申请/专利权人：宁波君健生物科技有限公司

申请日：2024-02-06

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN118048287A

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.06.04#实质审查的生效;2024.05.17#公开

摘要：本发明提供一种用于自复制mRNA生产的工程菌，该工程菌由如下方法构建获得：选择感受态细胞作为宿主细胞E.coliStable，E.coliStbl3，E.coliDH5α；用热激法将质粒转入至大肠杆菌感受态细胞Stable、Stbl3、DH5α；将转化后的菌液均匀涂布在有卡那霉素的LB固体培养基上，挑选出单菌落；采用平板计数法进行活率测定。该工程菌宿主细胞的选择上，选择大肠杆菌E.coli系作为宿主细胞，使得细胞更容易培养，高密度发酵成本更低，挑选优选克隆E.coliStbl3‑11和E.coliStbl3‑18进行3L体积质粒发酵，获得了E.coliStbl3‑18自复制mRNA工程菌，实现了该工程菌用于自复制mRNA质粒高稳定性，高质粒产量目的，为自复制mRNA制造奠定了很好的基础。

主权项：1.一种用于自复制mRNA生产的工程菌，其特征在于：该工程菌由如下方法构建获得：S1、感受态细胞的选择：选择感受态细胞E.coliStable，E.coliStbl3，E.coliDH5ɑ作为宿主细胞；S2、质粒转化：用热激法将质粒转入至大肠杆菌感受态细胞Stable、Stbl3、DH5α，以卡那霉素作为筛选抗性；S3、单菌落筛选：将转化后的菌液均匀涂布在有卡那霉素的LB固体培养基上，过夜培养，挑选出单菌落；S4、质粒扩增：将单菌落接种于含有卡那霉素的液体合成培养基中，进一步培养获得菌液，将菌液收集，利用试剂盒进行质粒提取；S5、质粒验证：将质粒进行酶切验证，由于限制性内切酶能特异性识别质粒序列的位点并进行切割，形成特定大小的片段，琼脂糖凝胶电泳分离后与理论大小进行比较，从而对质粒进行鉴别，质粒序列分析：采用sanger测序；S6、PolyA尾的检测，采用sanger测序法检测PolyA碱基A的个数；S7、分别取克隆甘油菌，以0.1‰和0.2‰的接种量接种至含50mLLB培养基Kan+的250mL摇瓶中，置摇床中培养14.5h，且培养温度为30℃，转速＝200rpm，将菌液和保护剂60％甘油以2:1的比例进行混匀，按照1mL管分装至1.8mL冻存管，置-70℃冰箱保存；S8、进行优选克隆发酵培养，利用无菌技术将大肠杆菌菌株接种到预定的培养基中，使用含有碳源葡萄糖甘油、氮源、无机盐和维生素的培养基，菌种在适当的温度、pH和搅拌条件下进行预培养；S9、进行发酵产品分析，该分析包括细胞生产情况监测、凝胶电泳检测、产量分析和超螺旋质粒纯度检测。

全文数据：

权利要求：

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