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【发明授权】用于治疗眼咽肌营养不良症(OPMD)的试剂及其用途_贝尼泰克知识产权控股股份有限公司_201780086338.5 

申请/专利权人:贝尼泰克知识产权控股股份有限公司

申请日:2017-12-14

公开(公告)日:2024-05-10

公开(公告)号:CN110382698B

主分类号:C12N15/113

分类号:C12N15/113;A61K48/00

优先权:["20161214 US 62/434,312"]

专利状态码:有效-授权

法律状态:2024.05.10#授权;2023.03.17#专利申请权的转移;2023.03.17#著录事项变更;2020.01.10#实质审查的生效;2019.10.25#公开

摘要:本公开涉及用于治疗眼咽肌营养不良症OPMD的RNA干扰RNAi试剂,诸如短发夹微RNAshmiR和短发夹RNAshRNA、包含所述RNAi试剂的组合物,及其用于治疗患有OPMD或对OPMD易感的个体的用途。本公开还涉及RNAi试剂与PABPN1替换试剂诸如编码功能性PABPN1蛋白的构建体组合用于治疗OPMD的用途、包含所述RNAi试剂和PABPN1替换试剂的组合物以及其用于治疗患有OPMD或对OPMD易感的个体的用途。

主权项:1.一种DNA介导的RNA干扰ddRNAi构建体,其包含:i包含编码靶向PABPN1转录物的shmiR的DNA序列的第一核酸,所述shmiR包含:SEQIDNO:39中所示的的效应序列;SEQIDNO:38中所示的效应互补序列;茎环序列;和初级微RNApri-miRNA主链;和ii包含编码shmiR的DNA序列的第二核酸,所述shmiR包含:SEQIDNO:31中所示的的效应序列;SEQIDNO:30中所示的效应互补序列;茎环序列;和pri-miRNA主链。

