申请/专利权人：河北省农林科学院粮油作物研究所

申请日：2018-04-04

公开（公告）日：2018-08-21

公开（公告）号：CN108424918A

主分类号：C12N15/29(2006.01)I

分类号：C12N15/29(2006.01)I;C07K14/415(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;A01H5/00(2018.01)I;A01H6/46(2018.01)I

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2018.09.14#实质审查的生效;2018.08.21#公开

摘要：本发明公开了一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSR1基因及其应用，该WSR1基因包括a或b任一所述的核苷酸序列：aSEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；bSEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。在小麦中过表达SEQ ID NO：1所示的基因或抑制SEQ ID NO：1所示基因的表达，以培育出具有高淀粉含量的转基因小麦，对提高小麦产量具有重大的意义。

主权项：1.一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSR1基因，其特征在于，包括a或b任一所述的核苷酸序列：aSEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；bSEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

全文数据：一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSR1基因及其应用技术领域[0001]本发明属于生物与基因工程技术领域，具体地说，涉及一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因及其应用。背景技术[0002]淀粉是小麦籽粒的主要成分，约占小麦籽粒重量的65%左右，淀粉含量和直、支链淀含量对小麦品质有重要影响。小麦是世界上最主要的粮食作物之一，也是我国第二大粮食作物。淀粉的生物合成是一个复杂的过程，受各种合成关键酶的影响，同时环境对淀粉合成也有较大的影响。研究小麦淀粉合成的分子机制，培养高淀粉小麦新品种是提高小麦产量的一个主要途径，对于保障国家粮食安全具有重要意义。近年来部分学者研究了与淀粉合成途径相关的转录因子。[0003]植物细胞内淀粉合成是个复杂的生物学过程，近年来部分学者研究了与淀粉合成途径相关的转录因子。转录因子transcriptionfactor是指能与受调控的目的基因5’端上游序列结合，调控目的基因时空表达功能的蛋白质。因其与DNA序列结合的部位称为顺式作用元件（cis-actingelement相结合，所以转录因子也称为反式作用因子。ZhuZhuY，HongMM,WangZY.IdentificationoftheRegionsInvolvedinProtein-ProteinInteractionof0sBP-5and0sEBP-89[J],ActaPhotophysiologicaSinica,2003,295:425-430等通过对EREBP蛋白（乙烯反应元件结合蛋白）研究发现，EREBP可以提高WaxyGBSS颗粒结合淀粉合成酶）基因的转录水平。RookRookF，CorkeF，CardR，etal.Impairedsucrose-inductionmutantsrevealthemodulationofsugar-inducedstarchbiosyntheticgeneexpressionbyabscisicacidsignaling[J].PlantJournalforCellMolecularBiology,2001,26⑷：421-433等发现apetala2_type蛋白能提高AGPL3葡萄糖焦磷酸化酶大亚基）的转录水平。Fu等（FuFF，XueHff.Coexpressionanalysisidentifiesricestarchregulatorl,ariceAP2EREBPfamilytranscriptionfactor,asanovelricestarchbiosynthesisregulator[J].PlantPhysiol.2010,154:927-938.通过共表达分析识别了一个负向调控15个水稻淀粉合成相关基因表达的淀粉合成调控转录因子RiceStarchRegulatoryRSRl。为通过基因工程或其它方法提高小麦淀粉的积累量，改善品质、提高粒重奠定了坚实的基础。[0004]到目前研究小麦淀粉合成转录因子的报道几乎没有，多数只是猜测其功能，未能有效研证。发明内容[0005]有鉴于此，本发明提供了一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因及其应用。[0006]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因，包括a或b任一所述的核苷酸序列：[0007]aSEQIDNO.1所示的核苷酸序列；[0008]bSEQIDNO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。[0009]本发明还公开了一种上述的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因编码的蛋白。[0010]可选地，其氨基酸如SEQIDNO.7所示。[0011]本发明还公开了一种含有上述的核苷酸序列的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因表达载体。[0012]本发明还公开了一种含有上述的表达载体的宿主细胞。