申请/专利权人：天津大学

申请日：2022-01-29

公开（公告）日：2024-04-30

公开（公告）号：CN114369593B

主分类号：C12N11/14

分类号：C12N11/14;C12N15/70;C12N15/62;C12N15/53;C12N15/31;C12P41/00;C12P13/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.30#授权;2022.05.06#实质审查的生效;2022.04.19#公开

摘要：本发明涉及二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法；采用重叠延伸PCR技术将二氧化硅结合肽的基因分别插入到介导醇脱氢酶和胺脱氢酶的基因序列的N末端并构建基因工程菌株；利用镍离子金属螯合亲和色谱柱及含高浓度的咪唑缓冲液纯化分离重组蛋白；利用二氧化硅纳米粒子作为固定化酶的载体，将重组蛋白共锚定在SNPs表面得到固定化酶CotB1p‑ADHCotB1p‑AmDH@SNPs；将获得的固定化酶置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中反应进行手性胺的制备。制得的双酶共固定化催化剂表现出较高的酶负载量和提高的催化活性与稳定性，在工业应用生产手性胺方面具有较大的潜力。

主权项：1.二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法，其特征是，包括如下步骤：1）采用重叠延伸PCR技术将二氧化硅结合肽CotB1p的基因分别插入到醇脱氢酶ADH和胺脱氢酶AmDH的基因序列的N末端得到重组基因cotb1p-adh和cotb1p-amdh，然后将重组基因亚克隆到质粒pColdⅡ上，构建基因工程菌株；2）上述工程菌株经诱导表达后，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱及含高浓度的咪唑缓冲液纯化分离重组蛋白CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH；3）利用二氧化硅纳米粒子SNPs作为固定化酶的载体，将两重组蛋白共锚定在SNPs表面得到固定化酶CotB1p-ADHCotB1p-AmDH@SNPs；4）将获得的固定化酶置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中反应进行手性胺的制备；其中：步骤1中，二氧化硅结合肽CotB1p基因序列为SEQIDNO.1；醇脱氢酶ADH的基因序列为SEQIDNO.2；胺脱氢酶AmDH的基因序列为SEQIDNO.3；重组基因cotb1p-adh序列为SEQIDNO.4；cotb1p-amdh序列为SEQIDNO.5；质粒pColdⅡ的序列为SEQIDNO.6；步骤2中，高浓度的咪唑缓冲液作为洗脱液将重组蛋白从镍离子金属螯合亲和色谱柱洗脱下来，咪唑浓度范围为400–500mM；步骤3中，固定化酶体系包含5–15mgmLSNPs、0.0067–0.02mgmLCotB1p-ADH与0.16-0.2mgmLCotB1p-AmDH，然后将固定化酶体系置于4°C空气浴摇床中120-200rpm孵育10-30min，然后以6500-8500g的离心速率收集固定化酶CotB1p-ADHCotB1p-AmDH@SNPs；SNPs粒径为20–30nm；步骤4）中外消旋醇为S-2-己醇。

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