申请/专利权人：中山大学中山眼科中心

申请日：2019-07-08

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN110643692B

主分类号：C12Q1/6869

分类号：C12Q1/6869

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.17#授权;2020.02.04#实质审查的生效;2020.01.03#公开

摘要：本发明公开了一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒。本发明通过对单个mRNA的两个末端添加标签序列，捕获富集后进行全转录组测序，通过对不同转录异构体的首尾结构的准确判断来判断全长转录本，这一新的研究策略可解决现有的技术问题，具有以下有益效果：1、提高全长转录本检测的灵敏性：由于靶向转录本的首尾末端区域检测，信号多集中在转录本的末端边缘位置，因此对全长转录本的检测度更高。2、简单易行，成本低：方法简单易行，适用面广泛，成本低。3、提高对转录本检测的准确性：本发明结合末端序列的标签序列以及数据分析算法的优化，可达到更高的准确性。

主权项：1.一种单细胞转录本异构体测序的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：a、细胞裂解：分离单细胞，利用裂解液对单细胞进行裂解，得到裂解产物，裂解液中含有带有A标签序列的oligodT；所述的含有带有A标签序列的oligodT是5’–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNNNNNNNNNNNN-NNNNNNNNNNT30VN-3′，前16个N为cellbarcode即CI，后10个N为UMI；b、利用逆转录酶对裂解产物进行逆转录，逆转录过程中，逆转录酶在逆转录形成的cDNA链3’末端添加上3个C碱基，这些C碱基与带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物匹配，达到模板转换，并通过所述的带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物末端的标签序列以及3个C碱基对转录cDNA的末端位置进行标注，带有标签序列的oligodT作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签，由此得到逆转录生成cDNA第一条链；所述的带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物是5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′；c、逆转录生成cDNA第一条链之后，通过ISPCR引物进行PCR扩增，即得到全长的转录组的cDNA，所述的ISPCR引物为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；d、全长扩增之后的cDNA，利用Tn5转座酶进行建库，cDNA片段化并加上测序通用接头，利用I5index引物和I7index引物进行PCR构建文库，进行测序，根据在逆转录的时候添加进去的3’和5’的标签序列提取出其对应的序列，提取出来的序列比对基因组，提取出唯一比对序列，然后将提取出来的数据，5’端的序列用CAGEr进行下游分析鉴定转录起始位点，3’端序列鉴定转录终止位点；其中A和B标签序列都为5′-GTGGTATCAACGCAGAGT-3′；所述的步骤a中的裂解液中含有TritonX-100、RNA酶抑制剂、带有A标签序列的oligodT和dNTPs；所述的步骤b中在逆转录反应体系中，添加了镁离子和甜菜碱；所述的步骤c中的PCR扩增是18次的有限循环，在合成第一条链后不经过纯化，直接用KAPAHiFiHotStartReadymix直接PCR扩增；所述的I5index引物的序列如下：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGGTATCAACGCAGAGT-3'；所述的I7index引物的序列如下：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG-3'。

全文数据：

权利要求：

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