申请/专利权人：山东翰康医学科技集团有限公司

申请日：2024-03-12

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN117866890A

主分类号：C12N5/0775

分类号：C12N5/0775

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.30#实质审查的生效;2024.04.12#公开

摘要：本发明公开了一种脂肪间充质干细胞外泌体提取和纯化的制备方法，属于外泌体技术领域，包括以下步骤：步骤S1、融合、传代培养；步骤S2、换液培养；步骤S3、浓缩；步骤S4、酶解；步骤S5、柱层析；本发明中在外泌体的纯化过程中加入了酶促剂，酶促剂中含有磺酸基、活性羟基、季铵盐结构和苯环，磺酸基的存在，能作为酶解反应的酸促剂，使酶解反应更加彻底，活性羟基和季铵盐结构的存在能与外泌体悬液中氨基酸结构产生良好的氢键作用，此外，苯环还能与小分子肽上的离域π键产生π‑π相互作用，使小分子肽更好的溶于酶促剂中，提高外泌体纯化物的提取率。

主权项：1.一种脂肪间充质干细胞外泌体提取和纯化的制备方法，包括以下步骤；步骤S1、融合、传代培养：将小鼠原代脂肪干细胞培养至80-90%融合度时，进行传代培养至第三至第六代小鼠脂肪干细胞；步骤S2、换液培养：将第三至第六代小鼠脂肪干细胞在T75的培养瓶中进行换液培养，所换溶液为完全培养基，培养增殖至85-90%汇合时，再加入混合培养基，继续培养48h，培养结束后，收集细胞上清，再将其分装放置于50mL离心管中，并于-80℃下保存备用；步骤S3、浓缩：用1000kDa的超滤管对经解冻的细胞上清进行浓缩，以2000*g离心浓缩过的细胞上清0.5h，以去除细胞和碎片，加入50%细胞培养基体积的总外泌体分离试剂，混合均匀，于４℃冰箱孵育过夜，以４℃，10000*ｇ离心1.5ｈ，再用200μL*PBS重悬管壁的沉淀物，将所得的外泌体悬液放在-80℃的温度下保存备用；步骤S4、酶解：将实施例1制备得到的酶促剂加入经解冻的外泌体悬液中，搅拌均匀,得到混悬液，再经一次酶解和纳滤膜过滤，得到一次酶解产物，再继续经二次酶解和纳滤膜过滤，收集一次透过液和二次透过液；步骤S5、柱层析：将一次透过液和二次透过液加入葡聚糖凝胶SephadexG-50柱中，层析纯化，用去离子水以1mLmin流速梯度洗脱样品，洗脱液每管3mL，收集第51管洗脱液，再将其加入C8反向色谱柱中，采用甲醇和去离子水进行梯度洗脱，先用去离子水洗柱，然后逐渐增加甲醇量至100%，洗脱液每管5mL，收集第30管洗脱液，合并洗脱液，经低温真空浓缩、喷雾干燥，得到外泌体纯化物。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东翰康医学科技集团有限公司 一种脂肪间充质干细胞外泌体提取和纯化的制备方法

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