申请/专利权人：广州华津医药科技有限公司

申请日：2017-04-01

公开（公告）日：2017-09-01

公开（公告）号：CN107115533A

主分类号：A61K48/00(2006.01)I

分类号：A61K48/00(2006.01)I;A61K38/51(2006.01)I;A61K35/74(2015.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P35/04(2006.01)I

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2017.09.26#实质审查的生效;2017.09.01#公开

摘要：本发明属于基因工程药物技术领域，具体涉及一种基因工程菌VNP20009‑M在制备预防和治疗恶性肉瘤药物中的新应用。本发明公开了所述基因工程菌VNP20009‑M在现有基础上用于治疗恶性肉瘤，所述基因工程菌VNP20009‑M能够有效杀伤肿瘤细胞，消除肿瘤病灶，且所述基因工程菌对人体无明显毒副作用，为恶性肉瘤的治疗提供了安全有效的新途径。

主权项：基因工程菌VNP20009‑M在制备预防和治疗恶性肉瘤药物中的应用。

全文数据：基因工程菌VNP20009-M在制备治疗恶性肉瘤药物中的应用技术领域[0001]本发明属于基因工程药物技术领域，具体涉及一种基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗恶性肉瘤药物中的新应用。背景技术[0002]癌症已经成为人类死亡的重要原因，2005年至2015年间癌症发病率增加了33%。世界卫生组织WHO发表的《全球癌症报告2014》预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。[0003]肉瘤（Sarcoma是来源于间叶组织包括结缔组织和肌肉）的恶性肿瘤，多发生于脂肪、筋膜、肌肉、纤维、淋巴及血管、骨膜及长骨两端。每种肉瘤都有不同的组织学、生物学特性和不一样的局部浸润、血行和淋巴转移倾向，其中肉瘤向肺转移较为常见。[0004]肉瘤的临床表现是肿块，当肿块增大压迫周围组织时产生症状。肉瘤的发病率很低，年发病率为2.4-5例10万人，约占成人恶性肿瘤的1%，占儿童恶性肿瘤的15%，但却占所有癌症相关死亡率的2%。由于肉瘤亚型众多，生物学行为多种多样，因此诊断比较困难，往往发现时病情较晚，约13-12的患者死于肉瘤复发及转移。现有医疗手段对晚期肉瘤的治疗发展一直停滞不前，化疗仍然是标准的治疗方法，例如含阿霉素的治疗是标准方案，经治患者的总生存期大概只有12-16个月。总体来说，早期患者5年生存率约60%-80%，晚期患者5年生存率不足20%。[0005]现有技术表明，甲硫氨酸依赖是绝大部分肿瘤细胞的特性，表现为肿瘤细胞对甲硫氨酸的过分需求，在去除甲硫氨酸或以其前体一同型半胱氨酸替代的培养基培养时，细胞增殖受到抑制；而在甲硫氨酸存在的环境下则能正常生长，其中包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等十多种恶性肿瘤细胞。但是，正常细胞不存在甲硫氨酸依赖性。造成甲硫氨酸缺乏的方法主要包括去除膳食中的甲硫氨酸，或者利用甲硫氨酸酶分解甲硫氨酸。然而单独限制饮食中甲硫氨酸的摄入来降低甲硫氨酸水平效果有限，而长期限制甲硫氨酸的摄入会引起机体营养不良、代谢障碍。相比于饮食限制甲硫氨酸摄入，利用甲硫氨酸酶methioninase不会引发过度的代谢问题，并具抗肿瘤效应。[0006]沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。其中，已知菌株VNP20009是一种高肿瘤靶向性、安全性以及具有抗肿瘤效应的载体。它对恶性黑色素瘤、肺癌等多种小鼠实体瘤模型有显著的抑制肿瘤生长效果。美国进行的两项I期临床研究表明其可以用于人体，具有安全性，但是没有观察到抗肿瘤效果。发明内容[0007]为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗肉瘤药物中的新应用。[0008]为解决上述技术问题，本发明公开了所述的基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗恶性肉瘤药物中的应用。[0009]进一步的，所述肉瘤为来源于结缔组织和肌肉等间叶组织的恶性肉瘤。[0010]进一步的，所述肉瘤包括发生于脂肪、筋膜、肌肉、纤维、淋巴及血管、骨膜及长骨两端的肉瘤。[0011]进一步的，所述肉瘤包括软组织肉瘤和骨肉瘤。[0012]现有软组织肉瘤患者中，以多形性未分化肉瘤undifferentiatedpleomorphic8已代〇11^，1]?3最多见，占25-35%;其次是脂肪肉瘤（11?〇83代〇11^，1^，占25-30%;平滑肌肉瘤（leiomyosarcoma，LMS12%;滑膜肉瘤（synovialsarcoma，SS占10%;恶性周围神经革肖膜瘤malignantperipheralnervesheathtumor，MPNST占6%〇[0013]骨肉瘤又称为成骨肉瘤，多发生在20岁以下的青少年或儿童。骨肉瘤是从间质细胞系发展而来，由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织使得肿瘤迅速生长。骨肉瘤在小儿骨恶性肿瘤中最为常见，约为小儿肿瘤的5%。[0014]所述肉瘤包括原发肉瘤、术后复发肉瘤、或术后转移至其他部位的肉瘤。[0015]进一步的，所述肉瘤为恶性肉瘤术后转移至肺部的肿瘤。[0016]优选的，所述基因工程菌VNP20009-M的最低有效施用剂量为6.4X107CFUm2。[0017]上述肿瘤预防和治疗的给药方式可通过多种途径进行给药，包括但不限于：口服给药、局部给药、注射给药包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、瘤内给药等。[0018]如现有技术中已知的，本发明上述基因工程菌VNP20009-M为已知菌株，其性能、形状、构建方法均如中国专利CN105983103A中所记载。[0019]所述基因工程菌VNP20009-M为克隆有Lnethioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。[0020]进一步的，所述的基因工程菌VNP20009-M为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其中，所述质粒上克隆有L-methioninase基因。