申请/专利权人：华中农业大学

申请日：2022-07-13

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN115261324B

主分类号：C12N5/0793

分类号：C12N5/0793

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.17#授权;2022.11.18#实质审查的生效;2022.11.01#公开

摘要：本发明公开了一种鱼类嗅觉神经元的培养方法，该方法将获取的团头鲂嗅囊组织置于PBS缓冲液中剥离边缘黏膜、清洗；向嗅囊组织中加入AIM消毒液，密封后放入冰上消毒，离心后向沉淀组织中加入胰蛋白酶‑EDTA消化液消化，之后加入中和培养基、离心；加入胶原酶工作液，缓慢吹打，再加入中和培养基，离心收集细胞上清液；将收集的细胞液过滤、离心、收集细胞沉淀，然后用中和培养基清洗、离心，加入生长培养基重悬浮，得到细胞悬液；将细胞悬液接种在六孔板中，密封后置于细胞培养箱中进行培养，加入神经细胞培养基继续培养，得到鱼类嗅觉神经元。本发明操作简单，重复性好，为在体外实验节约实验成本和时间，减少实验的繁琐性。

主权项：1.一种鱼类嗅觉神经元的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取团头鲂嗅囊组织置于PBS缓冲液中，剥离嗅囊边缘黏膜，用PBS缓冲液重复清洗；2）向清洗的嗅囊组织中加入AIM消毒液，密封后置于冰上消毒、离心、弃上清；3）向沉淀组织中加入胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入中和培养基终止消化、离心、弃上清；中和培养基由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2mL青链霉素双抗、2.5mL两性霉素B、0.25mL硫酸庆大霉素、10mL胎牛血清加入50mL无菌离心管内，加DMEMF12培养基至50mL，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，封装，4℃冰箱保存备用；4）加入胶原酶工作液，缓慢吹打，用中和培养基终止消化，离心收集细胞上清液，置于冰上；其中，胶原酶工作液由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2mL青链霉素双抗、0.5mL硫酸庆大霉素、0.5mLDNaseⅠ、2mL胶原酶Ⅰ+Ⅳ母液加入50mL无菌离心管内，加DMEMF12培养基至46mL，0.22μm过滤器过滤后，转移至新的无菌管内，再加4mL胰蛋白酶-EDTA消化液，封装后于4℃冰箱保存备用；且所述胶原酶Ⅰ+Ⅳ母液由以下方法制备而成：在超净工作台内，将100mg胶原酶Ⅰ和100mg胶原酶Ⅳ溶于40mLPBS溶液中，0.22μm过滤器过滤后分装2mL管，于-20℃保存备用；5）重复步骤4）三次及以上；6）将收集的细胞上清液用细胞筛过滤、离心、收集细胞沉淀，用中和培养基清洗多次，离心、弃上清，加入生长培养基重悬浮，得到细胞悬液；其中，生长培养基由以下方法制备而成：在超净工作台内，取2mL青链霉素双抗、0.5mLHEPES、1mLB-27Plus、0.5mLN-2添加剂、5mLFBS加入50mL无菌离心管内，加DMEMF12培养基至50mL，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，封装后于4℃冰箱保存备用；7）将细胞悬液接种于六孔板中，密封后置于细胞培养箱中进行培养，后弃生长培养基，加入神经细胞培养基继续培养5~7d，得到鱼类嗅觉神经元，期间每3d换液一次，其中，细胞培养箱条件为：温度为27℃、CO2浓度为5％、培养时间为24~48h；神经细胞培养基由以下方法制备而成：在超净工作台内，取1mL青链霉素双抗、0.5mLHEPES、1mLB-27Plus、0.5mLN-2添加剂加入50mL无菌离心管内，最后加NeurobasalPlusA基础培养基至50mL，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，封装后于4℃冰箱保存备用。

全文数据：

权利要求：

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