申请/专利权人：广东先康达生物科技有限公司

申请日：2024-01-03

公开（公告）日：2024-04-19

公开（公告）号：CN117511870B

主分类号：C12N5/0783

分类号：C12N5/0783;C12N5/0775;A61K35/28;A61K35/17;A61P25/00;A61P3/10;A61P37/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.19#授权;2024.02.27#实质审查的生效;2024.02.06#公开

摘要：本发明公开了一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法及其应用；制备方法的步骤为：从PBMC中分离出CD4+T细胞，获得辅助性T细胞；取辅助性T细胞培养，收集培养上清液并经消化液消化、离心后培养沉淀物，获得干细胞；将辅助性T细胞与干细胞混合共培养获得上清液；提取辅助性T细胞与干细胞共培养的上清液经离心、回流、浓缩、洗涤处理，获得外泌体制剂。这种辅助性免疫T细胞和干细胞共培养，可以相互促进富含免疫调节因子外泌体的分泌，并可缩短混合细胞培养周期，达到有效提高混合细胞外泌体的分泌效率。

主权项：1.一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：辅助性T细胞培养：首先，从外周血中分离出PBMC，并筛选出CD4+T细胞；其次，用第一培养基培养CD4+T细胞5~6天，回收第一培养液并离心去除上清液，收集细胞沉淀，获得辅助性T细胞，备用；干细胞培养：首先，在所述辅助性T细胞培养至第3天时，取1×107个间充质干细胞用第二培养基培养2~3天，回收第二培养液中的上清液；其次，往回收上清液中加入消化液进行消化处理后收集细胞悬液；最后，对收集的细胞悬液离心，去上清液，收集沉淀物，获得干细胞，备用；细胞共培养：首先，将所述辅助性T细胞和干细胞混合后用第三培养基重悬，得到混合细胞悬液，该混合细胞悬液中，辅助性T细胞和干细胞的数量比为2~3:1；其次，将混合细胞悬液中的混合细胞接种至培养器中并置于培养条件为37℃、5vv%CO2、3~8vv%O2的培养箱中静置培养12天；培养期间，每隔3天补加一次新鲜的第三培养基，培养结束后收集第三培养液中的上清液；外泌体制剂提取：首先，对收集到的第三培养液中的上清液进行离心处理后，收集离心上清液；其次，将离心上清液用第一中空纤维管循环过滤，去除小分子液体，获得回流浓缩液；接着，往回流浓缩液中加入含1vv%人血白蛋白的生理盐水，继续循环过滤，得到洗涤浓缩液；最后，将洗涤浓缩液用第二中空纤维管过滤，收集滤液，获得T细胞与干细胞的复合细胞外泌体制剂；其中：所述第一培养基包括DMEM或DMEMF12基础培养基，在该基础培养基中添加有终浓度为50~200IUmL的IL-2、终浓度为1~10ngmL的TGF-β1、终浓度为1~5ngmL的TGF-β2、终浓度为50~500ngmL的CD3、终浓度为20~200ngmL的CD28、终浓度为2~10μgmL的转铁蛋白、终浓度为0.5~3μgmL的胰岛素样生长因子-1和终浓度为5vv%的AB血清；所述第二培养基包括DMEM或DMEMF12基础培养基，在该基础培养基中添加有终浓度为10~30ngmL的干细胞因子和终浓度为2vv%的UltroserG血清替代物；所述第三培养基包括DMEM基础培养基，在该基础培养基中添加有终浓度为50~100IUmL的IL-2、终浓度为0.2~2μM的视黄酸、终浓度为5~30μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为5~20ngmL的干细胞因子、终浓度为0.4~2mgmL的人血清白蛋白和终浓度为1vv%的UltroserG血清替代物；所述第一中空纤维管中的中空纤维膜孔径为0.01μm；第二中空纤维管中的中空纤维膜孔径为0.2μm。

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