[0021]所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到:将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将Lmethioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，即得。[0022]所述质粒包括但不限于pSVSPORT质粒、pTrc99A质粒、pcDNA3.1质粒、pBR322质粒或pET23a质粒。[0023]最为优选的是，在构建基因工程菌VNP20009-M的过程中，当选用pSVSPORT质粒时，将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，然后将Lmethioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中得到基因工程菌。[0024]其中，所述的电转化条件为电压2400V，电阻400Ω，电容25yF，放电时间4ms。[0025]本发明还公开了基因工程菌VNP20009-M在制备甲硫氨酸酶剂中的应用。[0026]本发明公开了所述基因工程菌VNP20009-M在现有基础上用于治疗恶性肉瘤的新应用，所述基因工程菌VNP20009-M能够有效杀伤肿瘤细胞，消除肿瘤病灶，对于原发性肉瘤、术后复发肿瘤、以及恶性肉瘤术后转移至其他部位的肿瘤细胞，都具有较好的杀伤效果，治疗效果较佳;尤其是对于软组织肉瘤术后转移至肺部的肿瘤，具有较好的杀伤效果；而且所述基因工程菌对人体无明显毒副作用，为恶性肉瘤的治疗提供了安全有效的新途径。附图说明[0027]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，[0028]图1为质粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鉴定1%琼脂糖凝胶电泳图；[0029]图2为本发明是Westernblot鉴定methioninase表达结果图；[0030]图3为本发明检测沙门氏菌中methioninase活性结果图；[0031]图4为实施例2中患者治疗前的胸部CT检查病灶状况；[0032]图5为实施例2中患者治疗4周后的胸部CT检查结果。具体实施方式[0033]实施例1基因工程菌VNP20009-M的构建[0034]本发明所述基因工程菌VNP20009-M的构建方法和过程如中国专利CN105983103A中实施例中所记载。[0035]1构建表达L-methioninase基因的质粒。[0036]先合成L-methioninaseGenBank:L43133·1基因亚克隆至pUC57质粒（金斯瑞公司），接着通过KpnI和HindIII酶切位点亚克隆至pSVSPORT质粒（invitrogen，得到pSVSPORT-L-methioninase表达质粒。具体构建过程如下：[0037]将pSVSPORT质粒用KpnI和HindIII双酶切，酶切体系为：2yg质粒DNA，3yL10Xbuffer，1.5yLKpnI酶，1.5yLHindIII酶，加入ddH20补足体积至30yL，37°C温浴3h。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出4.Ikb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。[0038]通过全基因合成得到L-methioninase编码区域DNA片段亚克隆至pUC57质粒金斯瑞公司），用KpnI和HindIII双酶切，酶切体系为：3yg质粒DNA，3yL10Xbuffer，1.5yLKpnI酶，1.5yLHindIII酶，加入ddH20补足体积至30yL，37°C温浴3h。然后将酶切体系在I%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.2kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。[0039]将pSVSPORTKpnIHindIII和L-methioninase编码区域DNA片段（KpnIHindIII连接，连接反应中加入2yL载体、6yL插入片段、IyLT4DNA连接酶，16°C温浴16h。[0040]将连接产物转化到E.coliDH5aTakara的感受态细胞中。取一管50yL的DH5a感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5yL上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30min;42°C热击60s，后冰上静置2min;加入500yL无抗性的LB液体培养基，37°C震荡培养Ih后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上，过夜培养。[0041]克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养16h，提取质粒DNA，用KpnI和HindΙΠ酶切鉴定，阳性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的两条DNA条带，如图1所示。再通过测序进一步确定阳性克隆的序列完全正确。[0042]2构建携带质粒的VNP20009菌和携带克隆有L-methioninase的基因的质粒的VNP20009菌。[0043]将pSVSPORT和pSVSPORT-L-methioninase表达质粒分别电转化至VNP20009菌株YS1646，ATCC号202165，分别命名为VNP20009-V和VNP20009-M。具体构建过程如下：[0044]将感受态细菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入预冷电转杯，向其中加入2yL质粒，轻弹混匀，于冰上孵育lmin。将电转杯放入电转仪，条件设置为电压2400V，电阻400Ω，电容25yF，放电时间4ms。电击完立刻加入ImLSOC培养基，轻轻混匀。