申请/专利权人：深圳市北科生物科技有限公司

申请日：2024-02-02

公开（公告）日：2024-05-10

公开（公告）号：CN117683712B

主分类号：C12N5/0775

分类号：C12N5/0775

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.10#授权;2024.03.29#实质审查的生效;2024.03.12#公开

摘要：本发明公开一种多能干细胞分化获得间充质干细胞的三维诱导方法，涉及生物医学工程技术领域，该种多能干细胞分化获得间充质干细胞的三维诱导方法包括如下步骤：S1、iPSC细胞复苏接种；S2、iPSC细胞培养及换液；S3、iMSC诱导分化；启动制备软件，全自动制备系统自动泵入iMSC第一阶段诱导培养基，连续诱导培养；iMSC诱导培养一段时间完全更换iMSC第二阶段诱导培养基；S4、iMSC扩增；S5、iMSC冻存；通过采用全自动细胞制备系统结合垂直轮生物反应器将iPSC诱导分化为iMSC，并进行规模化扩增，解决了2D细胞规模化制备的数量限制；本发明的制备方法实现了从细胞复苏、细胞培养、细胞消化、细胞收获、细胞冻存的全自动制备生产。

主权项：1.一种多能干细胞分化获得间充质干细胞的三维诱导方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、iPSC细胞复苏接种：将冻存的iPSC细胞水浴融解后，在制备软件中选取细胞复苏页面，启动细胞复苏任务，然后将定量的细胞悬液泵入垂直轮生物反应器，并泵入第一iPSC培养基；所述步骤S1中启动细胞复苏任务，制备软件端输入设备取样计数结果和接种细胞数，按照10000-100000cm2的细胞密度接种细胞，点击确认，设备继续运行，将定量的细胞悬液泵入垂直轮生物反应器，并泵入第一iPSC培养基；S2、iPSC细胞培养及换液：在垂直轮生物反应器的控制界面暂停反应，允许微载体在容器中沉淀；启动制备软件，在页面点击细胞换液，泵入第二iPSC培养基，点击垂直轮生物反应器的控制界面，继续运行；S3、iMSC诱导分化：在垂直轮生物反应器的控制界面暂停反应；启动制备软件，全自动制备系统自动泵入iMSC第一阶段诱导培养基，连续诱导培养；iMSC诱导培养一段时间完全更换iMSC第二阶段诱导培养基；所述步骤S3中iMSC第二阶段诱导培养基成分包括间充质干细胞无血清基础培养基和血小板裂解物，该血小板裂解物的添加浓度为1-10%；S4、iMSC扩增：在iMSC第二阶段诱导培养基中培养一段时间以后，收取细胞进行iMSC扩增；S5、iMSC冻存：点击制备软件端细胞冻存，输入冻存数量，加载冻存管，若冻存数量大于20管，更换冻存管托盘；设备自动离心去上清并泵入冻存液并进行冻存管分装；所述步骤S1中第一iPSC培养基为E8培养基，该E8培养基中添加有Rock抑制剂Y-27632，并混有进行了消毒和蛋白包被处理的微载体；所述步骤S1中启动细胞复苏任务后，全自动细胞制备系统执行包含机械手拿取离心管，开盖机开盖，泵入预冷的生理盐水，吸样针吸取细胞液，混匀模块混匀，离心，重悬，取样针取样，将定量细胞液泵入生物反应器，将培养基泵入生物反应器的动作；所述步骤S2中第二iPSC培养基为E8培养基；所述步骤S3中iMSC第一阶段诱导培养基为E6培养基，该iMSC第一阶段诱导培养基中包含小分子ALK5抑制剂和小分子GSK3β抑制剂；所述ALK5抑制剂为SB431542，该GSK3β抑制剂为CHIR99021；所述步骤S4中iMSC扩增具体步骤为：启动制备软件，全自动制备系统将培养基上清泵出容器，并自动泵入D-PBS，待微载体在容器中沉淀后，泵出D-PBS；在制备软件页面点击细胞收取，系统泵入Accutase消化酶，然后将生物反应器在37°C下以10rpm搅拌15min；控制软件页面点击继续，用消化终止液抑制反应，进行细胞过滤、离心，设备取样后，从取样口取样细胞进行计数，并在制备软件端输入计数结果；点击制备软件接种页面，按照的接种密度将细胞放大到相应规格的垂直轮生物反应器，输入接种细胞量和体积并泵入MSC维持培养基；所述步骤S5中iMSC冻存时，全自动细胞制备系统应执行包含加载冻存管、细胞液离心、泵入冻存液、混匀模块混匀、冻存管开盖、灌装细胞液、冻存管封盖的动作。

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