全文数据:用于治疗眼咽肌营养不良症OPMD的试剂及其用途相关申请的交叉引用本申请要求2016年12月14日提交的美国临时第62434,312号的优先权,其全部内容通过引用整体并入本文。技术领域本公开涉及用于治疗眼咽肌营养不良症OPMD的RNA干扰RNAi试剂、包含其的组合物及其用于治疗患有OPMD或对OPMD易患的个体的用途。背景技术OPMD是一种常染色体显性遗传、缓慢进展、迟发性变性肌肉病症。该疾病的主要特征在于进行性眼睑下垂上睑下垂和吞咽困难吞咽困难dysphagia。咽肌和环咽肌是OPMD中的特异性靶标。近端肢体无力倾向于在疾病进展的后期发展。引起疾病的突变是多聚腺苷酸结合蛋白核1PABPN1基因的编码区中GCNn三核苷酸重复的异常扩增。这种扩增在PABPN1蛋白的N-末端处导致扩增的聚丙氨酸链:10个丙氨酸存在于正常蛋白质中,在突变形式expPABPN1中扩增至11至18个丙氨酸。该疾病的主要病理标志是expPABPN1的核聚集体。扩增的PABPN1的错误折叠导致不溶性聚合物纤维状聚集体在受累细胞的细胞核内积累。PABPN1是易聚集的蛋白质,并且OPMD中突变的丙氨酸扩增的PABPN1具有比野生型正常蛋白质的聚集率更高的聚集率。然而,尚不清楚OPMD中的核聚集体是否具有病理功能或作为细胞防御机制的结果的保护作用。目前OPMD没有药理学或其他方面的治疗。症状性手术干预可以部分纠正上睑下垂并改善中度至重度受累个体的吞咽。例如,环咽肌切开术目前是可用于改善这些患者的吞咽的唯一可能的治疗。然而,这并不能纠正咽部肌肉组织的进行性退化,这通常会导致吞咽困难和窒息后死亡。因此,仍然需要治疗剂来治疗患有OPMD的患者和或易患其的患者的OPMD。对本说明书中包括的文件、法案、材料、装置、物品等的任何讨论不应被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者是与每个所附权利要求的优先权日之前存在的本公开相关的领域中的公知常识。发明内容本公开部分基于发明人的认识:目前不存在用于治疗OPMD的治疗剂。因此,本公开提供了靶向PABPN1mRNA转录物其为OPMD的病因的区域的RNAi试剂。本发明人已证明这些RNAi试剂对PABPN1mRNA转录物的转录后抑制是有效的,所述转录物包括否则将被翻译成导致OPMD的突变型PABPN1蛋白即包含扩增的聚丙氨酸链的那些PABPN1蛋白的转录物变体。例如,已显示本公开的示例性RNAi试剂在体外抑制或减少PABPN1蛋白的表达。此外,本公开提供了用于表达野生型人PABPN1蛋白的试剂下文称为“PABPN1替代试剂”,其具有不被本公开的RNAi试剂靶向的mRNA转录物。本发明人已显示,当与本公开的RNAi试剂结合表达时,PABPN1替代试剂能够产生PABPN1转录物,所述PABPN1转录物对所述RNAi试剂具有抗性并且能够被翻译成功能性PABPN1蛋白。本发明人的这些发现提供了可在OPMD的治疗中具有治疗性应用的试剂。因此,本公开提供了包含编码短发夹微RNAshmiR的DNA序列的核酸,所述shmiR包含:长度为至少17个核苷酸的效应序列effectorsequence;效应互补序列effectorcomplementsequence;茎环序列;和一级微RNApri-miRNA主链;其中所述效应序列与SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。优选地,效应序列的长度少于30个核苷酸。例如,合适的效应序列的长度可在17至29个核苷酸的范围内。优选地,效应序列的长度为20个核苷酸。更优选地,效应序列的长度为21个核苷酸,并且效应互补序列的长度为20个核苷酸。效应序列相对于与所述效应序列基本上互补的SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域可包含4个碱基对错配。在另一个实例中,效应序列相对于与所述效应序列基本上互补的SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域可包含3个碱基对错配。在另一个实例中,效应序列相对于与所述效应序列基本上互补的SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域可包含2个碱基对错配。在另一个实例中,效应序列相对于与所述效应序列基本上互补的SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域可包含1个碱基对错配。在另一个实例中,效应序列与SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域100%互补。当存在错配时,优选地它们不位于对应于shmiR的种子区域seedregion的区域即效应序列的核苷酸2-8内。本文中描述了包含与SEQIDNO:1中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR2”。本文中描述了包含与SEQIDNO:2中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR3”。本文中描述了包含与SEQIDNO:3中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR4”。本文中描述了包含与SEQIDNO:4中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR5”。本文中描述了包含与SEQIDNO:5中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR6”。本文中描述了包含与SEQIDNO:6中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR7”。本文中描述了包含与SEQIDNO:7中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR9”。本文中描述了包含与SEQIDNO:8中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR11”。本文中描述了包含与SEQIDNO:9中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR13”。本文中描述了包含与SEQIDNO:10中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR14”。本文中描述了包含与SEQIDNO:11中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR15”。本文中描述了包含与SEQIDNO:12中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR16”。本文中描述了包含与SEQIDNO:13中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列的示例性shmiR在下文中称为“shmiR17”。在一个实例中,本文所述的核酸可包含编码shmiR的DNA序列,所述shmiR选自:包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:14中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:14中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR2基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:16中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:16中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR3基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:18中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:18中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR4基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:20中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:20中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR5基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:22中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:22中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR6基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:24中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:24中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR7基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:26中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:26中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR9基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:28中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:28中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR11基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:30中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:30中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR13基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:32中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:32中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR14基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:34中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:34中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR15基本上互补的序列的效应互补序列;包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:36中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:36中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR16基本上互补的序列的效应互补序列;和包含以下序列的shmiR:i除了1个、2个、3个或4个碱基错配外与SEQIDNO:38中所示的序列基本上互补的效应序列,条件是所述效应序列能够与SEQIDNO:38中所示的序列形成双链体;以及ii包含与所述效应序列shmiR17基本上互补的序列的效应互补序列;在另一个实例中,本文所述的核酸可包含编码shmiR的DNA序列,所述shmiR选自由以下组成的组:包含SEQIDNO:15中所示的效应序列和与SEQIDNO:15中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR2;包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和与SEQIDNO:17中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR3;包含SEQIDNO:19中所示的效应序列和与SEQIDNO:19中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR4;包含SEQIDNO:21中所示的效应序列和与SEQIDNO:21中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR5;包含SEQIDNO:23中所示的效应序列和与SEQIDNO:23中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR6;包含SEQIDNO:25中所示的效应序列和与SEQIDNO:25中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR7;包含SEQIDNO:27中所示的效应序列和与SEQIDNO:27中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR9;包含SEQIDNO:29中所示的效应序列和与SEQIDNO:29中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR11;包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和与SEQIDNO:31中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR13;包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和与SEQIDNO:33中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR14;包含SEQIDNO:35中所示的效应序列和与SEQIDNO:35中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR15;包含SEQIDNO:37中所示的效应序列和与SEQIDNO:37中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR16;和包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和与SEQIDNO:39中所示的序列基本上互补并能够与其形成双链体的效应互补序列的shmiRshmiR17;例如,由本文所述核酸编码的shmiR可包含相对于相应的效应序列包含1个、2个、3个或4个错配的效应互补序列,条件是同源效应序列和效应互补序列能够形成双链体区域。在另一个实例中,本文所述的核酸可包含编码shmiR的DNA序列,所述shmiR选自由以下组成的组:包含SEQIDNO:15中所示的效应序列和SEQIDNO:14shmiR2中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:19中所示的效应序列和SEQIDNO:18shmiR4中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:21中所示的效应序列和SEQIDNO:20shmiR5中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:23中所示的效应序列和SEQIDNO:22shmiR6中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:25中所示的效应序列和SEQIDNO:24shmiR7中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:27中所示的效应序列和SEQIDNO:26shmiR9中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:29中所示的效应序列和SEQIDNO:28shmiR11中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:35中所示的效应序列和SEQIDNO:34shmiR15中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:37中所示的效应序列和SEQIDNO:36shmiR16中所示的效应互补序列的shmiR;和包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列的shmiR;由本公开的核酸编码的shmiR可以在5’至3’方向上包含:一级miRNA主链的5’侧翼序列;效应互补序列;茎环序列;效应序列;和pri-miRNA主链的3’侧翼序列;由本公开的核酸编码的shmiR可以在5’至3’方向上包含:pri-miRNA主链的5’侧翼序列;效应序列;茎环序列;效应互补序列;和pri-miRNA主链的3’侧翼序列。合适的环序列可选自本领域已知的那些环序列。然而,示例性茎环序列示于SEQIDNO:40中。用于本公开的核酸的合适的一级微RNApri-miRNA或pri-R主链可选自本领域已知的那些。例如,pri-miRNA主链可以选自pri-miR-30a主链、pri-miR-155主链、pri-miR-21主链和pri-miR-136主链。然而,优选地,pri-miRNA主链为pri-miR-30a主链。根据其中pri-miRNA主链为pri-miR-30a主链的实例,pri-miRNA主链的5'侧翼序列示于SEQIDNO:41中,并且pri-miRNA主链的3'侧翼序列示于SEQIDNO:42中。在一个实例中,本文所述的核酸包含选自SEQIDNO:56-68中的任一个中所示的序列的DNA序列。根据该实例,由本公开的核酸编码的shmiR可包含SEQIDNO:43-55中的任一个中所示的序列。本领域技术人员将理解,可将根据本公开的核酸与用于治疗OPMD的其它治疗剂例如,诸如靶向对应于导致OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物的其它RNAi剂组合或与其结合使用。因此,本公开提供了如下核酸,其包含编码如本文所述的shmiR的DNA序列与一种或多种用于治疗OPMD的其它RNAi剂的组合。在一个实例中,提供了多种核酸,其包括:a至少一种如本文所述的核酸;和b至少一种选自以下的另外的核酸:i根据本文所述核酸的核酸;或ii包含编码shmiR或短发夹RNAshRNA的DNA序列的核酸,所述shmiR或短发夹RNA包含长度为至少17个核苷酸的效应序列和效应互补序列,其中所述效应序列与对应于导致眼咽肌营养不良症OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物基本上互补;其中由a的核酸编码的shmiR和由b的核酸编码的shmiR或shRNA包含不同的效应序列。