治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述山楂酸或其衍生物在制备激活胰岛β细胞自噬药物中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述山楂酸或其衍生物在制备调控AMPK-mTOR通路药物中的应用。4.根据权利要求1～3任一所叙述的应用，其特征在于，所述山楂酸或其衍生物作为药物的单一活性成分或与其他治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤药物共同作为活性成分。5.一种治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括治疗有效量的山楂酸或其衍生物。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括与山楂酸同时施用后对治疗2型糖尿病胰岛β细胞损伤有积极作用的药物成分和或使山楂酸稳定性提高的药学上可接受的成分。7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括制药学上可接受的载体。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的山楂酸或其衍生物和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂。10.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述的药物为口服制剂，包括片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸或口服液体。

百度查询： 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院 山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛细胞损伤药物中的应用

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