申请/专利权人：张伟

申请日：2017-01-23

公开（公告）日：2017-06-16

公开（公告）号：CN106854678A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.08.27#发明专利申请公布后的驳回;2017.07.11#实质审查的生效;2017.06.16#公开

摘要：本发明公开了一种焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性试剂盒及方法。TRIB3基因多态性具体是指rs2295490单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.1—3所示的引物、2×Premix预液、DNA模板等。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量TRIB3rs2295490的检测，从而达到对2型糖尿病个体化治疗方案制定，心血管疾病获益预测及防范低血糖事件发生。

主权项：一种焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：1扩增引物：上游引物：5′‑GATCGTGCAACTGCTGTGG‑3′；下游引物：5′‑TCCCAGGCCTCCTGTGGT‑3′；所述下游引物的5'‑进行生物素标记；2测序引物：5′‑GGGCGGGCGGGCCTA‑3′。

全文数据：焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒及方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒及方法。背景技术[0002]糖尿病是我国及全球面临的最严重、最危急的健康问题之一。糖尿病患病人数逐年递增，并产生影响终生的并发症。据国际糖尿病联盟（IDF统计，2015年全球约4.15亿糖尿病患者，占世界人口比例的8.8%，另有3.18亿成年人处于糖耐量受损状态，而糖耐量受损是未来糖尿病发生的高危因素。中国人群糖尿病患病率为9.8%，患病人数约1.10亿，未诊断糖尿病患者约0.57亿，高居世界首位。值得关注的是，糖尿病导致的并发症是致残、降低生活质量和导致早亡的主要原因。2015年我国死于糖尿病患者高达129.97万人，用于糖尿病及其并发症的医疗费用占总医疗费用的13%，其中糖尿病血管并发症是致死及高额医疗支出的首要原因。[0003]Tribblespseudo-kinase3TRIB3是一个假激酶，能与Akt结合并抑制膜岛素介导的Akt磷酸化激活诱导葡萄糖稳态水平的损伤。临床研究表明TRIB3过度激活或TRIB3rs2295490，AG基因突变与2型糖尿病患者胰岛耐受及其心血管并发症风险增加显著相关。动物实验研究表明缬沙坦（降压药物能够显著下调糖尿病心肌肥厚小鼠TRIB3mRNA水平及改善心肌功能。体外研究表明TRIB3rs2295490，AG基因多态性不影响胰岛素介导IR，TIS.1的激活，也不影响TRIB3蛋白水平，但影响AktThr308，Ser473和eNOSSer1177磷酸激活，进而导致胰岛素刺激HUVEC细胞一氧化氮生成降低3倍左右。[0004]近期，我们的大样本5年随访临床研究表明，TRIB3rs2295490，AGG等位基因频率为17.1%。对年龄大于55岁，接受标准糖化血糖控制遵医嘱治疗，HbAlc约为7.3%的2型糖尿病患者，AGGG基因型携带者主要大血管及微血管事件患病风险显著增加。相反，接受强化血糖控制HbAlc6.5%的2型糖尿病患者，主要大血管及微血管事件患病风险显著降低（IntensivevsStandard*AGGG:HR=0.580.42-0.79，Ρ=0·001。而对AA基因携带者，强化血糖控制并无显著心血管疾病获益（IntensivevsStandard*AA:HR=l.040.83-1.31，P=0.72。提示对该突变位点检测对2型糖尿病个体化治疗方案制定，心血管疾病获益预测及降低低血糖事件发生具有重要临床意义。[0005]综上所述，TRIB3基因多态性与2型糖尿病并发主要大血管及微血管事件显著相关，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测TRIB3基因多态性的试剂盒将为2型糖尿病个体化治疗起到积极的推动作用。[0000]焦磷酸测序Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。发明内容[0007]TRIB3基因多态性是与2型糖尿病并发主要大血管及微血管事件显著相关。本发明提供一种检测2型糖尿病易感基因TRIB3基因多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测TRIB3基因多态性。[0008]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：[0009]所述焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒包括如下引物：[0010]1扩增引物：[0011]TRIB3rs2295490上游引物：5-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3SEQIDN0·l;[0012]TRIB3rs2295490下游引物：5-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3SEQIDN0·2;其中，下游引物的5进行生物素标记；[0013]⑵测序引物：[0014]TRIB3rs2295490测序引物：5-GGGCGGGCGGGCCTA-3SEQIDN0·3;[0015]试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。