在一个实例中,bii的shmiR或shRNA的效应序列与SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。优选地,与SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的bii的shmiR或shRNA的效应序列的长度少于30个核苷酸。例如,shmiR或shRNA的合适的效应序列的长度可在17至29个核苷酸的范围内。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR2的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR3的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR4的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR5的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR6的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR7的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR9的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR11的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR13的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR14的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR15的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR16的DNA序列。在一个实例中,多种核酸中的至少一种核酸包含编码如本文所述的shmiR17的DNA序列。根据本公开的多种核酸可包括最多10种核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR,即shmiR2-7、shmiR9、shmiR11和shmiR13-17,诸如2种核酸或3种核酸或4种核酸或5种核酸或6种核酸或7种核酸或8种核酸或9种核酸或10种核酸。在一个实例中,多种核酸包括2种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括3种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括4种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括5种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括6种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括7种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括8种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种核酸包括9种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。在一个实例中,多种RNA包括10种本公开的核酸,每种核酸编码如本文所述的shmiR。根据本文所述的任何实例,多种核酸中的一种或多种可编码如本文所述的shRNA。在一个实例中,本公开的多种核酸包括至少两种核酸,每种核酸包含编码选自由如本文所述的shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14和shmiR17组成的组的shmiR的DNA序列。本公开的一个示例性多种核酸包括一种核酸,其包含编码如本文所述的shmiR13的DNA序列,和另一种核酸,其包含编码如本文所述的shmiR17的DNA序列。本公开的另一个示例性多种核酸包括一种核酸,其包含编码如本文所述的shmiR3的DNA序列,和另一种核酸,其包含编码如本文所述的shmiR14的DNA序列。根据其中提供多种核酸的实例,两种或更多种核酸可以形成同一多核苷酸的单独部分。在另一个实例中,多种核酸中的两种或更多种核酸分别形成不同多核苷酸的部分。根据本公开的核酸或每种所述核酸可包含一个或多个转录终止子序列,或与其可操作地连接。例如,所述核酸或每种所述核酸可在编码shmiR的序列的3'末端包含转录终止子序列。此类序列将取决于启动子的选择,并且是本领域技术人员已知的。然而,本文描述了根据本公开的核酸或其多种核酸使用的启动子和转录终止子序列的合适选择。或者,或另外地,根据本公开的核酸或每种所述核酸可包含转录起始序列,或与其可操作地连接。例如,所述核酸或每种所述核酸可在编码shmiR的序列的5'末端包含转录起始序列。此类序列将是本领域技术人员已知的。可选地或另外地,根据本公开的核酸或每种所述核酸可包含一个或多个限制性位点,例如,以有利于将一种或多种核酸克隆到克隆载体或表达载体中。例如,本文描述的核酸可以在编码本公开的shmiR的序列的上游和或下游包含限制性位点。合适的限制性酶识别序列将是本领域技术人员已知的。根据本公开的核酸,或如本文所述的多种核酸,也可以以DNA介导的RNA干扰ddRNAi构建体的形式提供,或者包含在所述构建体中,所述构建体能够表达由本公开的一种或多种核酸编码的一种或多种shmiR。在一个实例中,ddRNAi构建体包含至少两种本公开的核酸,使得ddRNAi构建体编码至少两种靶向对应于导致OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物的shmiR,所述shmiR的每一种彼此不同。在一个实例中,ddRNAi构建体中的至少两种核酸中的每一种编码shmiR,所述shmiR包含与SEQIDNO:1、2、4、7、9、10和13中的一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列。因此,根据该实例的ddRNAi构建体编码选自如本文所述的shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14和shmiR17的两种shmiR。本公开的ddRNAi构建体的一个实例包含选自由以下组成的组的至少两种核酸:包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:15中所示的效应序列和与SEQIDNO:15基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:14shmiR2中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和与SEQIDNO:17基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:21中所示的效应序列和与SEQIDNO:21基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:20shmiR5中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:27中所示的效应序列和与SEQIDNO:27基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:26shmiR9中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和与SEQIDNO:31基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和与SEQIDNO:33基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列;和包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和与SEQIDNO:39基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。在一个实例中,ddRNAi构建体包含至少两种选自由以下组成的组的核酸:包含SEQIDNO:56shmiR2中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:59shmiR5中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:62shmiR9中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;以及包含SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。在一个实例中,ddRNAi构建体中的至少两种核酸中的每一种编码shmiR,所述shmiR包含与SEQIDNO:2、9、10和13中的一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列。因此,根据该实例的ddRNAi构建体编码选自如本文所述的shmiR3、shmiR13、shmiR14和shmiR17的两种shmiR。本公开的ddRNAi构建体的一个实例包含选自由以下组成的组的至少两种核酸:包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和与SEQIDNO:17基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和与SEQIDNO:31基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和与SEQIDNO:33基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列;以及包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和与SEQIDNO:39基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。在一个实例中,ddRNAi构建体包含选自由以下组成的组的至少两种核酸:包含SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;以及包含SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。本公开的一个示例性ddRNAi构建体包含:a包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;以及b包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。根据本实例的ddRNAi构建体可包含:a包含SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;以及b包含SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。本公开的一个示例性ddRNAi构建体包含:a包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;以及b包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列。根据本实例的ddRNAi构建体可包含:a包含SEQIDNO:57shmiR3中所示的序列或由所述序列组成的核酸;以及b包含SEQIDNO:65shmiR14中所示的序列或由所述序列组成的核酸。在一个实例中,如本文所述的ddRNAi构建体包含单个启动子,其与编码本公开的shmiR的核酸或每个所述核酸可操作地连接。在另一个实例中,编码本公开的shmiR的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。例如,一个或多个启动子位于编码一种或多种shmiR的一种或多种相应核酸的上游。根据其中ddRNAi构建体包含多个启动子的实例,启动子可以相同或不同。可使用的示例性启动子是肌肉特异性启动子,诸如例如Spc512和CK8。可使用的其它示例性启动子是RNApolIII启动子,诸如例如U6和H1启动子。示例性U6启动子是U6-1、U6-8和U6-9启动子。如本文所述的多种核酸,也可以以多种ddRNAi构建体的形式提供,或者包含在所述构建体中,每一种ddRNAi构建体能够表达由本公开的一种或多种核酸编码的一种或多种shmiR。例如,多种核酸中的每种核酸可以以单独的ddRNAi构建体的形式提供,或者包含在单独的ddRNAi构建体中。在一个实例中,多种ddRNAi构建体包括至少两种ddRNAi构建体,每种ddRNAi构建体包含本文所述的多种核酸中的核酸,使得ddRNAi构建体共同编码至少两种靶向对应于导致OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物的shmiR,所述shmiR的每一种都是彼此不同的。在一个实例中,至少两种ddRNAi构建体中的每一种编码shmiR,所述shmiR包含与SEQIDNO:1、2、4、7、9、10和13中的一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列。因此,根据该实例的多种ddRNAi构建体共同编码选自如本文所述的shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14和shmiR17的两种shmiR。本公开的多种ddRNAi构建体的一个实例包括选自由以下组成的组的至少两种ddRNAi构建体:包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:15中所示的效应序列和与SEQIDNO:15基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:14shmiR2中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和与SEQIDNO:17基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:21中所示的效应序列和与SEQIDNO:21基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:20shmiR5中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:27中所示的效应序列和与SEQIDNO:27基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:26shmiR9中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和与SEQIDNO:31基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和与SEQIDNO:33基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列;以及包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和与SEQIDNO:39基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。在一个实例中,所述多种ddRNAi构建体包括至少选自由以下组成的组的ddRNAi构建体:包含含有SEQIDNO:56shmiR2中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:59shmiR5中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:62shmiR9中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;以及包含含有SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体。在一个实例中,至少两种ddRNAi构建体中的每一种编码shmiR,所述shmiR包含与SEQIDNO:2、9、10和13中的一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列。因此,根据该实例的多种ddRNAi构建体共同编码选自如本文所述的shmiR3、shmiR13、shmiR14和shmiR17的两种shmiR。本公开的多种ddRNAi构建体的一个实例包括选自由以下组成的组的至少两种ddRNAi构建体:包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和与SEQIDNO:17基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和与SEQIDNO:31基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和与SEQIDNO:33基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列;以及包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和与SEQIDNO:39基本上互补并且能够与其形成双链体的效应互补序列,例如,SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。在一个实例中,所述至少两种ddRNAi构建体选自由以下组成的组:包含含有SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;包含含有SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;以及包含含有SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体。本公开的一个示例性多种ddRNAi构建体包括:a包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;以及b包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。根据本实例的多种ddRNAi构建体可包括:a包含含有SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体;以及b包含含有SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体。本公开的另一个示例性多种ddRNAi构建体包括:a包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;以及b包含含有编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸的ddRNAi构建体,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列。