申请/专利权人：东南大学

申请日：2022-04-02

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN114561341B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12N5/074

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.26#授权;2022.06.17#实质审查的生效;2022.05.31#公开

摘要：本发明公开涉及一种基于多能干细胞iPSC构建三维胰岛类器官的方法,属于生物医学技术领域,该方法不使用基质胶，而采用琼脂糖联合结冷胶实现细胞的三维成团成球，再通过在不同诱导时期添加成分明确的化合物，最终诱导出包含全部4种胰岛细胞的三维胰岛类器官，该方法与基质胶方案相比，大幅度降低技术成本、操作简单、流程可重复、均一性好。

主权项：1.一种基于iPSC的三维胰岛类器官构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1：三维结冷胶培养基的制备1结冷胶粉末，用超纯水配制成0.3％的水溶液，高压灭菌；2然后使用mTeSR1溶液作为溶剂，添加如下成分配制成三维结冷胶培养基工作液：结冷胶，甲基纤维素、ROCKinhibitor、青链霉素；所述结冷胶的终浓度为0.015-0.02％，甲基纤维素的终浓度为0.2-0.3％，ROCKinhibitor的终浓度为8-15μM，所述青链霉素的终浓度为1％；S2：使用超纯水配制0.8-1％琼脂糖，高压灭菌，趁热倒平板，每碟加入1ml三维结冷胶培养基至少平衡20分钟；S3：人源的诱导多能干细胞，使用500ulAccutase在37度消化3-5分钟，使用三维结冷胶培养基重悬细胞，制备单细胞悬浮液，将细胞悬液铺于琼脂糖平板，培养2-5天，可见iPSC细胞球；S4：配制如下5种培养液A液：MCDB131500ml，50％葡萄糖400-600μl，NaHCO31.2-1.5g，BSA10g，ITS-X10μl，GlutaMax5ml，维生素C20-30mg，青链霉素5ml；B液：MCDB131500ml，50％葡萄糖400-600μl，NaHCO30.6-0.7g，BSA10g，ITS-X10μl，GlutaMax5ml，维生素C20-30mg，青链霉素5ml；C液：MCDB131500ml，50％葡萄糖400-600μl，NaHCO30.6-0.7g，BSA10g，ITS-X2.5ml，GlutaMax5ml，维生素C20-30mg，青链霉素5ml；D液：MCDB131500ml，50％葡萄糖400-600μl，NaHCO30.6-0.7g，BSA10g,ITS-X2.5m，GlutaMax5ml，维生素C20-30mg，青链霉素5ml，肝素5mg，硫酸锌1.2-1.5mg；E液：MCDB131500ml，50％葡萄糖2500-3000μl，NaHCO30.7-0.9g，BSA10g，ITS-X2.5ml，GlutaMax5ml，维生素C20-30mg，青链霉素5ml，肝素5mg，硫酸锌1.2-1.5mg；S5：将培养基更换成A液并添加结冷胶0.015-0.02％、甲基纤维素0.2-0.3％、活化素A100ngml、CHIR990212-4uM，培养1天；S6：将培养基更换成A液并添加结冷胶0.015-0.02％、甲基纤维素0.2-0.3％、活化素A100ngml，培养1天；S7：将培养基更换成B液并添加FGF730-60ngml，培养2天；S8：将培养基更换成C液并添加FGF730-60ngml、SANT-10.2-0.3μM、视黄酸0.8-1μM、LDN193189100-150nM、RepSox5-10μM、TPB200-250nM，培养3天；S9：将培养基更换成C液并添加FGF730-60ngml、SANT-10.2-0.3μM、视黄酸0.8-1μM、LDN193189100-150nM、RepSox5-10μM、TPB100-120nM，培养3天；S10：将培养基更换成D液并添加SANT-10.2-0.3μM、视黄酸40-80nM、LDN193189100-150nM、RepSox5-10μM、T31-1.2μM，培养3天；S11：将培养基更换成E液并添加LDN193189100-150nM、GSiXX80-100nM、RepSox5-10μM、T31-1.2μM，培养7天；S12：将培养基更换成E液并添加Trolox10-15μM、R4282-2.5μM、N-乙酰半胱氨酸1-1.2mM、RepSox5-10μM、T31-1.2μM，培养14天；S13：将培养基更换成E液并添加Trolox10-15μM、R4282-2.5μM、N-乙酰半胱氨酸1-1.2mM、RepSox5-10μM、T31-1.2μM、WNT4100-200ngml，培养7天。

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权利要求：

百度查询： 东南大学 一种基于iPSC的三维胰岛类器官及其构建方法

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