申请/专利权人：长江师范学院

申请日：2015-07-13

公开（公告）日：2015-09-23

公开（公告）号：CN104928307A

主分类号：C12N15/56(2006.01)I

分类号：C12N15/56(2006.01)I;C12N9/24(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2021.07.06#未缴年费专利权终止;2018.01.05#授权;2015.10.21#实质审查的生效;2015.09.23#公开

摘要：本发明公开一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法，所述茎瘤芥硫苷酶基因MYR1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述茎瘤芥硫苷酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法，提取茎瘤芥叶片中的总RNA，再采用RT-PCR法扩增硫苷酶基因MYR1，并构建表达载体，采用毕赤酵母表达系统进行表达，利用SalI酶切位点线性化载体，转化入毕赤酵母基因组，通过G418抗性，筛选出遗传霉素抗性转化子，采用甲醇诱导表达。经电泳分析，本发明重组子能进行表达，表达蛋白分子量为90KDa，测定纯化后蛋白的比活力，茎瘤芥硫苷酶的比活力约等于0.003UμL。

主权项：一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

全文数据：一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法技术领域[0001]本发明属于硫苷酶技术领域，具体涉及一种茎瘤芥硫苷酶基因MYRl、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法。背景技术[0002]十字花科植物中有一种非常重要的防御酶即硫苷酶Myrosinase，也被称为介子酶;硫苷酶能降解硫苷，降解产物中包含葡萄糖、硫酸盐、异硫代氰酸盐、硫氰酸盐等物质；其中异硫代氰酸盐具有抗炎、预防癌症等作用;硫苷酶常常以同工酶的形式存在，这些同工酶由于糖基化的程度不同导致其物理性质、化学性质不同。目前发现，硫苷酶至少有3种类型的编码基因家族1六0\^^，了661、冊1^^，了662、]\«：1^^，了663，研究表明獻基因家族有4-5个基因，其编码的硫苷酶是可溶性二聚物。MB基因家族包括10-15基因，MC基因家族由5个基因组成，MB和MC基因家族编码的硫苷酶是不可溶复合物。[0003]目前国际上对硫苷酶的性质、提取方法做了很多研究，对于硫苷酶的分离研究首先要提到Bjorkman等于1972年在白芥种子中提取了硫苷酶，并对其进行了纯化;紧接着Ohtsuru等对硫苷酶的提纯方法和硫苷酶的性质进行了研究;XianLi等人从辣根当中也提取到了硫苷酶，并将其分离出来;Bones等在1989年从油菜幼苗当中分离得到硫苷酶;然而植物中的硫苷含量通常比较低，直接提取并不能大量获得硫苷酶。[0004]为更好地研究硫苷酶的性质，ChenandBarbara通过转基因技术将硫苷酶基因克隆到酵母中表达出来，但表达的酶对酵母有毒，不能大量表达。目前国内学者主要从萝卜、油采、拟南芥、芥采、西兰花中提取硫昔酶基因并构建表达载体进彳丁表达；比如2008年肖海燕等从油菜中提取硫苷酶基因后构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达，得到90KDa左右的蛋白条带；2010年梁锦锋等从西兰花中提取硫苷酶基因并在毕赤酵母中表达，得到65KDa大小的蛋白条带；2012年张伟等人从甘蓝型油菜中提取硫苷酶基因并构建载体进行表达;然而目前并未有从茎瘤芥中提取硫苷酶基因，并进行载体构建表达茎瘤芥硫苷酶的相关研究。发明内容[0005]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种茎瘤芥硫苷酶基因MYRl0[0006]本发明的另一目的是提供一种茎瘤芥硫苷酶。[0007]本发明的再一个目的是提供上述茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法。[0008]实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种茎瘤芥硫苷酶基因MYRl，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所不的序列。[0009]—种茎瘤芥硫苷酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的序列。