申请/专利权人：吉林大学

申请日：2022-06-22

公开（公告）日：2024-05-03

公开（公告）号：CN115109800B

主分类号：C12N15/866

分类号：C12N15/866;C12N15/62;A61K39/225;A61P31/14;A61K39/39

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.03#授权;2022.10.18#实质审查的生效;2022.09.27#公开

摘要：本发明适用于疫苗研制技术领域，提供了表面展示猪传染性胃肠炎病毒S1蛋白的细菌样颗粒的制备方法，具体为表面展示猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白胞外域S1的乳酸乳球菌BLP的制备方法。该BLP立足于革兰氏阳性增强基质（GEM）‑锚钩蛋白（PA），利用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统，构建表面展示猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白胞外域S1的细菌样颗粒，该系统具备高度的安全性、抗原展示密度大、具有自体佐剂效应等优点，尤其在黏膜疫苗的研发上可望与病毒样颗粒疫苗一道成为最有前景的基因工程亚单位疫苗；该BLP为猪传染性胃肠炎的疫苗研发提供了技术支持，为猪传染性胃肠炎的防控提供了可行的备选策略。

主权项：1.表面展示猪传染性胃肠炎病毒S1蛋白的细菌样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：杆状病毒重组转移载体的构建，具体操作为：合成猪传染性胃肠炎病毒WH_1株表面刺突蛋白胞外域S1基因；根据锚钩蛋白PA，即乳酸乳球菌MG1363的AcmA序列设计引物PA-F和PA-R以扩增获得PA基因；将S1基因和PA基因进行重叠PCR后，将融合基因S1PA克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1，将PCR、双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pFastBac1-S1PA；步骤2：重组杆状病毒的构建与鉴定，具体操作为：将步骤1中的pFastBac1-S1PA转化至EscherichiacoliDH10Bac感受态细胞，利用特异性引物将PCR鉴定正确后的重组杆粒命名为rBacmid-S1PA；利用脂质体介导转染法，将rBacmid-S1PA转染Sf9昆虫细胞，待细胞出现病变，提取细胞基因组进行重组杆状病毒的PCR鉴定，将获得的重组杆状病毒命名为rBV-S1PA；步骤3：GEM颗粒的制备与鉴定，具体操作为：将乳酸乳球菌菌液以500倍稀释后，转移至新鲜的M17培养基中培养，将离心收集的菌体洗涤后用10%三氯乙酸重悬，煮沸30min，离心去除酸液，用PBS洗涤五遍后计数，以2.5×109为1U，以10UmL的浓度，将样品放入真空干燥仪中进行干燥，喷金镀膜后置于透射电子显微镜下观察，处理后的乳酸乳球菌为GEM颗粒；步骤4：表面展示猪传染性胃肠炎病毒S1蛋白细菌样颗粒的制备与鉴定，具体操作为：将第四代重组杆状病毒rBV-S1PA接种到悬浮培养的Sf9昆虫细胞中，收集悬浮培养的Sf9昆虫细胞，超声破碎后经离心去除细胞碎片，与GEM颗粒充分混合室温孵育2h后，将混合液离心收集沉淀，并用PBS重悬，获得表面展示猪传染性胃肠炎病毒S1蛋白的细菌样颗粒；通过SDS-PAGE及Westernblot鉴定，并置于透射电子显微镜下观察；所述S1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，PA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

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权利要求：

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