根据本实例的多种ddRNAi构建体可包括:a包含含有SEQIDNO:57shmiR3中所示的序列或由所述序列组成的核酸的ddRNAi构建体;以及b包含含有SEQIDNO:65shmiR14中所示的序列或由所述序列组成的核酸的ddRNAi构建体。如本文所述的多种ddRNAi构建体中的每一种ddRNAi构建体包含单个启动子,其与编码其中包含的shmiR的核酸或每种所述核酸可操作地连接。当多种ddRNAi构建体中的ddRNAi构建体包含不止一种编码shmiR的核酸时,每种核酸可以与同一启动子可操作地连接或与单独的启动子可操作地连接。在描述多种ddRNAi构建体的前述实例中的每个实例中,一个或多个启动子位于编码一种或多种shmiR的一种或多种相应核酸的上游。可使用的示例性启动子是肌肉特异性启动子,诸如例如Spc512和CK8。可使用的其它示例性启动子是RNApolIII启动子,诸如例如U6和H1启动子。示例性U6启动子是U6-1、U6-8和U6-9启动子。包含在多种ddRNAi构建体的各个ddRNAi构建体中的启动子可以相同或不同。本公开还提供了DNA构建体,其包含:a如本文所述的ddRNAi构建体;和bPABPN1构建体,其包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被ddRNAi构建体编码的一种或多种shmiR靶向。优选地,对编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列进行密码子优化,使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向。在一个实例中,功能性PABPN1蛋白是野生型人PABPN1蛋白,例如具有SEQIDNO:74中所示的序列。在一个实例中,编码功能性PABPN1蛋白的经密码子优化的DNA序列示于SEQIDNO:73中。DNA构建体可包含一个或多个启动子。用于本公开的DNA构建体的示例性启动子是肌肉特异性启动子,诸如例如Spc512和CK8。根据一个实例,DNA构建体包含与PABPN1构建体和ddRNAi构建体可操作地连接的启动子,其中启动子位于PABPN1构建体和ddRNAi构建体的上游。在一个实例中,DNA构建体在5'至3'方向上包含:a肌肉特异性启动子,例如Spc512;b如本文所述的PABPN1构建体,其包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向;以及c本公开的ddRNAi构建体,其包含含有编码如本文所述的shmiR13的DNA序列的核酸和含有编码如本文所述的shmiR17的DNA序列的核酸。在另一个实例中,DNA构建体包含:a肌肉特异性启动子,例如Spc512;b如本文所述的PABPN1构建体,其包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向;以及c本公开的ddRNAi构建体,其包含含有编码如本文所述的shmiR3的DNA序列的核酸和含有编码如本文所述的shmiR14的DNA序列的核酸。在另一个实例中,PABPN1构建体和ddRNAi构建体各自与DNA构建体内的单独的启动子可操作地连接。例如,与PABPN1构建体可操作连接的启动子将与编码其中包含的功能性PABPN1蛋白的DNA序列可操作地连接。与ddRNAi构建体可操作地连接的所述启动子或每个所述启动子将与ddRNAi构建体中包含的编码本公开的shmiR的一种或多种核酸可操作地连接。用于本公开的DNA构建体的示例性启动子是肌肉特异性启动子,诸如例如Spc512和CK8。根据该实例的一种DNA构建体在5'至3'方向上包含:a肌肉特异性启动子例如CK8启动子,其位于本公开的ddRNAi构建体的上游,所述构建体包含含有编码如本文所述的shmiR13的DNA序列的核酸和含有编码如本文所述的shmiR17的DNA序列的核酸;以及b肌肉特异性启动子例如Spc512启动子,其位于如本文所述的PABPN1构建体的上游,所述构建体包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向。根据该实例的另一种DNA构建体在5'至3'方向上包含:a肌肉特异性启动子例如CK8启动子,其位于本公开的ddRNAi构建体的上游,所述构建体包含含有编码如本文所述的shmiR3的DNA序列的核酸和含有编码如本文所述的shmiR14的DNA序列的核酸;以及b肌肉特异性启动子例如Spc512启动子,其位于如本文所述的PABPN1构建体的上游,所述构建体包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向。包含在本公开的DNA构建体中的编码shmiR13和shmiR17的示例性ddRNAi构建体可包含含有编码shmiR所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和与SEQIDNO:31中所示的序列基本上互补的效应互补序列,例如,SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,以及含有编码shmiR所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和与SEQIDNO:39中所示的序列基本上互补的效应互补序列,例如,SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。例如,根据DNA构建体的该实例的ddRNAi构建体可包含含有SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,以及含有SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。包含在本公开的DNA构建体中的编码shmiR3和shmiR14的示例性ddRNAi构建体可包含含有编码shmiR所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和与SEQIDNO:17中所示的序列基本上互补的效应互补序列,例如,SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,以及含有编码shmiR所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和与SEQIDNO:33中所示的序列基本上互补的效应互补序列,例如,SEQIDNO:34shmiR14中所示的效应互补序列的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。例如,根据DNA构建体的该实例的ddRNAi构建体可包含含有SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,以及含有SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。本公开还提供了表达载体,其包含本公开的ddRNAi构建体,或本公开的多种ddRNAi构建体或本公开的DNA构建体。本公开还提供了多种表达载体,其每种包含本公开的ddRNAi构建体。例如,多种表达载体中的一种或多种包含多种如本文公开的多种ddRNAi构建体。在另一个实例中,多种表达载体中的每种表达载体包含多种如本文公开的多种ddRNAi构建体。在另外的实例中,多种表达载体中的每种表达载体包含单种如本文公开的单一ddRNAi构建体。在本段落中的任何前述方式中,根据本公开,多种表达载体可共同表达多种shmiR。本公开还提供了多种表达载体,其包括:a包含一种或多种本公开的ddRNAi构建体的表达载体;和b包含PABPN1构建体的表达载体,所述PABPN1构建体包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被ddRNAi构建体编码的一种或多种shmiR靶向。优选地,对编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列进行密码子优化,使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向。在一个实例中,功能性PABPN1蛋白是野生型人PABPN1蛋白,例如具有SEQIDNO:74中所示的序列。在一个实例中,编码功能性PABPN1蛋白的经密码子优化的DNA序列示于SEQIDNO:73中。在一个实例中,编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列可以与包含在PABPN1构建体内并位于编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的上游的启动子可操作地连接。在另一个实例中,包含PAPBN1构建体的表达载体包含位于PABPN1构建体的上游并且与编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列可操作地连接的启动子。用于本公开的一种或多种表达载体的示例性启动子是肌肉特异性启动子,诸如例如Spc512和CK8。在一个实例中,所述表达载体或每种表达载体为质粒或微环minicircle。在一个实例中,质粒或微环或表达载体或ddRNAi构建体与阳离子DNA结合聚合物例如聚乙烯亚胺复合。在另一个实例中,所述表达载体或每种表达载体是病毒载体。例如,病毒载体选自由以下组成的组:腺相关病毒AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体AdV和慢病毒LV载体。本公开还提供了包含如本文所述的ddRNAi构建体和或多种ddRNAi构建体和或表达载体和或多种表达载体的组合物。在一个实例中,组合物还可包含一种或多种药学上可接受的载剂和或稀释剂。本公开还提供了抑制导致受试者的OPMD的PABPN1蛋白的表达的方法,所述方法包括向所述受试者施用核酸、多种核酸、ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体或本文所述的组合物。本公开还提供了治疗患有OPMD的受试者的OPMD的方法,该方法包括向受试者施用本文所述的核酸、多种核酸、ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体或组合物。该方法可包括向受试者一起、同时或连续地施用多种表达载体。本公开还提供了试剂盒,其包含:a一种或多种用于抑制导致OPMD的PABPN1蛋白表达的剂,所述一种或多种剂选自如本文所述的核酸、多种核酸、ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体或组合物;和b表达载体,其包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被a中的剂表达的shmiR靶向。优选地,对编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列进行密码子优化,使得其mRNA转录物不被a中的剂编码的shmiR靶向。在一个实例中,功能性PABPN1蛋白是野生型人PABPN1蛋白,例如具有SEQIDNO:74中所示的序列。在一个实例中,编码功能性PABPN1蛋白的经密码子优化的DNA序列示于SEQIDNO:73中。编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列可以与包含在b中的表达载体内并位于编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的上游的启动子可操作地连接。用于b中的表达载体的示例性启动子是肌肉特异性启动子,诸如例如Spc512或CK8启动子。本公开还提供了试剂盒,其包含作为单独的组分包装的本文所述的多种表达载体。本公开还提供了试剂盒,其包含与本公开方法的使用说明书包装在一起的如本文所述的核酸、多种核酸,ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体或组合物。在一个实例中,如本文所述的试剂盒用于根据本文所述的方法治疗OPMD。本公开还提供了如本文所述的核酸、多种核酸、ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体和或组合物用于制备药物例如用于治疗受试者的OPMD和或本文公开的方法的用途。本公开还提供了用于疗法的如本文所述的核酸、多种核酸,ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体和或组合物。例如,核酸、多种核酸、ddRNAi构建体、多种ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体、多种表达载体和或组合物可用于治疗患有OPMD或对OPMD易感的受试者的OPMD和或用于本文公开的方法。附图简述图1举例说明代表性shmiR构建体的预测的二级结构,所述构建体包含5’侧翼区、siRNA有义链;茎环连接序列、siRNA反义链和3’侧翼区。图2举例说明具有称为shmiR2-17的shmiR的反义序列和有义序列的shmiR相对于psilencer对照在HEK293细胞中的wtPABPN1抑制活性。该图举例说明除shmiR11外的所有shmiR均下调自wtPABPN1萤光素酶报告基因的萤光素酶表达水平。图3举例说明具有称为shmiR2-17的shmiR的反义序列和有义序列的shmiR相对于psilencer对照在HEK293细胞中的optPABPN1抑制活性。该图举例说明自optPABPBN1萤光素酶报告基因的表达没有下调。图4A是蛋白质印迹,其显示用编码shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14、shmiR16或shmiR17的质粒转染的HEK293T细胞中表达的FLAG标记的wtPABPN1蛋白相对于表达的Hsp90蛋白的水平。这表明所有选择的shmiR都敲低了wtPABPN1的表达。图4B举例说明HEK293细胞中FLAG标记的wtPABPN1蛋白相对于psilencer对照的抑制百分比。该图举例说明所有选择的shmiR敲低wtPABPN1的表达,其中如通过图4A的蛋白质印迹的密度计量分析所测定的,抑制百分比90%。图5A是蛋白质印迹,其显示用编码shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14、shmiR16或shmiR17的shmiR质粒转染的HEK293T细胞中表达的FLAG标记的密码子优化的PABPN1蛋白相对于表达的Hsp90蛋白的水平。这表明shmiR均不导致对密码子优化的PABPN1构建体的表达产物的抑制。图5B举例说明HEK293细胞中FLAG标记的密码子优化的PABPN1蛋白相对于psilencer对照的抑制百分比。该图举例说明,如通过图5A的蛋白质印迹的密度计量分析所测定的,shmiR均不导致密码子优化的PABPN1构建体的表达产物的抑制。图6举例说明如通过qPCR分析所测定的,shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14、shmiR16或shmiR17在HEK293T细胞中对内源性wtPABPN1表达的抑制百分比。该图举例说明shmiR下调wtPABPN1的表达,其中抑制百分比在16.4%至49.1%平均35.5%的范围内。图7举例说明如通过qPCR分析所测定的,C2C12细胞中响应于shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14、shmiR16或shmiR17产生的抑制的内源性PABPN1表达的抑制百分比。该图举例说明除shmiR16约43%的抑制百分比外,所有单独的shmiR相对于pSilencer对照在C2C12细胞中下调PABPN1的表达,其中平均抑制百分比为约80%。图8举例说明如通过qPCR分析所测定的,单独的shmiR即shmiR13、shmiR17、shmiR3和shmiR14、shmiR13与shmiR17的组合shmiR1317以及shmiR3与shmiR14的组合shmiR314在C2C12细胞中对PABPN1表达的抑制百分比;该图举例说明shmiR1317共转染导致PABPN1表达的抑制百分比为84.4%,而单独的shmiR13和shmiR17分别为92.5%和76.7%,以及shmiR314共转染导致79.0%的抑制百分比,而单独的shmiR3和shmiR14分别为76.2%和80.4%。图9举例说明如通过qPCR分析所测定的,单独的shmiR13、shmiR17、shmiR3和shmiR14、shmiR13与shmiR17的组合shmiR1317以及shmiR3与shmiR14的组合shmiR314在ARPE-19中对PABPN1表达的抑制百分比。该图举例说明在ARPE-19细胞中在48小时与72小时之间PABPN1表达的抑制百分比增加了1.14倍。图10A显示通过qPCR测定在用shmiR13、shmiR14和shmiR17转染的C2C12细胞中表达的shmiR的总数而获得的标准曲线。图10B显示通过qPCR测定在用shmiR3转染的C2C12细胞中表达的shmiR的总数而获得的非线性标准曲线。图11举例说明用表达所述shmiR的shmiR载体转导的C2C12细胞中shmiR3、shmiR13、shmiR14和shmiR17的表达水平。图12A是举例说明用于同时实现内源性PABPN1的基因沉默和利用密码子优化的PABPN1的替换的构建体的示意图,所述密码子优化的PABPN1是通过将靶向wtPABPN1的两种shmiR亚克隆到pAAV2载体主链中密码子优化的PABPN1转录物的3'非翻译区而产生的。图12B是举例说明用于同时实现内源性PABPN1的基因沉默和利用密码子优化的PABPN1的替换的构建体的示意图,所述密码子优化的PABPN1是通过将靶向wtPABPN1的两种shmiR亚克隆到optPABPN1的序列上游而产生的。图13显示注射AAV9-eGFP后小鼠肢体内的体内荧光。图14是举例说明被设计用于同时实现内源性PABPN1的基因沉默和利用密码子优化的PABPN1的替换的SR构建体的示意图,所述密码子优化的PABPN1是通过将靶向wtPABPN1的两种shmiRshmiR17和shmiR13亚克隆到pAAV2载体主链中密码子优化的PABPN1转录物的3'非翻译区而产生的。图15举例说明用沉默和替换构建体下文称为“SR构建体”处理的A17小鼠中PABPN1的抑制百分比,并显示在高剂量和低剂量下均实现对PABPN1的强烈抑制。图16举例说明利用高剂量和低剂量的SR构建体处理的A17小鼠中经密码子优化的PABPN1相对于野生型PABPN1包括突变体形式的表达水平。图17显示用于来自i用盐水处理的A17小鼠、ii用盐水处理的FvB小鼠、iii利用高剂量和低剂量的SR-构建体处理的A17小鼠的胫骨前肌TA肌肉的切片中PABPN1和层粘连蛋白检测的免疫荧光组织化学。利用高剂量和低剂量的SR构建体处理的小鼠的肌肉中PABPN1阳性核内包涵体INI的数量均显著减少。图18举例说明用于来自i用盐水处理的A17小鼠、ii用盐水处理的FvB小鼠、iii利用高剂量和低剂量的SR-构建体处理的A17小鼠的胫骨前肌TA肌肉的切片中含INI的细胞核的水平以百分比表示。该图举例说明与注射盐水的A17肌肉相比,利用高剂量和低剂量的SR构建体的处理使INI的量降至约10%。