申请/专利权人：内蒙古大学

申请日：2022-07-27

公开（公告）日：2024-04-30

公开（公告）号：CN115161342B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N5/10;C12N15/873;A01K67/027;C12R1/91

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.30#授权;2022.10.28#实质审查的生效;2022.10.11#公开

摘要：本发明提供了一种具有新遗传性状的细胞系和动物的构建方法，涉及遗传转化技术领域。本发明所述方法在细胞水平实现了：进行性别转换和遗传组成改变。本发明采用染色体技术、分子生物学技术、细胞工程手段实现了在细胞水平进行染色体转移、性别逆转和染色体删除和添加，实现了合成具有特定遗传性状的细胞系，为后期细胞育种奠定了基础。如在本发明实施例中，通过CRISPRCas9敲除公牛的Y染色体后，再转移一个牛X染色体，将细胞转变成正常母牛的细胞，通过体细胞克隆技术获得母牛。该技术可以快速获得性别反转的母牛，并且有正常的雌性生殖细胞，不含任何外源基因。

主权项：1.一种具有可培养特定遗传性状的母牛的合成育种方法，其特征在于，步骤为：1、公牛成纤维细胞的获取与培养1.1取1-6月龄的牛胚胎，手术刀取2cm2的皮肤组织；1.275％酒精浸泡10s后用DPBS冲洗3次；1.3使用剪刀剪碎后，0.25％胰酶消化5min；1.4培养液终止消化后，使用70um的细胞筛过滤；1.5过滤后的细胞悬液500g5min离心；1.6弃上清，用STO培养液重悬后再100mm培养皿中培养；STO培养液配方：DMEM为基液、10％的FBS、1％的GlutaMAX、1％的青链双抗、BME；2、利用CRISPRCas9敲除牛成纤维细胞的Y染色体，获得XO型细胞2.1针对牛Y染色体的sgRNA链接到CRISPRCas9载体；2.2测序鉴定后使用大提试剂盒进行质粒提取；2.3使用转染试剂盒对牛成纤维细胞进行转染；2.448h后过流氏细胞仪挑选GFP阳性细胞到96孔板；2.57天后将96孔板的细胞传代到48孔板，36h后传到12孔板；2.6每个12孔板的细胞取进行基因组提取进行PCR鉴定；2.7取Y敲出的细胞进行下一步实验，即XO型细胞；3、在公牛成纤维细胞的X染色体进行定点敲入嘌呤霉素抗性基因3.1构建嘌呤霉素打靶载体及两个敲除载体；两个敲除载体sgRNA序列如下：SEQIDNO.1：ggcgctagattgacttgcaa；SEQIDNO.2：cactccaacacgcttcctaa；3.2使用转染试剂盒对牛成纤维细胞进行转染；3.348h后用1.5μgml嘌呤霉素筛选转染的细胞；3.448h后消化细胞对细胞进行计数，每200个细胞分到装有15mlSTO培养基的100mm皿中；3.56-7天后观察克隆形成情况，取状态好的克隆传代到48孔板；3.636h后传代到12孔板中；3.7每个12孔板的细胞进行基因组提取进行PCR鉴定；LFSEQIDNO.3：AGGACGTGTTTTGTGGAAGC；LRSEQIDNO.4:AGTTGCCAGCCATCTGTTGT；RFSEQIDNO.5:GTGGATGTGGAATGTGTGCG；RRSEQIDNO.6:AACGTCATTGTTACCGATGCT；3.8取敲入嘌呤霉素抗性的阳性细胞进行下一步实验；4、利用MMCT技术将标记的X染色体转入CHO细胞4.1将3.8中的细胞传代培养后穿代到两个25cm2的培养瓶中，使用0.05μgml秋水仙素处理细胞48h；4.2随后使用10μgml的细胞松弛素B处理；4.3在两个250ml离心瓶中装入70ml38-40℃的温水配平；4.4将两个25cm2培养瓶装满10μgml的细胞松弛素B的DMEM，封口膜封号培养瓶口严防污染；4.5将25cm2培养瓶装入250ml离心瓶，配平后10000rpm40min离心；4.6将培养瓶角落的沉淀用5mlDMEM重悬后在15ml离心管中500g10min离心洗涤微细胞沉淀，重复两次；4.7用3ml50μgmlPHA-P重选微细胞加入受体CHO细胞轻晃培养皿，放入培养箱孵育20min；4.8用移液器吸干表面液体，加入3ml47％的PEG轻晃混匀；4.9用5mlDMEM洗涤表面的PEG两次；4.1048h后用8μgml的嘌呤霉素筛选48h；4.11将细胞分到6个100mm培养皿中，每个培养皿装有4μgml嘌呤霉素的15ml培养液；4.125天后将克隆团分别传代培养后进行PCR鉴定；4.13阳性细胞即包含牛X染色体的CHO细胞；5、将CHO细胞中的牛X色体利用MMCT技术转入XO型细胞，获得XX型细胞5.1将4.13中的细胞传代培养后传代到两个25cm2的培养瓶中，使用0.05μgml秋水仙素处理细胞48h；5.2随后使用10μgml的细胞松弛素B处理；5.3在两个250ml离心瓶中装入70ml38-40℃的温水配平；5.5将两个25cm2培养瓶装满10μgml的细胞松弛素B的DMEM，封口膜封号培养瓶口严防污染；5.5将25cm2培养瓶装入250ml离心瓶，配平后10000rpm50min离心；5.6将培养瓶角落的微细胞沉淀用5mlDMEM重悬后在15ml离心管中500g10min离心洗涤微细胞沉淀，重复两次；5.7用3mlPHA-P重选微细胞加入受体2.7步骤的XO细胞轻晃培养皿，放入培养箱孵育20min；5.8用移液器吸干表面液体，加入3ml47％的PEG轻晃混匀；5.9用5mlDMEM洗涤表面的PEG两次；5.1048h后用1.5μgml的嘌呤霉素筛选48h；5.11将细胞分到6个100mm培养皿中，每个培养皿装有1μgml嘌呤霉素的15ml培养液；5.127天后将克隆团分别传代培养后进行PCR鉴定，引物序列如下：Puro-FSEQIDNO.7:AGATACCGCACCGTATTGGC；Puro-RSEQIDNO.8:ATAGACGGTCCTCACGGGAT；5.13阳性细胞即XX型细胞；6、转染SuperPiggyBacTransposase载体，去掉抗嘌呤霉素抗性基因；6.1对5.13的XO细胞转染SuperPiggyBacTransposasePB200PA-1载体；6.248h后消化计数，每100mm皿分200个细胞，培养液中添加FLAU；6.37天后将克隆团消化后传代到48孔板；6.448h后分别传代到12孔板；6.5每个12孔板的细胞取进行基因组提取进行PCR鉴定，引物序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；6.6PCR阴性细胞，即嘌呤霉素抗性去除的非转基因细胞；7、对XX型细胞进行体细胞核植技术，获得母牛。

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百度查询： 内蒙古大学 一种具有新遗传性状的细胞系和动物的构建方法

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