龙图腾网&IPTOP
- 微信扫码登录
- 账号密码登录
- 短信登录/注册
申请/专利权人：南京理工大学
申请日：2022-11-16
公开（公告）日：2024-05-17
公开（公告）号：CN118048373A
主分类号：C12N15/70
分类号：C12N15/70;C12N15/54;C12N15/67
优先权：
专利状态码：在审-实质审查的生效
法律状态：2024.06.04#实质审查的生效;2024.05.17#公开
摘要：本发明公开了一种提高磷酸调节子传感器激酶PhoR的表达水平的方法。所述方法将编码PhoR蛋白的基因通过双酶切连接至重组的pET28a质粒中形成融合表达载体pCy002‑phoR，该融合表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明利用超级折叠绿色荧光蛋白正确折叠显示绿色荧光的特性，将其作为报告基因，监测PhoR蛋白的表达情况，同时超级折叠绿色荧光蛋白能够促进膜蛋白PhoR的溶解，进一步提高了膜蛋白PhoR的表达。此外，本发明通过优化表达菌株、诱导温度及诱导时间进一步提高了PhoR蛋白的表达水平。
主权项：1.提高磷酸调节子传感器激酶PhoR的表达水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，磷酸调节子传感器激酶PhoR的表达载体的构建：PCR扩增膜蛋白PhoR目的基因，使用NcoI和BamHI对目的片段和重组的pET28a质粒进行双酶切，回收酶切产物，再用T4连接酶将回收的目的基因片段和重组的pET28a质粒片段连接，得到表达质粒为pCy002-phoR，所述的pCy002-phoR包含：噬菌体T7启动子，大肠杆菌核糖体结合位点，NcoI序列CCATGG，如SEQIDNO.1所示的大肠杆菌膜蛋白PhoR序列，BamHI位点GGATCC，TEV蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC，NdeI酶切位点CATATG，如SEQIDNO.2所示的超级折叠绿色荧光蛋白编码序列，XhoI酶切位点CTCGAG，6个组氨酸位点以及T7终止子，pCy002-phoR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。步骤2，pCy002-phoR质粒的验证及克隆：将重组质粒pCy002-phoR转化至宿主大肠杆菌中，并涂布于含卡那霉素的琼脂平板中，挑选单克隆菌落进行菌落PCR验证及单、双酶切验证，使用碱裂解法提取验证正确的质粒并进行测序验证；步骤3，目的蛋白的诱导表达：将验证正确的质粒转化至大肠杆菌BL21DE3表达菌株中，使用IPTG大规模诱导表达融合蛋白，诱导时间为2-4h，诱导温度为30℃。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 南京理工大学 提高磷酸调节子传感器激酶PhoR的表达水平的方法
免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。
主营中国专利交易买卖与专利转让许可,高校科技成果推广与科技成果转化,知识产权运营管理与平台开发,科技人才专家库与科技猎头等科技服务
开放平台
担保交易
惠及多方
会员特惠
专属平台
适合多方
数据共享
功能齐全
皖公网安备 34010402703815号