申请/专利权人：广州同康生物科技有限公司;湖南益百益优生物科技有限公司

申请日：2024-02-18

公开（公告）日：2024-04-23

公开（公告）号：CN117736940B

主分类号：C12N1/20

分类号：C12N1/20;C12N1/06;A61K35/745;A61P1/00;A61P1/04;A23L33/135;A23L33/00;A23L11/50;A23P10/30;C12R1/01

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.23#授权;2024.04.09#实质审查的生效;2024.03.22#公开

摘要：本发明公开了一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种BN08及其后生元。所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种（Bifidobacteriumlongumsubsp.longum）BN08，于2023年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.29105。本发明所提供的长双歧杆菌长亚种BN08能够增强肠道屏障功能完整性、抑制致病菌粘附。本发明所提供的改善肠道健康的益生菌后生元是长双歧杆菌长亚种BN08浓缩菌体溶胞产物的菌剂，具有改善肠道健康的效果。

主权项：1.一种改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）培养基制备：培养基A：称取葡萄糖18~23g、蛋白胨8~12g、牛肉膏5~10g、酵母粉2~6g、Tween800.5~3mL、磷酸氢二钾1~4g、硫酸镁0.1~0.5g、硫酸锰0.02~0.08g、柠檬酸铵1.0~3.0g、乙酸钠3.0~7.0g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基A；培养基B：在培养基A中加入质量浓度为1~3%的琼脂粉，搅拌溶解，120~122℃灭菌18~22min，即得培养基B；培养基C：称取酵母膏8~12g、蛋白胨8~12g、葡萄糖40~60g、乙酸钠0.2~0.7g、MgSO4·7H2O0.1~0.3g、MnSO4·4H2O0.01~0.03g、FeSO4·7H2O0.01~0.03g、NaCl0.01~0.03g、ZnSO4·7H2O0.1~0.3g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基C；培养基D：称取黄豆粉35-110g、全脂奶粉15-75g、黄小米粉5-20g、蛋白胨5-20g、橙汁10-30g、葡萄糖5-80g、乳糖20-80g、乙酸钠0.3~0.8g、MgSO4·7H2O0.1~0.4g、MnSO4·4H2O0.01~0.05g、FeSO4·7H2O0.01~0.05g、NaCl0.01~0.05g、ZnSO4·7H2O0.1~0.5g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基D；2）菌种活化：将冻藏保存的长双歧杆菌长亚种（Bifidobacteriumlongumsubsp.longum）BN08在培养基B上用接种环划线接种，在温度为35~38℃的厌氧工作站生长30~40h，挑取单菌落转移至5~10mL培养基A中，35~38℃厌氧生长20~30h，再吸取0.1~0.5mL菌液转移至5~10mL培养基A中，35~38℃厌氧生长20~30h，在7500~8000rmin、3~5℃的条件下离心8~12min，取沉淀，即为基料E；3）种子培养：挑取3~5环基料E接种于装有250~500mL培养基C的500~1000mL三角瓶中，用封口膜封口，35~39℃恒温、静置、厌氧培养20~30h，得基料F；4）膜滤循环培养：将500~1000mL培养基D加入发酵罐中，接种0.5~3%的基料F，在35~38℃、转速30~65rmin的条件下厌氧培养20~30h，得菌液G；将菌液G通过0.05~0.08μm的中空纤维膜H滤出滤液I；将500~1000mL培养基D反向冲刷中空纤维膜H入发酵罐中，在35~38℃、转速30~65rmin的条件下厌氧培养20~30h，得菌液J；将菌液J通过0.05~0.08μm的中空纤维膜H滤出滤液K；将500~1000mL培养基D反向冲刷中空纤维膜H入发酵罐中，在35~38℃、转速30~65rmin的条件下厌氧培养20~30h，得菌液L；5）离心：将菌液L置于离心机中，在7000~9000rmin的条件下离心8~12min，过滤，取沉淀，即为基料M；将基料M用蒸馏水离心洗涤2~4次，得菌体N；6）溶胞：将菌体N在-30~-40℃的温度下冷冻20~30h后，在3~8℃的条件下解冻5~7h，再置于破壁机中，在18000~22000rmin的条件下破壁3~8s，重复3~5次，得基料O；7）冻干：将基料O置于冻干机的搁板上，在-38~-42℃的条件下预冻9~12h，接着在-28~-32℃的条件下干燥12~18h，最后，将搁板温度升温至12~18℃，干燥6~8h，得基料P；8）粉碎：将基料P置于粉碎机中，在30000~36000rmin的条件下粉碎3~5min，过200~400目筛，得基料Q；9）调配：将20~60份基料Q和35~60份大豆油搅拌均匀，过200~400目筛，重复3~5次，在120~122℃的条件下灭菌18~22min，静置2~3h，再抽真空，真空度为-0.08~-0.09MPa，得基料R；10）化胶：将蒸馏水先加热至55~65℃，再称取35~45份置于化胶罐中，向化胶罐中继续加入35~45份明胶，静置0.8~1.5h，再加入18~25份甘油，混合加热搅拌，转速为200~350rmin，温度保持50~70℃，静置1~2.5h，抽真空，真空度为-0.08~-0.1MPa，过滤，得胶液S；11）胶带制备：将胶液S加入软胶囊机两边的胶盒中，调节胶带厚度为0.6~1mm；12）填充压制：将基料R倒入到软胶囊机的料斗中，调节胶盒温度50~60℃，喷体温度35~45℃，转速2~3rmin，压制成丸T；13）干燥：将丸T置于干燥机中，在30~45℃的条件下，鼓风干燥4~6h，得丸U；14）浸渍：将丸U置于甲醛溶液中搅拌浸泡0.8~1.2h，甲醛溶液的浓度为2~4%，转速为40~60rmin，沥干水分，得丸V；15）洗擦：使用无水乙醇将丸V囊壳表面完全洗净并将其晾干，得丸W；16）干燥：将丸W放在托盘中，在20~30℃的条件下进行干燥15~20h，得肠溶软胶囊，即长双歧杆菌长亚种BN08后生元；所述长双歧杆菌长亚种（Bifidobacteriumlongumsubsp.longum）BN08于2023年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.29105。

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