[0013]本发明还公开了一种上述的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因在培育高淀粉转基因植物中的应用。[0014]可选地，所述高淀粉转基因植物为小麦。[0015]本发明还公开了一种具有高淀粉的转基因小麦的培育方法，在小麦中过表达SEQIDNO:1所示的基因或抑制SEQIDNO:1所示基因的表达，以培育出具有高淀粉的转基因小麦。[0016]本发明还公开了一种上述的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因在培育高产量转基因植物中的应用。[0017]可选地，所述高产量转基因植物为小麦。[0018]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：[0019]本发明提供了一个新的小麦基因，实时荧光定量PCR检测结果表明，本发明基因的表达影响了小麦的淀粉含量合成，说明其在小麦淀粉合成机制中起到重要作用，基于此，可利用其培育具有高淀粉含量的转基因小麦，对提高小麦产量具有重大的意义。[0020]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明[0021]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：[0022]图1是本发明WSRl基因结构图，方框代表外显子，线条代表内含子，箭头代表非编码区，五边形代表保守结构域；[0023]图2是本发明利用DNAMAN软件对小麦WSRl和水稻OsUreG氨基酸序列进行同源性比对的结果；[0024]图3是本发明冀麦325接种BSMV=PDS的小麦叶片变化情况:其中，BSMV:00为对照组未接种BSMV:PDS病毒15天的小麦叶片;BSMV:PDS为接种BSMV:PDS病毒的小麦叶片，5d，IOd，20d分别代表接种5天、10天20天后的小麦叶片；[0025]图4是本发明实时荧光定量PCR对沉默PDS基因和沉默WSRl基因在冀麦325不同时间下表达特征的分析结果，BSW:WSRl为接种WSRl基因不同时间的表达结果；[0026]图5是本发明对照冀麦325和沉默WSRl基因的冀麦325的直链淀粉含量AAC、支链淀粉含量APC、总淀粉含量SC、抗性淀粉含量RS变化图；其中，WT为对照冀麦325,WSRl为沉默WSRl基因的冀麦325;[0027]图6是本发明对照冀麦325和沉默WSRl基因的冀麦325的千粒重（图6A及籽粒充实结果（图6B;WT为对照冀麦325，WSR1为沉默WSRl基因的冀麦325。具体实施方式[0028]以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。[0029]本发明提供的基因来源于小麦冀麦325,根据序列结构特征，命名为WSRlWheatStarchRegulatory1，其cDNA序列全长2003bp，包含一个长为1584bp的开放阅读框，编码527个氨基酸;基因组DAN序列全长4316bp，由8个外显子和7个内含子组成。从5’端开始，夕卜显子的长度依次为107^口、58口、88口、146口、104^口、132口、10%口、585口，内含子的长度依次为12比口、12比口、136匕口、49^口、126匕口、367匕口、945匕口，基因结构参见图1。[0030]实施例1:抑制小麦淀粉合成的转录因子基因WSRl的克隆，使用材料为冀麦325。[0031]1.小麦WSRlcDNA序列电子克隆；[0032]1以NCBI提交的水稻RSRl序列OienBank登录号：L0C_0s05g03040比对小麦基因组序列，以获得同源片段为靶序列，设计电子克隆的引物，按SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit中的要求，应用Primer5.0软件，在其5’端设计反向特异引物WSR1-5，在其3’端设计正向特异引物WSR1-3，将得到的序列用DNAMAN软件拼接，对开放阅读框ORF进行预测，以获取完整的小麦WSRl的cDNA序列。[0033]2根据得到的全长cDNA序列用Primer5软件设计并筛选出一对特异引物WSRl-F和WSR1-R，用于小麦WSRlcDNA和gDNA基因克隆。[0034]正向引物WSR1-F:5，-TCTTCTTGAATCGTGAGGTT-3，（SEQIDN0:3;[0035]反向引物WSR1-R:5’-GCTGAGGTTAGTATCTGACA-3’（SEQIDN0:4;[0036]2.利用TrizolInvitrogen提取总RNA，具体步骤如下：[0037]1液氮研磨50-100mg材料，研碎后转移到含ImlTrizol试剂的EP管中，充分混匀，室温静置5min。[0038]2加入0·2ml氯仿，充分混匀，室温静置2-3min;12000g，4°C，离心15min。[0039]3把上层无色的水相转移到一个新的1.5mlEP管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后室温放置IOmin;12000g，4°C，离心lOmin。[0040]⑷去上清，将RNA沉淀用Iml75%乙醇清洗，7500g，4°C，离心5min，之后风干。[0041]5将沉淀溶于适量RNase-free的去离子水中，60°C促溶lOmin。[0042]6微量分光光度计NanoDropND-2000Spectrotometer定量，电泳分析RNA完整性。[0043]3.利用植物基因组DNA提取试剂盒天根，DP305提取DNA，具体步骤如下：[0044]1取植物新鲜组织约100mg，加入液氮充分碾磨。[0045]2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μ165°C预热缓冲液GPl的离心管中实验前在预热的GPl中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65°C水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。[0046]3加入700μ1氯仿，充分混勾，12000rpm离心5min。