[0016]所述应用上述试剂盒检测TRIB3基因多态性的方法，包括如下步骤：[0017]IDNA提取；[0018]2聚合酶链反应：[0019]配制50μ1PCR扩增体系，包含：2XPremix25μ1，ΜΗ2023μ1，模板2μ1，其中，所述2XPremix中含有TRIB3rs2295490上游引物和TRIB3rs2295490下游引物；然后依次在95°〇303,551€303,721€303进行35个循环，再在72°：保持51^11，最终保持在18°：，得扩增产物；[0020]3对扩增产物进行纯化；[0021]⑷对经步骤⑶处理后的扩增产物焦磷酸测序及结果分析。[0022]本发明的试剂盒对TRIB3rs2295490目标序列进行分析和检测。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对TRIB3基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上2型糖尿病并发症关联基因TRIB3基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程;具有高通量、低成本等特点;PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。本发明所述试剂盒可用于制备2型糖尿病心血管并发症的预后判断试剂。具体实施方式[0023]1、确定TRIB3需要检测的具体突变类型，通过检索获取突变位点及其附近的碱基序列；[0024]2、设计并合成针对每一个位点的PCR扩增和测序引物，如下：[0025]TRIB3rs2295490上游引物：5CGATCGTGCAACTGCTGTGG-3'SEQIDNO.1;[0026]TRIB3rs2295490下游引物：5-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3SEQIDN0·2;[0027]其中，下游引物的5进行生物素标记；[0028]TRIB3rs2295490测序引物：5-GGGCGGGCGGGCCTA-3SEQIDN0·3;[0029]3、提取待测血液样本的DNA并进行浓度和纯度的质检；[0030]4、通过质检的DNA样本使用扩增引物进行PCR扩增，步骤如下：[0031]1操作人员根据实验需要从冰箱中拿取适量的TRIB3PCR-焦磷酸测序2XPremix预混液。根据实验需求准备好无菌的200uL离心管并做好唯一性标记；[0032]2每个反应管按表1所列加入需求的试剂，其中CldH2O可以根据模板的实际需要量进行调整：[0033]表1[0035]将配制好的反应管于Eppendorf微量离心机上短暂离心10秒。[0036]3将上述反应管转移至核酸制备间内。在的专用生物安全柜中往上述反应管中添加模板或CldH2O，加样内容参见表2:[0037]表2[0042]5、扩增后的产物使用琼脂糖凝胶电泳进行质控；[0043]6、通过质控的产物进行焦磷酸测序，步骤如下：[0044]1扩增产物进行单链样本纯化和与TRIB3测序引物退火结合处理。纯化后的单链模板调用检测程序进行焦磷酸测序检测；[0045]2依据软件给出的Histograms图，人工对检测结果进行基因型判断，也可以利用软件自动判断样本多态位点的基因型结果；[0046]7、结果分析：[0047]检测结果见表4:[0048]表4[0055]综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测TRIB3rs2295490基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于2型糖尿病个体化治疗方案的制定。

权利要求：1.一种焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：⑴扩增引物：上游引物：5'-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3';下游引物:5'-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3';所述下游引物的5’-进行生物素标记；⑵测序引物:5'-GGGCGGGCGGGCCTA-3'。2.—种应用权利要求1所述的试剂盒检测TRIB3基因多态性的方法，包括如下步骤：⑴DNA提取；⑵聚合酶链反应：配制5^1?0財广增体系，包含：2\?代111丨125以1，11!12〇23以1，模板2以1，其中，所述2\Premix中含有权利要求1所述的上游引物和下游引物;然后依次在95°C30S，55°C30S，72°C30S进行35个循环，再在72°C保持5min，最终保持在18°C，得扩增产物；⑶对扩增产物进行纯化；⑷对经步骤⑶处理后的扩增产物焦磷酸测序及结果分析。3.权利要求1所述试剂盒在制备2型糖尿病心血管并发症的预后判断试剂中的应用。

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