37°C震荡培养Ih;用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB-O培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养16ΚνΝΡ20009-ν和VNP20009-M用LB-O培养后，提取质粒，酶切鉴定正确。[0045]取IXIO8沙门菌用蛋白裂解液提取蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳，再稳压冰浴电转至PVDF膜，BSA室温封闭Ih后，TBST漂洗3X5min，加入兔抗Liethioninase抗体（1:1000，4°C孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP标记的抗兔二抗（1:10000，室温孵育Ih，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化学发光法显影。结果如图2所示，在分子量约43kD处有特异性条带，说明VNP20009-M与VNP20009、VNP20009-V相比，Liethioninase表达量显著提尚。[0046]将L-甲硫氨酸和吡哆醛分别与VNP20009-V和VNP20009-M菌体混合，37°C孵育IOmin后用50%三氯乙酸终止，离心取上清，与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物MBTH充分混匀，50°C孵育30min后，测定320nm处的吸光值，以每分钟催化转化Ιμπιοΐα-酮丁酸的酶量定义为1个酶活性单位。结果显示（如图3所示），沙门菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009-V高10倍。[0047]可见，所构建基因工程菌沙门菌VNP20009-M具有较高的甲硫氨酸酶活性，可作为甲硫氨酸酶剂的制备之用。[0048]实施例2基因工程菌VNP20009-M治疗软组织肉瘤的效果[0049]1过往病史及诊断[0050]临床一男性患者，64岁，左腿肿块在南京市鼓楼医院经穿刺活检鉴定为梭形细胞肉瘤。后行肿瘤切除术，再次取组织分析病理，显示肿瘤细胞SMA—）、DES—）、My〇Dl—）、FN+、STAT6—）、CD34—、S100—）、CKpan—）、EMA—）、Vimentin++，结合HE切片，符合恶性纤维组织细胞瘤。[0051]后定期随访复查CT发现右肺上叶软组织占位，穿刺活检病理显示梭形细胞肉瘤。根据患者既往治疗及相关检查，诊断梭形细胞肉瘤术后复发肺转移。[0052]2治疗方案[0053]以250ml生理盐水稀释的基因工程菌VNP20009-M通过静脉输入体内，剂量为6.4XIO7CFUAi2。每次间隔1周，共输液5次。[0054]3疗效[0055]3.1肿瘤大小变化[0056]治疗前的胸部CT检查显示右肺上叶病灶大小约为18*10*10cm如图4所示）。治疗4周以后，CT检查显示右肺上叶病灶大小约为17*10*10cm如图5所示），与治疗前相比肿瘤大小无明显变化。[0057]3.2肿瘤内部变化[0058]治疗前，CT图像显示肺部病灶内部呈片状液化坏死。如图4所示，白线圈出的病灶内部呈现不均匀的颜色，较黑区域表示此处的细胞已经坏死，较亮区域表示活细胞。治疗4周后，CT图像显示病灶内部呈均一性结构如图5所示），CT值约为10HUXT值指示物质密度，当它低于20HU表示物质为液态，提示该区域肿瘤细胞基本坏死呈现液态。由此说明，经VNP20009-M治疗后，肉瘤患者的肿瘤细胞快速坏死液化。但是由于病灶在体内，无法抽取液体，所以未能观察到病灶缩小。[0059]3.3副反应[0060]每次治疗当日，输液后5-6小时，患者发热最高39.6度左右，物理降温可恢复正常体温。除此以外，无其他异常不适感觉。治疗期间，检查肝、肾功能等各项指标，结果如下表1所示。检测结果显示，与治疗前相比，患者身体各项指标基本相似。以上结果说明VNP20009-M对患者没有产生额外的毒副作用。[0061]表1患者身体各项指标数据[0063]以上数据说明，VNP20009-M能够有效杀伤恶性肉瘤细胞，消除肿瘤病灶，而且对人体无严重毒副作用。[0064]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

权利要求：1.基因工程菌VNP20009-M在制备预防和治疗恶性肉瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉瘤为来源于结缔组织和肌肉等间叶组织的恶性肉瘤。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肉瘤包括发生于脂肪、筋膜、肌肉、纤维、淋巴及血管、骨膜及长骨两端的肉瘤。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肉瘤包括软组织肉瘤和骨肉瘤。5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述肉瘤包括原发肉瘤、术后复发肉瘤、或术后转移至其他部位的肉瘤。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肉瘤为恶性肉瘤术后转移至肺部的肿瘤。7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌VNP20009-M的最低有效施用剂量为6.4XIO7CFUAi2。8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌VNP20009-M为克隆有L-methioninase基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M为携带了质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009,所述质粒上克隆有L-methioninase基因。10.根据权利要求8或9任一项所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法构建得到：将L-methioninase基因亚克隆至质粒中，得到L-methioninase表达质粒，将Lmethioninase表达质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009,即得。

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