图19显示从i用盐水处理的A17小鼠、ii用盐水处理的FvB小鼠、iii用高剂量和低剂量的SR构建体处理的A17小鼠切取的胫骨前肌TA肌肉的重量。该图显示利用高剂量和低剂量的SR构建体的处理使肌肉重量恢复到接近FvB动物的野生型水平。所有肌肉测量均在处死当天、注射后14周或20周时进行。图20显示了从i用盐水处理的A17小鼠、ii用盐水处理的FvB小鼠、iii利用高剂量和低剂量的SR构建体处理的A17小鼠切取的胫骨前肌TA肌肉的等距最大力isometricmaximalforce。该图显示利用高剂量和低剂量的SR构建体的处理使在A17小鼠中记录的相对于FvB野生型动物的减小的力量差异恢复大约66%。在处死当天、注射后14周或20周时进行所有肌肉测量。统计显示为相对于A17盐水小鼠的非配对t检验。*p90%,并且测试的8种shmiR中的7种以95%的水平抑制野生型PABPN1蛋白的表达。相反,shmiR不抑制密码子优化的PABPN1构建体的表达图5。实施例4-HEK293T细胞中的PABPN1的shmiR靶向基因沉默该实施例证明了PABPN1shmiR质粒在体外敲低PABPN1的内源表达的能力。细胞使人胚肾细胞HEK293T,ATCC,Manassas,USA在含有20mMHEPES、2mM谷氨酰胺、10%胎牛血清FBS、1XPenstrep的达尔伯克改良伊格尔培养基DMEM中生长。处理简言之,将HEK293T细胞以1x106个细胞孔接种,第二天用实施例2中描述的shmiR质粒之一300ng孔转染所述细胞。作为对照,用表达非靶向siRNA序列的psilencer质粒ThermoFisher,USA转染HEK293T细胞。将HEK293T细胞在37℃下在完全DMEM培养基中孵育72小时,之后收获细胞并提取RNA,将其反转录,并通过qPCR进行分析。qPCR分析对提取的RNA样品进行qPCR分析,以便定量上述shmiR在mRNA水平上对PABPN1的抑制水平。为了区分密码子优化的PABPN1与野生型PABPN1,设计TaqMan引物和探针来特异性扩增野生型PABPN1或密码子优化的PABPN1。使用GenScriptTaqMan引物设计工具https:www.genscript.comssl-binappprimer设计引物用于定量RT-PCR的所得引物序列如下:wtPABPN1-Fwd5’-ATGGTGCAACAGCAGAAGAG-3’SEQIDNO:77wtPABPN1-Rev5’-CTTTGGGATGGCCACTAAAT-3’SEQIDNO:78wtPABPN1-探针5’-CGGTTGACTGAACCACAGCCATG-3’SEQIDNO:79optPABPN1-Fwd5’-ACCGACAGAGGCTTCCCTA-3’SEQIDNO:80optPABPN1-Rev5’-TTCTGCTGCTGTTGTAGTTGG-3’SEQIDNO:81optPABPN1-探针5’-TGGTCCGGGCTCTGTACCTAGCC-3’SEQIDNO:82按照制造商的说明,使用TrizolInvitrogen从细胞裂解物中提取总RNA。使用ND-1000NanoDrop分光光度计NanoDropTechnologies定量RNA样品。按照制造商的说明,使用Multiscribe逆转录酶ABI反转录RNA100ng。在总共10ul的反应体积中使用TaqmanqPCR主混物mastermix将cDNA用于定量PCR反应。PCR反应如下进行:在50℃下2分钟,在95℃下10分钟,然后进行40个循环:在95℃下15秒,在60℃下1分钟。将每种mRNA的表达水平针对GAPDH进行标准化。根据如通过标准曲线所测定的总拷贝数计算表达水平,并将其转化为相对于pSilencer对照的抑制百分比。示例性shmiR在HEK293细胞中对野生型PABPN1表达的所得抑制百分比示于图6中。如图6所示,所述shmiR下调PABPN1的表达,其中抑制百分比范围为16.4%至49.1%平均35.5%。实施例5-C2C12小鼠肌肉细胞和ARPE-19人视网膜细胞中的PABPN1的shmiR靶向基因沉默为了确定通过qPCR测量的示例性shmiR在HEK293细胞中对PABPN1表达的低抑制百分比是否是由PABPN1的基因表达中的细胞系变异导致,选择与OPMD相关的另外的细胞系即C2C12小鼠肌肉细胞和ARPE-19人视网膜细胞用于分析。细胞使C2C12肌肉细胞在含有20mMHEPES、2mM谷氨酰胺、10%胎牛血清FBS、1XPenstrep的达尔伯克改良伊格尔培养基DMEM中生长。使ARPE-19人视网膜细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基汉姆氏营养混合物F-12DMEMF12,10%胎牛血清FBS,1XPenstrep中生长。处理简言之,使用Neon电穿孔系统脉冲电压:1650,脉冲宽度:10,脉冲数:3对2x105个C2C12细胞进行电穿孔。分析了上述两种shmiR的单独的shmiR和其组合2μg孔。作为对照,用表达非靶向siRNA序列的pSilencer质粒ThermoFisher,USA对C2C12细胞进行电穿孔。将C2C12细胞在37℃下在完全DMEM培养基中孵育24小时,之后加入50ugmL潮霉素以减缓非转染细胞的生长,然后在电穿孔后48小时再加入100ugmL。在72小时时,收获细胞并提取总RNA用于qPCR。使用以下条件,用Neon电穿孔系统对5x106个ARPE-19细胞进行电穿孔:脉冲电压:1350,脉冲宽度:20,脉冲次数:2。如上处理细胞对C2C12细胞,除在24小时时加入50ugmL潮霉素,不再添加潮霉素。在48和72小时收获ARPE-19细胞用于RNA提取和qPCR分析。qPCR分析如对实施例4的HEK293细胞所述进行逆转录酶qPCR,其中wtPABPN1引物和探针用于测量响应于实施例3中选择的shmiR产生的抑制的内源PABPN1的表达。在C2C12细胞中,对于shmiR3、13、14、17以一式三份进行qPCR,对于shmiR2、5、9、16以一式两份进行qPCR。对于ARPE-19细胞,在两个时间点48和72小时使用单次测量。如图7所示,除shmiR16约43%的抑制百分比外,所有单独的shmiR下调C2C12细胞中的PABPN1表达,相对于pSilencer对照,平均抑制百分比为约80%。选择如通过PABPN1的抑制百分比测量的性能最佳的shmiR用于分析它们组合抑制PABPN1表达的能力。将shmiR1317的组合和shmiR314的组合共电穿孔到细胞中,并如上针对单独的shmiR所述,通过qPCR测量PABPN1的表达。图8显示了shmiR的这些组合对C2C12细胞中PABPN1表达的作用。shmiR1317共转染导致PABPN1表达的抑制百分比为84.4%,而单独的shmiR13和17分别为92.5%和76.7%。shmiR314共转染导致抑制百分比为79.0%,而单独的shmiR3和14分别为76.2%和80.4%。测试了与上述相同的shmiR组合在人细胞系即ARPE-19细胞中抑制PABPN1表达的能力。如上所述处理细胞,并且在48小时和72小时时通过qPCR测量的所得PABPN1表达的抑制示于图9中。72小时后,shmiR1317共转染导致PABPN1表达的抑制百分比为87.9%,而单独的shmiR13和17分别为83.9%和89.8%。shmiR314共转染导致87.4%的抑制百分比,而单独的shmiR3和14分别为82.2%和81.6%。平均而言,在ARPE-19细胞中,PABPN1表达的抑制百分比在48小时与72小时之间增加1.14倍。实施例6-通过qPCR测量shmiR表达为了测定用如上所述的性能最佳的shmiR转染的C2C12细胞中表达的shmiR的总数,开发了miScript测定。使用Qiagen的miScriptPCR系统Valencia,CA测量通过U6shmiR表达构建体进行的shmiR3、13、14和17的产生。对于每次RT-qPCR分析,使用Qiagen的miScriptIIRT试剂盒将50ng总RNA转化为cDNA。然后利用如下所示的定制正向引物,使用QiagenmiScriptSYBRgreenPCR试剂盒进行shRNA的定量PCR:shmiR3-FWD5’-TTCATCTGCTTCTCTACCTCG-3’SEQIDNO:83shmiR13-FWD5’-AGGGGAATACCATGATGTCGC-3’SEQIDNO:84shmiR14-FWD5’-CTCATATTCATCTGCTTCTCT-3’SEQIDNO:85shmiR17-FWD5’-ATTCATCTGCTTCTCTACCTC-3’SEQIDNO:86QiagenmiScriptSYBRgreenPCR试剂盒中提供了反向引物。使用以下实时PCR条件:在95℃下初始变性15分钟,然后进行40个循环:94℃下15秒,55℃下30秒,以及70℃下30秒。通过扩增已知量的选择的shmiR产生这些测定的标准曲线,并所述标准曲线示于图10中。shmiR3图10B产生非线性标准曲线并根据所用的qPCR缓冲液而变化。基于333个C2C12细胞中10ng总RNA的估计计算每个细胞的RNA拷贝数。当单独表达时,针对shmiR3、shmiR13、shmiR14和shmiR17中的每一个测定每个细胞的shmiR拷贝数。如图11所示,对于shmiR3、13、14和17,用shmiR载体转导的C2C12细胞中的单独的shRNA表达水平估计分别为51,663个、13,826个、11,576个和14,791个拷贝。实施例7-用于同时进行内源性PABPN1的基因沉默和利用密码子优化的PABPN1的替换的载体的产生。为了指导同时进行内源性野生型PABN1wtPABN1的基因沉默和利用密码子优化的PABPN1coPABN1的替换,产生表达一种或多种选择的shmiR与optPABPN1序列的组合的单链腺相关病毒2型ssAAV2质粒。在图12A和12B中呈现了两种替代构建体通过将靶向wtPABPN1的两种shmiR亚克隆到pAAV2载体主链中的optPABPN1转录物的3'非翻译区中来产生第一个构建体,形式2图12A。optPABPN1和两种shmiR在单个转录物中的表达由肌肉特异性启动子Spc512驱动。通过将靶向wtPABPN1的两种shmiR亚克隆到optPABPN1转录物的上游序列中来产生第二个构建体,形式1图12B。在该构建体中,表达两种转录物,第一种编码在CK8启动子控制下的两种shmiR,第二种编码在Spc512启动子下的optPABPN1。产生重组假型化的AAV载体原种。简言之,将HEK293T细胞在细胞工厂于补充有10%FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基中培养,并在37℃和5%CO2下孵育。按照制造商的说明,将如本实施例中所述的pAAV-shmiR病毒质粒以及pAAVhelper和pAAVrepcap8质粒或pAAVhelper和pAAVrepcap9质粒与磷酸钙复合。然后在HEK293T细胞中用pAAV-shmiR质粒中的每种与pAAVhelper和pAAVrepcap8或pAAVrepcap9的组合进行三重转染Triple-transfection。将HEK293T细胞在37℃和5%CO2下培养72小时,然后裂解细胞,并通过碘克沙醇Sigma-Aldrich不连续梯度超速离心,随后进行氯化铯超速离心来纯化每种病毒质粒的表达ssAAVshmiR的颗粒。通过定量聚合酶链式反应Q-PCR定量载体基因组的数量。实施例8-OPMD的鼠模型中的体内功效研究。动物在最常见的OPMD鼠模型A17小鼠模型中进行临床前功效研究。通过过表达牛扩增的17个丙氨酸残基PABPN1,在FvB背景中产生该小鼠模型。将该突变型PABPN1在骨骼肌中的表达置于人α肌动蛋白肌肉特异性启动子HSA1的控制之下。两种内源性鼠PABPN1等位基因都是功能性的并且表达正常的鼠PABPN1。因此,小鼠表型是由突变型PABPN1相对于正常蛋白的过表达而导致的。最重要的是,A17小鼠显示出OPMD的许多临床体征,包括核内包涵体INI的存在、纤维化和肌肉力量的丧失。体内小鼠功效研究集中在胫骨前肌TA肌肉的给药和分析上,这些肌肉属于可被容易地操作和或从小鼠中分离的最大肌肉,使得更容易观察表型改善。治疗选择腺相关病毒血清型9AAV9衣壳用于通过局部肌内注射施用重组表达构建体。除了AAV9以外,还测试了许多不同血清型的AAV衣壳,包括AAV8、AAVRh74。使用重组AAV9构建体评估肌肉转导,所述重组AAV9构建体在Spc512合成肌肉启动子AAV9-eGFP的控制下表达荧光蛋白GFP。以2e11总载体基因组的剂量向来自两种性别的小鼠的每个TA肌肉中注射50μl单链载体。20天后,处死小鼠并通过体内成像检查注射的肢体。结果如图13所示,用AAV9-eGFP构建体直接注射TA肌肉导致在肢体中检测到显著量的局部荧光,表明该载体在转导肌细胞和在直接注射后导致转基因表达方面均是有效的。实施例9-用于同时进行内源性PABPN1的基因沉默和利用密码子优化的PABPN1的替换的单一“沉默和替换构建体”的产生。产生了表达shmiR17和shmiR13例如,如表3和表4中所述与optPABPN1序列的组合的单链腺相关病毒2型ssAAV2质粒。通过将编码shmiR17和shmiR13的DNA序列如表4中所述亚克隆到pAAV2载体主链中的optPABPN1转录物的3'非翻译区中pAAV-shmiR病毒质粒来产生沉默和替换构建体下文称为“SR构建体”。optPABPN1和两种shmiR在单个转录物中的表达由肌肉特异性启动子Spc512驱动。图14中提供了SR构建体的示意图。然后产生重组假型化的AAV载体原种。简言之,将HEK293T细胞在细胞工厂于补充有10%FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基中培养,并在37℃和5%CO2下孵育。按照制造商的说明,将pAAV-shmiR病毒质粒以及pAAVhelper和pAAVrepcap8质粒或pAAVhelper和pAAVrepcap9或pAAVhelper和pAAVRH74质粒与磷酸钙复合。然后在HEK293T细胞中用pAAV-shmiR质粒与pAAVhelper和以下衣壳之一的组合进行三重转染:pAAVrepcap8、pAAVrepcap9或pAAVRH74。然后将HEK293T细胞在37℃和5%CO2下培养72小时,之后裂解细胞,并通过碘克沙醇Sigma-Aldrich不连续梯度超速离心,随后进行氯化铯超速离心来纯化表达ssAAVshmiR的颗粒。通过定量聚合酶链式反应Q-PCR定量载体基因组的数量。实施例10-使用单一载体“沉默和替换”方法的体内功效研究。治疗为了在OPMD的相关疾病模型中测试实施例9中描述的SR构建体的体内功效,通过肌内注射将SR构建体单独地以高剂量和低剂量施用到10-12周龄A17小鼠的TA肌肉中。低剂量设定为1x1010个载体基因组肌肉。低剂量设定为6x1010个载体基因组肌肉。注射盐水的年龄匹配的A17小鼠作为未处理组,而FVB野生型小鼠也被包括作为健康比较者。除了检查不同剂量的SR构建体对疾病的影响以外,在处理后14或20周处死单独的小鼠群组以评估与不同时间点相关的功效。在处死时,收获TA肌肉并提取RNA和蛋白质。qPCR分析为了验证PABPN1水平的敲低,通过QPCR分析评估从TA肌肉分离的RNA。使用的QPCR引物不能区分野生型PABPN1与突变型PABPN1转录物,但不识别或扩增对应于密码子优化的PABPN1种类的序列。对于高剂量和低剂量的SR构建体,均观察到强劲的敲低,分别导致88.3%和68.3%的PABPN1转录物减少图15。来自这些组织的额外分析证明了shmiR转基因以与不同的施用的载体水平一致的比率存在。类似地,将使用可选择性扩增密码子优化的PABPN1序列并区分正常野生型与突变型PABPN1序列的一组引物的QPCR分析用于验证密码子优化的PABPN1部分的表达。这些QPCR分析表明,施用了SR构建体的动物在高剂量和低剂量下分别表达了平均为FvB小鼠中正常PABPN1水平的90.9%和13.7%的密码子优化的PABPN1水平图16。结合起来,所述分析证实单个转录物可以产生功能性shmiR,其能够在A17小鼠模型中敲低PABPN1包括突变形式水平。同样地,这些载体同时产生足够水平的密码子优化的PABPN1作为替代物以恢复PABPN1功能。核内包涵体INI在第14周动物中测试了SR构建体对核内包涵体INI的持久性的影响。从图17中可以明显看出,A17小鼠中所有TA肌细胞的近35%显示出代表INI的绿色点状染色。将红色层粘连蛋白肌细胞的细胞外基质中的丰富蛋白质和蓝色DAPI复染色分别用于界定细胞形状和细胞核图18。通过一系列连续切片,利用高剂量和低剂量SR构建体的处理显示INI的显著减少。肌肉重量在第20周动物中测试了SR构建体对肌肉重量恢复的影响。来自A17小鼠的TA肌肉细胞比来自它们的FvB野生型对应物的类似肌肉少约25%。在两种测试剂量下,SR构建体显示肌肉重量显著恢复至接近FVB动物的野生型水平图19。肌肉力量最后,通过最大力测量评估SR构建体对第20周动物的肌肉力量恢复的影响。使用150mHz频率作为校准点,A17小鼠的最大力在1050nm对比1500nm时比其野生型FvB对应者分别小约30%。利用SR构建体的处理导致最大力的适度增加,使A17小鼠对比FVB野生型动物中记录的减小的力量差异恢复大约66%图20。