[0047]⑷小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μ1缓冲液GP2，充分混匀。[0048]5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。[0049]6向吸附柱CB3中加入500μ1缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。[0050]7向吸附柱CB3中加入600μ1漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。[0051]⑶重复操作步骤7。[0052]9将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。[0053]10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μ1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。[0054]4·利用GoldScriptcDNA合成试剂盒（Invitrogen，c81401190进行第一ScDNA合成，具体步骤如下：[0055]1在0.2ml离心管中依次加入总RNA5μ1200ngyl，IOmMdNTPmixΙμΐ，OligodTPrimerlyl，DEPC水3μ1〇[0056]2将上述RNA引物混合物放置在65°C孵育5min，然后放置在冰上至少lmin。[0057]3在另一管中，配制2X反应混合液，按顺序加入下列组分：10XRT缓冲液2μ1，25mMMgCl24yl，0.1MDTT2μ1，重组RNase抑制剂（4〇υμ11μ1。[0058]4向第2步的每个RNA引物预混液中加入9μ12Χ反应预混液，轻柔混匀，短暂离心。[0059]542。：孵育211^11。[0060]⑶在每个管中加入ΙμΐGoldScriptRT。[0061]⑵42Γ孵育50min。[0062]⑶70°C孵育15min，终止反应，冰上冷却。[0063]9短暂离心收集反应，向每个管中加入ΙμΐRNaseH，37°C孵育20min，-20°C保存。[0064]5.聚合酶链式反应PCR反应进行序列扩增[0065]用WSRl-F和WSRl-R引物分别对小麦cDNA和gDNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为50μΐ,5XPrimeSTARGXLBufferΙΟμΙ,άΝΤΡMixture4μ1,ForwardPrimerΙΟμΜ2.5μ1,ReversePrimerIOyM2·5μ1，模板cDNA或gDNA2yl，PrimeSTARGXLDNAPolymeraseTaKaRa，R050Q0·5μ1，CldH2O28·5μ1。PCR反应程序：98cC2min;98cCIOs，58cC15s，68cC3min，30个循环;68°CIOmin;4°C保存。[0066]6.PCR产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒天根，DP209进行纯化回收，具体步骤如下：[0067]1柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μ1平衡液BL，12000rpm离心Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。[0068]2将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。[0069]3向胶块中加入等倍体积溶液PN，50°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。[0070]4将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。[0071]5向吸附柱CA2中加入600μ1漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。[0072]⑶重复操作步骤5。[0073]7将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。[0074]⑶将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。[0075]7.基因克隆：取4μ1PCR回收产物加入ΙμΐpEASY-BluntCloning载体（全式金，CB101-01，轻轻混合，室温20°C_37°C反应5min，完成连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有8μ1IPTG500mM，40μ1X-gal20mgml的卡那霉素（50ygmlLB平板37°C生长过夜;挑选白色菌落，通过快速PCR挑选阳性克隆测序。[0076]8.小麦WSRl序列分析[0077]1运用DNAMAN软件对测序结果进行分析，以WSRl-F和WSRl-R引物扩增的小麦WSRl的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，其cDNA序列全长2003bp，包含一个长为1584bp的开放阅读框，编码527个氨基酸。以WSRl-F和WSRl-R引物扩增的小麦WSRl的基因组DNA序列如SEQIDN0:2所不，其gDNA序列全长4763bp，包含8个外显子和7个内含子。从5’端开始，外显子的长度依次为107^?、58?、88?、146?、10仙？、132?、10%?、585?，内含子的长度依次为12Ibp、12Ibp、136bp、490bp、126bp、367bp、945bp，基因结构参见图1。[0078]2检测小麦WSRl和水稻RSRl氨基酸同源性检测。小麦WSRl的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。运用DNAMAN软件将小麦WSRl的氨基酸序列和水稻RSRl氨基酸序列进行序列比对，二者同源性为53.99%，比对结果见图2。