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申请/专利权人:中国人民解放军总医院第六医学中心
摘要:本发明公开一种用于现场及床旁诊断溶藻弧菌核酸检测试剂盒及检测方法,本发明利用ssRNA报告分子对RPA核酸扩增产物进行实时定量检测及侧流层析检测,此探针携带一个荧光基团和一个荧光猝灭剂,当此结构完整时,荧光强度低。当crRNA与靶序列结合时,LwaCas13a蛋白的顺式切割活性及反式切割活性被激活,ssRNA被切割,实现荧光信号放大。该试剂盒检测过程中全程不开盖,污染低,整个反应在37℃恒温条件下进行,30分钟内即可通过观察荧光曲线或侧流层析试纸条判读结果。该诊断试剂盒具有灵敏,特异,快速,无污染,检测简便等优点,适用于感染溶藻弧菌患者的临床诊断及疫区的环境评估。
主权项:1.一种溶藻弧菌核酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:RPA冻干颗粒:噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白gp32、dNTPS;缓冲液:RehydrationBuffer;醋酸镁;RPA反应引物:ForwardPrimer:gaaattaatacgactcactatagggGGATATGGCCACCACGATGAATCGTTAGCTCA;ReversePrimer:CAGAGGAAAATGTCTCTGCAGCAGAAGTAATT;CRISPR反应mix:LwaCas13a蛋白、DEPC水、RNase抑制剂、T7聚合酶、crRNA、ssRNA报告分子、dNTPs、rNTPs、MgCl2、pH7.4的Tris;crRNA:gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacTGGTAAGTTCGACGATAACTCATACAAA;ssRNA:荧光报告分子:FAMrUrUrUrUrUIowaBlackQuencher;侧流层析报告分子:FAMmArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmABio;所述荧光报告分子中接近5’端的dT用FAM标记,接近3’端的dT用BHQ1标记;所述侧流层析报告分子5’端的dT用FAM标记,接近3’端的dT用生物素标记;阴性对照为双蒸水;阳性对照为溶藻弧菌基因组DNA。
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百度查询: 中国人民解放军总医院第六医学中心 一种基于RPA技术与CRISPR系统结合的溶藻弧菌核酸检测试剂盒及检测方法
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