图20中的统计显示为相对于A17盐水小鼠的非配对t检验*pBenitecBiopharmaLimited用于治疗眼咽肌营养不良症OPMD的试剂及其用途180511US62434,3122016-12-1486PatentInversion3.5128RNA智人Homosapiens1gagaagcagaugaauaugaguccaccuc28228RNA智人Homosapiens2gaacgagguagagaagcagaugaauaug28328RNA智人Homosapiens3gaagcugagaagcuaaaggagcuacaga28428RNA智人Homosapiens4gggcuagagcgacaucaugguauucccc28528RNA智人Homosapiens5cugugugacaaauuuaguggccauccca28628RNA智人Homosapiens6gacuauggugcaacagcagaagagcugg28728RNA智人Homosapiens7cgagguagagaagcagaugaauaugagu28828RNA智人Homosapiens8cagugguuuuaacagcaggccccggggu28928RNA智人Homosapiens9agagcgacaucaugguauuccccuuacu281028RNA智人Homosapiens10gguagagaagcagaugaauaugagucca281128RNA智人Homosapiens11auugaggagaagauggaggcugaugccc281228RNA智人Homosapiens12ggaggaagaagcugagaagcuaaaggag281328RNA智人Homosapiens13aacgagguagagaagcagaugaauauga281420RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR2的效应序列14agcagaugaauaugagucca201521RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR的效应互补序列215uggacucauauucaucugcuu211620RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR的效应序列316gagguagagaagcagaugaa201721RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR3的效应互补序列17uucaucugcuucucuaccucg211820RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR4的效应序列18cugagaagcuaaaggagcua201921RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR4的效应互补序列19uagcuccuuuagcuucucagc212020RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR5的效应序列20uagagcgacaucaugguauu202121RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR5的效应互补序列21aauaccaugaugucgcucuag212220RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR6的效应序列22gugacaaauuuaguggccau202321RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR6的效应互补序列23auggccacuaaauuugucaca212420RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR7的效应序列24auggugcaacagcagaagag202521RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR7的效应互补序列25cucuucugcuguugcaccaua212620RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR9的效应序列26guagagaagcagaugaauau202721RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR9的效应互补序列27auauucaucugcuucucuacc212820RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR11的效应序列28gguuuuaacagcaggccccg202921RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR11的效应互补序列29cggggccugcuguuaaaacca213020RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR13的效应序列30cgacaucaugguauuccccu203121RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR13的效应互补序列31aggggaauaccaugaugucgc213220RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR14的效应序列32gagaagcagaugaauaugag203321RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR14的效应互补序列33cucauauucaucugcuucucu213420RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR15的效应序列34aggagaagauggaggcugau203521RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR15的效应互补序列35aucagccuccaucuucuccuc213620RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR16的效应序列36gaagaagcugagaagcuaaa203721RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR16的效应互补序列37uuuagcuucucagcuucuucc213820RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR17的效应序列38agguagagaagcagaugaau203921RNA人工序列ArtificialsequenceshmiR17的效应互补序列39auucaucugcuucucuaccuc214018RNA人工序列Artificialsequence茎环40acugugaagcagaugggu184126RNA人工序列Artificialsequencepri-miRNA主链的5'侧翼序列misc_feature26..26n为u或a41gguauauugcuguugacagugagcgn264222RNA人工序列Artificialsequencepri-miRNA主链的3'侧翼序列42cgccuacugccucggacuucaa2243107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR2的RNA序列43gguauauugcuguugacagugagcguagcagaugaauaugaguccaacugugaagcagau60ggguuggacucauauucaucugcuucgccuacugccucggacuucaa10744107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR3的RNA序列44gguauauugcuguugacagugagcgagagguagagaagcagaugaaacugugaagcagau60ggguuucaucugcuucucuaccucgcgccuacugccucggacuucaa10745107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR4的RNA序列45gguauauugcuguugacagugagcgacugagaagcuaaaggagcuaacugugaagcagau60ggguuagcuccuuuagcuucucagccgccuacugccucggacuucaa10746107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR5的RNA序列46gguauauugcuguugacagugagcgauagagcgacaucaugguauuacugugaagcagau60ggguaauaccaugaugucgcucuagcgccuacugccucggacuucaa10747107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR6的RNA序列47gguauauugcuguugacagugagcgagugacaaauuuaguggccauacugugaagcagau60ggguauggccacuaaauuugucacacgccuacugccucggacuucaa10748107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR7的RNA序列48gguauauugcuguugacagugagcgaauggugcaacagcagaagagacugugaagcagau60gggucucuucugcuguugcaccauacgccuacugccucggacuucaa10749107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR9的RNA序列49gguauauugcuguugacagugagcgaguagagaagcagaugaauauacugugaagcagau60ggguauauucaucugcuucucuacccgccuacugccucggacuucaa10750107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR11的RNA序列50gguauauugcuguugacagugagcgagguuuuaacagcaggccccgacugugaagcagau60gggucggggccugcuguuaaaaccacgccuacugccucggacuucaa10751107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR13的RNA序列51gguauauugcuguugacagugagcgacgacaucaugguauuccccuacugugaagcagau60ggguaggggaauaccaugaugucgccgccuacugccucggacuucaa10752107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR14的RNA序列52gguauauugcuguugacagugagcgugagaagcagaugaauaugagacugugaagcagau60gggucucauauucaucugcuucucucgccuacugccucggacuucaa10753107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR15的RNA序列53gguauauugcuguugacagugagcgaaggagaagauggaggcugauacugugaagcagau60ggguaucagccuccaucuucuccuccgccuacugccucggacuucaa10754107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR16的RNA序列54gguauauugcuguugacagugagcgagaagaagcugagaagcuaaaacugugaagcagau60ggguuuuagcuucucagcuucuucccgccuacugccucggacuucaa10755107RNA人工序列Artificialsequence编码shmiR17的RNA序列55gguauauugcuguugacagugagcgaagguagagaagcagaugaauacugugaagcagau60ggguauucaucugcuucucuaccuccgccuacugccucggacuucaa10756107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR2的DNA序列56ggtatattgctgttgacagtgagcgtagcagatgaatatgagtccaactgtgaagcagat60gggttggactcatattcatctgcttcgcctactgcctcggacttcaa10757107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR3的DNA序列57ggtatattgctgttgacagtgagcgagaggtagagaagcagatgaaactgtgaagcagat60gggtttcatctgcttctctacctcgcgcctactgcctcggacttcaa10758107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR4的DNA序列58ggtatattgctgttgacagtgagcgactgagaagctaaaggagctaactgtgaagcagat60gggttagctcctttagcttctcagccgcctactgcctcggacttcaa10759107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR5的DNA序列59ggtatattgctgttgacagtgagcgatagagcgacatcatggtattactgtgaagcagat60gggtaataccatgatgtcgctctagcgcctactgcctcggacttcaa10760107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR6的DNA序列60ggtatattgctgttgacagtgagcgagtgacaaatttagtggccatactgtgaagcagat60gggtatggccactaaatttgtcacacgcctactgcctcggacttcaa10761107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR7的DNA序列61ggtatattgctgttgacagtgagcgaatggtgcaacagcagaagagactgtgaagcagat60gggtctcttctgctgttgcaccatacgcctactgcctcggacttcaa10762107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR9的DNA序列62ggtatattgctgttgacagtgagcgagtagagaagcagatgaatatactgtgaagcagat60gggtatattcatctgcttctctacccgcctactgcctcggacttcaa10763107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR11的DNA序列63ggtatattgctgttgacagtgagcgaggttttaacagcaggccccgactgtgaagcagat60gggtcggggcctgctgttaaaaccacgcctactgcctcggacttcaa10764107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR13的DNA序列64ggtatattgctgttgacagtgagcgacgacatcatggtattcccctactgtgaagcagat60gggtaggggaataccatgatgtcgccgcctactgcctcggacttcaa10765107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR14的DNA序列65ggtatattgctgttgacagtgagcgtgagaagcagatgaatatgagactgtgaagcagat60gggtctcatattcatctgcttctctcgcctactgcctcggacttcaa10766107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR15的DNA序列66ggtatattgctgttgacagtgagcgaaggagaagatggaggctgatactgtgaagcagat60gggtatcagcctccatcttctcctccgcctactgcctcggacttcaa10767107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR16的DNA序列67ggtatattgctgttgacagtgagcgagaagaagctgagaagctaaaactgtgaagcagat60gggttttagcttctcagcttcttcccgcctactgcctcggacttcaa10768107DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR17的DNA序列68ggtatattgctgttgacagtgagcgaaggtagagaagcagatgaatactgtgaagcagat60gggtattcatctgcttctctacctccgcctactgcctcggacttcaa107692532DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR3、shmiR14和密码子优化的PABPN1的双重表达构建体形式169cgatcgcgcgcagatctgtcatgatgatcctagcatgctgcccatgtaaggaggcaaggc60ctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgccccccccccc120ccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgcatgccatgttcccggcgaagggccagct180gtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttgg240ggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcac300ggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagc360ccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgc420cctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcgtcgat480cattgaagttactattccgaagttcctattctctagaattcgccaccacgcgtggtatat540tgctgttgacagtgagcgagaggtagagaagcagatgaaactgtgaagcagatgggtttc600atctgcttctctacctcgcgcctactgcctcggacttcaaatcatctactccatggccct660ctgcgtttgctgaagacagaaccgcaaagcaggacccgacaggattctccccgcctcttc720agagactatgtttacaagatatcggtatattgctgttgacagtgagcgtgagaagcagat780gaatatgagactgtgaagcagatgggtctcatattcatctgcttctctcgcctactgcct840cggacttcaagtcgacgctagcaataaaggatcctttattttcattggatccgtgtgttg900gttttttgtgtgcggttaattaaggtacccgagctccaccgcggtggcggccgtccgccc960tcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatt1020tttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctctaaaaataactcccg1080ggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcaccc1140gtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgc1200tcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggagga1260gcgggaggcgccaagctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatgccac1320catggccgctgccgccgctgctgctgccgcagccggcgctgccggcggaagaggcagcgg1380ccctggcagacggcggcatctggtccctggcgccggaggggaggccggcgaaggcgcccc1440tggcggagccggcgactacggcaacggcctggaaagcgaggaactggaacccgaggaact1500gctgctggaacctgagcccgagccagagcccgaggaagagccccctaggccaagagcccc1560ccctggcgccccaggaccaggaccaggctctggggcaccaggctctcaggaagaggaaga1620agagcccggcctcgtcgagggagacccaggcgatggcgctatcgaagatcccgagctgga1680agccatcaaggccagagtgcgggagatggaa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aagccggttctacagcggcttcaattctcggcctagag1260gcagagtgtaccggggcagggccagggccacctcctggtacagcccctactgatgacata1320tgacgcgtggtatattgctgttgacagtgagcgagaggtagagaagcagatgaaactgtg1380aagcagatgggtttcatctgcttctctacctcgcgcctactgcctcggacttcaaatcat1440ctactccatggccctctgcgtttgctgaagacagaaccgcaaagcaggacccgacaggat1500tctccccgcctcttcagagactatgtttacaagatatcggtatattgctgttgacagtga1560gcgtgagaagcagatgaatatgagactgtgaagcagatgggtctcatattcatctgcttc1620tctcgcctactgcctcggacttcaagtcgacgctagcaataaaggatcctttattttcat1680tggatccgtgtgttggttttttgtgtgcggttaattaactgtgccttctagttgccagcc1740atctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgt1800cctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattct1860ggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgc1920tggggatgcggtgggctctatgg1943721943DNA人工序列Artificialsequence编码shmiR17、shmiR13和密码子优化的PABPN1的双重表达构建体形式272cgagctccaccgcggtggcggccgtccgccctcggcaccatcctcacgacacccaaatat60ggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggca120gcaggtgttggcgctctaaaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtg180gacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggc240cggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggg300gccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagctctagaactagtg360gatcccccgggctgcaggaattcgatgccaccatggccgctgccgccgctgctgctgccg420cagccggcgctgccggcggaagaggcagcggccctggcagacggcggcatctggtccctg480gcgccggaggggaggccggcgaaggcgcccctggcggagccggcgactacggcaacggcc540tggaaagcgaggaactggaacccgaggaactgctgctggaacctgagcccgagccagagc600ccgaggaagagccccctaggccaagagccccccctggcgccccaggaccaggaccaggct660ctggggcaccaggctctcaggaagaggaagaagagcccggcctcgtcgagggagacccag720gcgatggcgctatcgaagatcccgagctggaagccatcaaggccagagtgcgggagatgg780aagaggaggccgaaaaattgaaagagctgcagaacgaagtcgaaaaacaaatgaacatgt840ccccccctcctggaaatgctggccctgtgatcatgagcatcgaggaaaagatggaagccg900acgcccggtctatctacgtgggcaacgtggactacggcgccaccgccgaagaactggaag960cccactttcacggctgtggcagcgtgaaccgggtgaccatcctgtgcgacaagttcagcg1020gccaccccaagggcttcgcctacatcgagttcagcgacaaagaaagcgtgcggacctctc1080tggctctcgacgagtctctgttcaggggaaggcagatcaaggtcatccccaagcggacca1140acaggcccggcatcagcaccaccgacagaggcttccctagggctaggtacagagcccgga1200ccaccaactacaacagcagcagaagccggttctacagcggcttcaattctcggcctagag1260gcagagtgtaccggggcagggccagggccacctcctggtacagcccctactgatgacata1320tgacgcgtggtatattgctgttgacagtgagcgaaggtagagaagcagatgaatactgtg1380aagcagatgggtattcatctgcttctctacctccgcctactgcctcggacttcaaatcat1440ctactccatggccctctgcgtttgctgaagacagaaccgcaaagcaggacccgacaggat1500tctccccgcctcttcagagactatgtttacaagatatcggtatattgctgttgacagtga1560gcgacgacatcatggtattcccctactgtgaagcagatgggtaggggaataccatgatgt1620cgccgcctactgcctcggacttcaagtcgacgctagcaataaaggatcctttattttcat1680tggatccgtgtgttggttttttgtgtgcggttaattaactgtgccttctagttgccagcc1740atctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgt1800cctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattct1860ggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgc1920tggggatgcggtgggctctatgg194373921DNA人工序列Artificialsequence人密码子优化的PABPN1cDNA序列73atggccgctgccgccgctgctgctgccgcagccggcgctgccggcggaagaggcagcggc60cctggcagacggcggcatctggtccctggcgccggaggggaggccggcgaaggcgcccct120ggcggagccggcgactacggcaacggcctggaaagcgaggaactggaacccgaggaactg180ctgctggaacctgagcccgagccagagcccgaggaagagccccctaggccaagagccccc240cctggcgccccaggaccaggaccaggctctggggcaccaggctctcaggaagaggaagaa300gagcccggcctcgtcgagggagacccaggcgatggcgctatcgaagatcccgagctggaa360gccatcaaggccagagtgcgggagatggaagaggaggccgaaaaattgaaagagctgcag420aacgaagtcgaaaaacaaatgaacatgtccccccctcctggaaatgctggccctgtgatc480atgagcatcgaggaaaagatggaagccgacgcccggtctatctacgtgggcaacgtggac540tacggcgccaccgccgaagaactggaagcccactttcacggctgtggcagcgtgaaccgg600gtgaccatcctgtgcgacaagttcagcggccaccccaagggcttcgcctacatcgagttc660agcgacaaagaaagcgtgcggacctctctggctctcgacgagtctctgttcaggggaagg720cagatcaaggtcatccccaagcggaccaacaggcccggcatcagcaccaccgacagaggc780ttccctagggctaggtacagagcccggaccaccaactacaacagcagcagaagccggttc840tacagcggcttcaattctcggcctagaggcagagtgtaccggggcagggccagggccacc900tcctggtacagcccctactga92174306PRT人工序列Artificialsequence人野生型PABPN1氨基酸序列74MetAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyAlaAlaGlyGly151015ArgGlySerGlyProGlyArgArgArgHisLeuValProGlyAlaGly202530GlyGluAlaGlyGluGlyAlaProGlyGlyAlaGlyAspTyrGlyAsn354045GlyLeuGluSerGluGluLeuGluProGluGluLeuLeuLeuGluPro505560GluProGluProGluProGluGluGluProProArgProArgAlaPro65707580ProGlyAlaProGlyProGlyProGlySerGlyAlaProGlySerGln859095GluGluGluGluGluProGlyLeuValGluGlyAspProGlyAspGly100105110AlaIleGluAspProGluLeuGluAlaIleLysAlaArgValArgGlu115120125MetGluGluGluAlaGluLysLeuLysGluLeuGlnAsnGluValGlu130135140LysGlnMetAsnMetSerProProProGlyAsnAlaGlyProValIle145150155160MetSerIleGluGluLysMetGluAlaAspAlaArgSerIleTyrVal165170175GlyAsnValAspTyrGlyAlaThrAlaGluGluLeuGluAlaHisPhe180185190HisGlyCysGlySerValAsnArgValThrIleLeuCysAspLysPhe195200205SerGlyHisProLysGlyPheAlaTyrIleGluPheSerAspLysGlu210215220SerValArgThrSerLeuAlaLeuAspGluSerLeuPheArgGlyArg225230235240GlnIleLysValIleProLysArgThrAsnArgProGlyIleSerThr245250255ThrAspArgGlyPheProArgAlaArgTyrArgAlaArgThrThrAsn260265270TyrAsnSerSerArgSerArgPheTyrSerGlyPheAsnSerArgPro275280285ArgGlyArgValTyrArgGlyArgAlaArgAlaThrSerTrpTyrSer290295300ProTyr30575314PRT人工序列Artificialsequence人野生型PABPN1氨基酸序列具有FLAG标签75MetAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyAlaAlaGlyGly151015ArgGlySerGlyProGlyArgArgArgHisLeuValProGlyAlaGly202530GlyGluAlaGlyGluGlyAlaProGlyGlyAlaGlyAspTyrGlyAsn354045GlyLeuGluSerGluGluLeuGluProGluGluLeuLeuLeuGluPro505560GluProGluProGluProGluGluGluProProArgProArgAlaPro65707580ProGlyAlaProGlyProGlyProGlySerGlyAlaProGlySerGln859095GluGluGluGluGluProGlyLeuValGluGlyAspProGlyAspGly100105110AlaIleGluAspProGluLeuGluAlaIleLysAlaArgValArgGlu115120125MetGluGluGluAlaGluLysLeuLysGluLeuGlnAsnGluValGlu130135140LysGlnMetAsnMetSerProProProGlyAsnAlaGlyProValIle145150155160MetSerIleGluGluLysMetGluAlaAspAlaArgSerIleTyrVal165170175GlyAsnValAspTyrGlyAlaThrAlaGluGluLeuGluAlaHisPhe180185190HisGlyCysGlySerValAsnArgValThrIleLeuCysAspLysPhe195200205SerGlyHisProLysGlyPheAlaTyrIleGluPheSerAspLysGlu210215220SerValArgThrSerLeuAlaLeuAspGluSerLeuPheArgGlyArg225230235240GlnIleLysValIleProLysArgThrAsnArgProGlyIleSerThr245250255ThrAspArgGlyPheProArgAlaArgTyrArgAlaArgThrThrAsn260265270TyrAsnSerSerArgSerArgPheTyrSerGlyPheAsnSerArgPro275280285ArgGlyArgValTyrArgGlyArgAlaArgAlaThrSerTrpTyrSer290295300ProTyrAspTyrLysAspAspAspAspLys30531076314PRT人工序列Artificialsequence人密码子优化的PABPN1氨基酸序列具有FLAG-标签76MetAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyAlaAlaGlyGly151015ArgGlySerGlyProGlyArgArgArgHisLeuValProGlyAlaGly202530GlyGluAlaGlyGluGlyAlaProGlyGlyAlaGlyAspTyrGlyAsn354045GlyLeuGluSerGluGluLeuGluProGluGluLeuLeuLeuGluPro505560GluProGluProGluProGluGluGluProProArgProArgAlaPro65707580ProGlyAlaProGlyProGlyProGlySerGlyAlaProGlySerGln859095GluGluGluGluGluProGlyLeuValGluGlyAspProGlyAspGly100105110AlaIleGluAspProGluLeuGluAlaIleLysAlaArgValArgGlu115120125MetGluGluGluAlaGluLysLeuLysGluLeuGlnAsnGluValGlu130135140LysGlnMetAsnMetSerProProProGlyAsnAlaGlyProValIle145150155160MetSerIleGluGluLysMetGluAlaAspAlaArgSerIleTyrVal165170175GlyAsnValAspTyrGlyAlaThrAlaGluGluLeuGluAlaHisPhe180185190HisGlyCysGlySerValAsnArgValThrIleLeuCysAspLysPhe195200205SerGlyHisProLysGlyPheAlaTyrIleGluPheSerAspLysGlu210215220SerValArgThrSerLeuAlaLeuAspGluSerLeuPheArgGlyArg225230235240GlnIleLysValIleProLysArgThrAsnArgProGlyIleSerThr245250255ThrAspArgGlyPheProArgAlaArgTyrArgAlaArgThrThrAsn260265270TyrAsnSerSerArgSerArgPheTyrSerGlyPheAsnSerArgPro275280285ArgGlyArgValTyrArgGlyArgAlaArgAlaThrSerTrpTyrSer290295300ProTyrAspTyrLysAspAspAspAspLys3053107720DNA人工序列ArtificialsequencewtPABPN1-Fwd引物77atggtgcaacagcagaagag207820DNA人工序列ArtificialsequencewtPABPN1-Rev引物78ctttgggatggccactaaat207923DNA人工序列ArtificialsequencewtPABPN1-探针79cggttgactgaaccacagccatg238019DNA人工序列ArtificialsequenceoptPABPN1-For引物80accgacagaggcttcccta198121DNA人工序列ArtificialsequenceoptPABPN1-Rev引物81ttctgctgctgttgtagttgg218223DNA人工序列ArtificialsequenceoptPABPN1-探针82tggtccgggctctgtacctagcc238321DNA人工序列ArtificialsequenceshmiR3-Fwd引物83ttcatctgcttctctacctcg218421DNA人工序列ArtificialsequenceshmiR13-Fwd引物84aggggaataccatgatgtcgc218521DNA人工序列ArtificialsequenceshmiR14-Fwd引物85ctcatattcatctgcttctct218621DNA人工序列ArtificialsequenceshmiR17-Fwd引物86attcatctgcttctctacctc21