[0079]实施例2用VIGS沉默小麦WSRl[0080]在小麦开花12天后，选取生长健壮的小麦冀麦325。将体外转录好的大麦黄花叶病毒α、β和γ转录产物，各取IOyL混合后，加入2倍体积60μ〇的DEPC水，再加入此时成分的1倍体积（120yL的GKPBuffer，制得总体积为210yL的接种病毒的混合液。接种时要戴刚开封橡胶手套，用DEPC水处理过的枪头取IOyL接种液放在食指肚上，一只手固定小麦麦穗的一端，另一手用大拇指和食指轻轻来回摩擦小麦麦穗。接种完后，20min后向小麦幼苗喷施DEPC水，保湿24h。接种后每天观察、记录接种部位变化，并定期取材。接种BSMV:PDS的小麦叶片出现漂白现象，只接种小麦WSRl基因的没明显反应。结果如图3，发现接种BSMV:PDS的小麦穗在第5天开始出现光漂白现象，在第10天时，光漂白现象比较明显，在第20天时光漂白达到最大程度，而接种BSMV:00的对照组却没有明显变化，接种率达90%。[0081]实施例3实时荧光定量PCRReal-timePCR验证WSRl在小麦淀粉合成机制中的作用[0082]1.材料选取[0083]选取田间接种沉默WSRl基因的冀麦325,51、101、151、201、251及未接种325分别取样，液氮冷冻后-80°C保存。[0084]2.利用Trizol提取总RNA，具体步骤参见实施例1。[0085]3.利用PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraserTaKaRa，RR047A进行第一链cDNA合成：[0086]1去除基因组DNA，反应体系：5XgDNAEraserBuffer2μ1，gDNAEraserΙμΐ，TotalRNA5yl200ngAU，RNaseFreedH2〇2μ1;反应程序：42Γ2πΰη，4Γ保存。[0087]2反转录，反应体系：步骤1的反应液10μ1，PrimeScriptRTEnzymeMixIΙμΐ，RTPrimerMix1μ1，5XPrimeScriptBuffer24yl，RNaseFreedH2〇4μ1;反应程序：37。:15min，85°C5s，4°C保存。[0088]4.使用SYBRKPremixExTaqIITaKaRa，RR820A试剂盒进行实时荧光定量PCR分析[0089]混匀如下反应体系，然后分装于96孔光学版中，并覆盖上光学膜，扩增使用的仪器为ABIPRISM7500real-timePCR仪；[0090]PCR反应程序：95Γ308;95Γ58,60Γ348,4Χ^3ΐθ8;95Γΐ58,6Γ：1πΰη，95Γΐ58;[0091]20μ1PCR反应体系配制如下：SYBR.!PremixExTaqII2X10μ1,ForwardPrimerΙΟμΜ0.8μ1,ReversePrimer10μΜ0.8μ1,R0XReferenceDyeII50X0.4μ1,cDNA模板2μ1，CldH2O6μ1;[0092]引物序列为:WSRl特异引物，WSR1-F:5’-TGAAGTTGCTGCTGAAGG-3’（SEQIDΝ0:5，WSRl-R：^-CGATGACGACGAGAAGAG-3,SEQIDN0：6〇[0093]5.结果[0094]参看图4，结果显示，在接种了BSMV:PDS之后，小麦穗部HS基因的相对表达量明显降低了，在接种后第5天下降了50%，在第15天下降了73%—直持续到第25天；在接种了BSMV:WSRl之后，小麦穗部WSRl基因的相对表达量明显降低了，在接种后第5天下降了37%，在第15天下降了75%—直持续到第25天，下降了88%。图5结果显示，接种了BSMV:WSR1之后，直链、支链、总淀粉、抗性淀粉含量均高于未接种的冀麦325。图6结果显示，在接种了BSMV:WSRl之后，小麦冀麦325籽粒千粒重及体积明显大于未接种的冀麦325籽粒。说明WSRl在抑制小麦淀粉合成机制中起重要作用，小麦中过表达WSRl或抑制WSRl的表达，将影响小麦淀粉的合成，培育出具有高淀粉的转基因小麦，对提高小麦产量具有重大的意义。[0095]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

权利要求：1.一种抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因，其特征在于，包括a或b任一所述的核苷酸序列：aSEQIDNO.1所示的核苷酸序列；bSEQIDNO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。2.—种权利要求1所述的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因编码的蛋白。3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸如SEQIDNO.7所示。4.一种含有权利要求1所述的核苷酸序列的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因表达载体。5.—种含有权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。6.—种权利要求1所述的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因在培育高淀粉转基因植物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高淀粉转基因植物为小麦。8.—种具有高淀粉的转基因小麦的培育方法，其特征在于，在小麦中过表达SEQIDNO:1所示的基因或抑制SEQIDNO:1所示基因的表达，以培育出具有高淀粉的转基因小麦。9.一种权利要求1所述的抑制小麦淀粉合成的转录因子WSRl基因在培育高产量转基因植物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高产量转基因植物为小麦。

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