申请/专利权人：武汉大学深圳研究院

申请日：2024-03-30

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN118048439A

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844;C12Q1/6883;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.06.04#实质审查的生效;2024.05.17#公开

摘要：本发明公开了一种基于自催化滚环反应的核酸分析方法，属于分子检测领域。本发明在传统RCA反应基础上，通过在模板链中引入I‑R3DNAzyme自剪切单元，在单级RCA线性扩增基础上进行进一步信号放大，引发RCA与DNAzyme模块交叉激活，实现指数级信号扩增，由于扩增产物上有周期性排列的重复序列，为报告链提供足够的结合位点，这一自催化滚环扩增反应可以与不同的信号输出方式进行集成，将目标序列的输入转换为扩增的信号输出。本方法可以用于DNA与miRNA的体外检测，具有较高的灵敏性与特异性，并且可以实现两种miRNA的同时分析。本方法还可以用于不同种类细胞中两种miRNA的同时原位成像，为miRNA相关疾病的早期诊断与筛查提供有力工具。

主权项：1.一种基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法，其特征在于，包含如下步骤：1模板序列的设计：模板链Template由a、b、c三个部分组成，其中a区域与目标物序列互补，b区域与I-R3DNAzyme序列互补，c区域与信号输出单元序列互补；2模板链的合成：将模板链前体Pre-template，2μM与引物链Primer，4μM在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中进行慢退，形成含有切口结构的双链杂交体，加入连接酶T4DNAligase，4UμL进行16℃过夜孵育，生成连接产物Ligationproduct，接着将Ligationproduct转移至含有外切酶IExoI，0.5UμL和外切酶IIIExoIII，1UμL的甘氨酸缓冲液中，在37℃孵育2h，得到对应的模板链Template；上述方法中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液浓度为50mM，pH为7.5，含10mMMgCl2、1mMATP以及10mMDTT，所述的甘氨酸缓冲液浓度为67mM，pH为9.5，含6.7mMMgCl2以及10mMβ-ME；3基于自催化滚环扩增反应实现DNA的检测：其模板链前体Pre-template0以及引物链Primer0的核苷酸序列如SEQIDNO：1、5所示，在三羟基氨甲烷醋酸盐缓冲液中，将模板链Template0，40nM、dNTP100μM、phi29聚合酶0.6UμL、乙酸锌0.5mM与目标DNAPrimer0进行混合，在30℃孵育2h，随后加入2×SYBRGreenI染料，并使用荧光定量PCR仪进行荧光强度检测；或者，基于自催化滚环扩增反应实现miRNA的检测：在三羟基氨甲烷醋酸盐缓冲液中，将模板链Template，40nM、dNTP100μM、phi29聚合酶0.6UμL、乙酸锌0.5mM与目标miRNA进行混合，在30℃孵育2h，随后加入分子信标Beacon，200nM，混合液在90℃保持3min，接着快速降温至25℃并保持2h，并使用荧光光谱仪进行输出信号检测；上述方法中，所述的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液浓度为33mM，pH为7.9，含10mMMg-acetate、66mMK-acetate、0.1％vvTween20以及1mMDTT。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 武汉大学深圳研究院 一种基于自催化滚环扩增反应的核酸分析方法

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