权利要求:1.一种包含编码短发夹微RNAshmiR的DNA序列的核酸,所述shmiR包含:长度为至少17个核苷酸的效应序列:效应互补序列;茎环序列;和一级微RNApri-miRNA主链;其中所述效应序列与SEQIDNO:1-13中的任一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。2.根据权利要求1所述的核酸,其中所述shmiR选自由以下组成的组:包含SEQIDNO:15中所示的效应序列和SEQIDNO:14中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:19中所示的效应序列和SEQIDNO:18中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:21中所示的效应序列和SEQIDNO:20中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:23中所示的效应序列和SEQIDNO:22中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:25中所示的效应序列和SEQIDNO:24中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:27中所示的效应序列和SEQIDNO:26中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:29中所示的效应序列和SEQIDNO:28中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:35中所示的效应序列和SEQIDNO:34中所示的效应互补序列的shmiR;包含SEQIDNO:37中所示的效应序列和SEQIDNO:36中所示的效应互补序列的shmiR;和包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38中所示的效应互补序列的shmiR。3.根据权利要求1或2所述的核酸,其中所述shmiR在5’至3’方向上包含:所述pri-miRNA主链的5’侧翼序列;所述效应互补序列;所述茎环序列;所述效应序列;以及所述pri-miRNA主链的3’侧翼序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸,其中所述茎环序列是SEQIDNO:40中所示的序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸,其中所述pri-miRNA主链是pri-miR-30a主链。6.根据权利要求3至5中任一项所述的核酸,其中所述pri-miRNA主链的5’侧翼序列示于SEQIDNO:41中,并且所述pri-miRNA主链的3’侧翼序列示于SEQIDNO:42中。7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸,其中所述shmiR包含SEQIDNO:43-55中的任一个中所示的序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸,其中编码所述shmiR的所述DNA序列示于SEQIDNO:56-68中的任一个中。9.多种核酸,其包括:a至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的核酸;和b至少一种选自以下的另外的核酸:i根据权利要求1至8中任一项所述的核酸;或ii包含编码shmiR或短发夹RNAshRNA的DNA序列的核酸,所述shmiR或短发夹RNA包含长度为至少17个核苷酸的效应序列和效应互补序列,其中所述效应序列与对应于导致眼咽肌营养不良症OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物基本上互补;其中由a的所述核酸编码的所述shmiR和由b的所述核酸编码的所述shmiR或shRNA包含不同的效应序列。10.一种DNA介导的RNA干扰ddRNAi构建体,其包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸或根据权利要求9所述的多种核酸。11.根据权利要求10所述的ddRNAi构建体,其包含至少两种根据权利要求1至8中任一项所述的核酸,其中每种所述核酸编码不同的shmiR。12.根据权利要求11所述的ddRNAi构建体,其中所述至少两种核酸中的每一种编码shmiR,所述shmiR包含与SEQIDNO:1、2、4、7、9、10和13中的一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列。13.根据权利要求11或12所述的ddRNAi构建体,其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组:包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:15中所示的效应序列和SEQIDNO:14shmiR2中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:21中所示的效应序列和SEQIDNO:20shmiR5中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:27中所示的效应序列和SEQIDNO:26shmiR9中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列;和包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。14.根据权利要求13所述的ddRNAi构建体,其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组:包含SEQIDNO:56shmiR2中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:59shmiR5中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:62shmiR9中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;和包含SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。15.根据权利要求11至14中任一项所述的ddRNAi构建体,其中所述至少两种核酸中的每一种编码shmiR,所述shmiR包含与SEQIDNO:2、9、10和13中的一个中所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应序列。16.根据权利要求11至15中任一项所述的ddRNAi构建体,其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组:包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列;和包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。17.根据权利要求16所述的ddRNAi构建体,其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组:包含SEQIDNO:57shmiR3中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;包含SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸:包含SEQIDNO:65shmiR14中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;和包含SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。18.根据权利要求11至17中任一项所述的ddRNAi构建体,所述ddRNAi构建体包含:a包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:31中所示的效应序列和SEQIDNO:30shmiR13中所示的效应互补序列;和b包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:39中所示的效应序列和SEQIDNO:38shmiR17中所示的效应互补序列。19.根据权利要求18所述的ddRNAi构建体,所述ddRNAi构建体包含:a包含SEQIDNO:64shmiR13中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸;和b包含SEQIDNO:68shmiR17中所示的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸。20.根据权利要求11至17中任一项所述的ddRNAi构建体,所述ddRNAi构建体包含:a包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:17中所示的效应序列和SEQIDNO:16shmiR3中所示的效应互补序列;和b包含编码shmiR的DNA序列或由所述DNA序列组成的核酸,所述shmiR包含SEQIDNO:33中所示的效应序列和SEQIDNO:32shmiR14中所示的效应互补序列。21.根据权利要求20所述的ddRNAi构建体,所述ddRNAi构建体包含:a包含SEQIDNO:57shmiR3中所示的序列或由所述序列组成的核酸;和b包含SEQIDNO:65shmiR14中所示的序列或由所述序列组成的核酸。22.根据权利要求10至21中任一项所述的ddRNAi构建体,所述构建体在编码shmiR的所述核酸或每种编码shmiR的核酸的上游包含RNApolIII启动子。23.如权利要求22所述的ddRNAi构建体,其中所述RNApolIII启动子或每个RNApolIII启动子选自U6和H1启动子。24.如权利要求22或权利要求23所述的ddRNAi构建体,其中所述RNApolIII启动子或每个RNApolIII启动子是选自U6-9启动子、U6-1启动子和U6-8启动子的U6启动子。25.一种DNA构建体,其包含:a根据权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体;和bPABPN1构建体,其包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被所述ddRNAi构建体编码的一种或多种shmiR靶向。26.根据权利要求25所述的DNA构建体,其中对编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列进行密码子优化,使得其mRNA转录物不被所述ddRNAi构建体的所述shmiR靶向。27.根据权利要求25或26所述的DNA构建体,其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列示于SEQIDNO:73中。28.根据权利要求25至27中任一项所述的DNA构建体,其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列与包含在所述PABPN1构建体内并位于编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列的上游的启动子可操作地连接。29.根据权利要求28所述的DNA构建体,其中包含在所述PABPN1构建体内的所述启动子是肌肉特异性启动子。30.根据权利要求25至29中任一项所述的DNA构建体,其中所述DNA构建体在5'至3'方向上包含所述ddRNAi构建体和所述PABPN1构建体。31.根据权利要求25至29中任一项所述的DNA构建体,其中所述DNA构建体在5'至3'方向上包含所述PABPN1构建体和所述ddRNAi构建体。32.一种表达载体,其包含根据权利要求1至9中任一项所述的核酸或根据权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体或如权利要求25至31中任一项所述的DNA构建体。33.多种表达载体,其包括:a包含如权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体的表达载体;和b包含PABPN1构建体的表达载体,所述PABPN1构建体包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被所述ddRNAi构建体编码的所述一种或多种shmiR靶向。34.根据权利要求33所述的多种表达载体,其中对编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列进行密码子优化,使得其mRNA转录物不被所述ddRNAi构建体的所述shmiR靶向。35.根据权利要求33或34所述的多种表达载体,其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列示于SEQIDNO:73中。36.根据权利要求33至35中任一项所述的多种表达载体,其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列与包含在所述PABPN1构建体内并位于编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列的上游的启动子可操作地连接。37.根据权利要求36所述的多种表达载体,其中包含在所述PABPN1构建体内的所述启动子是肌肉特异性启动子。38.如权利要求32所述的表达载体或根据权利要求33至37中任一项所述的多种表达载体,其中所述表达载体或每种表达载体是质粒或微环。39.如权利要求32所述的表达载体或根据或权利要求33至37中任一项所述的多种表达载体,其中所述表达载体或每种表达载体是选自由腺相关病毒AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒AdV载体和慢病毒LV载体组成的组的病毒载体。40.一种组合物,其包含根据权利要求1至9中任一项所述的核酸,或根据权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体,或根据权利要求25至31中任一项所述的DNA构建体,或根据权利要求32或38或39中任一项所述的表达载体,或根据权利要求33至39中任一项所述的多种表达载体。41.根据权利要求40所述的组合物,其还包含一种或多种药学上可接受的载剂。42.一种抑制导致受试者的眼咽肌营养不良症OPMD的PABPN1蛋白的表达的方法,所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的核酸,或根据权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体,或根据权利要求25至31中任一项所述的DNA构建体,或根据权利要求32或38或39中任一项所述的表达载体,或根据权利要求33至39中任一项所述的多种表达载体,或根据权利要求40或41所述的组合物。43.一种治疗患有眼咽肌营养不良症OPMD的受试者的眼咽肌营养不良症的方法,所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的核酸,或根据权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体,或根据权利要求25至31中任一项所述的DNA构建体,或根据权利要求32或38或39中任一项所述的表达载体,或根据权利要求33至39中任一项所述的多种表达载体,或根据权利要求40或41所述的组合物。44.根据权利要求42或43所述的方法,其中所述方法包括向所述受试者一起、同时或连续地施用根据权利要求33至39中任一项所述的多种表达载体。45.一种试剂盒,其包括:a一种或多种用于抑制导致OPMD的PABPN1蛋白的表达的剂,所述一种或多种剂选自:i根据权利要求1至9中任一项所述的核酸;或ii根据权利要求10至24中任一项所述的ddRNAi构建体;或iii根据权利要求32或38或39中任一项所述的表达载体;或iv根据权利要求40或41所述的组合物;和b表达载体,其包含编码具有mRNA转录物的功能性PABPN1蛋白的DNA序列,所述mRNA转录物不被a的所述剂表达的shmiR靶向。46.根据权利要求45所述的试剂盒,其中对编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列进行密码子优化,使得其mRNA转录物不被a的所述剂编码的所述shmiR靶向。47.根据权利要求45或46所述的试剂盒,其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列示于SEQIDNO:73中。48.根据权利要求45至47中任一项所述的试剂盒,其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列与包含在所述表达载体内并位于编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列的上游的启动子可操作地连接。49.根据权利要求45至48中任一项所述的试剂盒,其包括根据权利要求33至39中任一项所述的多种表达载体,其中将所述多种表达载体中的a和b作为所述试剂盒的组分a和b提供。50.根据权利要求45至49中任一项所述的试剂盒,其用于根据权利要求42至44中任一项所述的方法治疗OPMD。

百度查询: 贝尼泰克知识产权控股股份有限公司 用于治疗眼咽肌营养不良症(OPMD)的试剂及其用途

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