[0010]—种上述茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法，包括如下步骤：[0011]1取茎瘤芥叶片，提取总RNA;[0012]2以步骤1提取的总RNA为模板，在PCR仪上通过反转录反应，合成第一链CDNA;[0013]3比较油菜和芥菜硫苷酶基因的核苷酸序列，设计一对正反向引物，所述引物为：[0014]上引物1:[0016]上引物2:[0018]下引物：[0020]4以步骤2合成的第一链cDNA为模板，采用步骤3所设计的引物，进行PCR反应，扩增获得硫苷酶基因MYRl的全长序列，所述硫苷酶基因MYRl的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；[0021]5提取载体PPIC9K-S质粒，并用EcoRI和NotI双酶切所述质粒；[0022]6将步骤4获得的硫苷酶基因MYRl与步骤5双酶切后的表达载体杂交，获得重组表达载体PPIC9K-S-MYR1;[0023]7将步骤6重组表达载体转化感受态细胞大肠杆菌DHlOB，将转化后的细胞在含氨苄抗性的LB平板上于37°C培养18小时，经PCR鉴定筛选阳性克隆菌并测序；[0024]8将步骤7测序正确的阳性克隆培养，并提取质粒，采用SalI单酶切线性化处理，用于毕赤酵母SMDl168电转化；[0025]9将SalI单酶切线性化处理的重组表达载体pPIC9K-S-MYRl，电转化入毕赤酵母SMDl168，涂布MD平板于30°C培养3-6天，并通过G418抗性，筛选得到遗传霉素抗性转化子；[0026]10挑取遗传霉素抗性转化子的单克隆至YPD培养基培养，在28°C条件下，以300rpmh的转速振摇到㈤600值为2-5之间，离心弃去上清液，向沉淀中加入BMMY液体培养基重悬细胞;利用甲醇连续诱导表达，期间每24小时加甲醇至甲醇的终体积浓度为0.5%以继续诱导，诱导72h后，利用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白的表达。[0027]相比现有技术，本发明具有如下有益效果：[0028]1、茎瘤芥硫苷酶在茎瘤芥中的含量非常少，在茎瘤芥中直接提取硫苷酶具有一定的难度，且天然硫苷酶具有糖基化修饰作用，原核表达产物缺乏硫苷酶活性，因此糖基化修饰对于硫苷酶酶活性有很大影响;本发明选择毕赤酵母为表达系统，在表达产物的加工、夕卜分泌、翻译、修饰以及糖基化等方面具有很大的优势，且毕赤酵母具有醇氧化酶AOXl基因启动子，能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，非常有利于茎瘤芥硫苷酶的纯化。[0029]2、本发明比较油菜、芥菜等植物硫苷酶基因的核苷酸序列，选取同源性较高的区域，设计一对正反向引物，以茎瘤芥的第一链cDNA为模板，扩增茎瘤芥的硫苷酶基因MYRl，并构建重组表达载体口？1〇91-3-1^1?1，电转化入毕赤酵母31«1168，将硫苷酶基因1^1?1克隆到毕赤酵母表达载体中，表达得到茎瘤芥硫苷酶，分子量为90KDa。[0030]3、本发明采用表达纯化后的茎瘤芥硫苷酶，以Sinigrin黑芥子苷为底物，测定重组蛋白的活性，结果表明在45°C下，重组子所表达的蛋白能够水解硫苷，表现出硫苷酶的生物活性，比活力约为0·〇3UmL。[0031]4、本发明重组子可大量表达茎瘤芥硫苷酶，相比于直接提取的方法，本发明更具有经济价值，具有良好的市场推广前景。附图说明[0032]图1为茎瘤芥叶总RNA电泳检测图；[0033]图2为硫苷酶基因的RT-PCR扩增图；[0034]图3为茎瘤芥硫苷酶基因序列BLASTX图；[0035]图4为茎瘤芥硫苷酶氨基酸对比图；[0036]图5为表达产物的SDS-PAGE图；[0037]图6为纯化后的融合蛋白电泳图；[0038]图7为活性测定后检测硫苷含量的HPLC图。具体实施方式[0039]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。[0040]下述实施例中所米用的莖瘤芥BrassicajunceaL.Czern.etCoss.var.tumidaTsenetLee为永安小叶，储藏期为3年，由重庆市涪陵绿原农业科技发展公司提供;大肠杆菌DHlOB，SMDl168工程菌，表达载体pPIC9K为NEB公司产品。[0041]无RNaseH20、灭菌石蜡油、IXTAE缓冲液、IXTBE缓冲液、平衡缓冲液、洗脱缓冲液、6\1〇1;[1^131^€61'、6011¥丨6¥1]\1核酸染料、1^^86抑制剂、11^1?]\^1、4]\^反转录酶、10XPCRBuffer、MgCl2、DNA聚合酶和琼脂糖购自上海生物工程有限公司。[0042]限制性核酸内切酶EcoRI和NotI为NEB公司产品。[0043]所用其他原料如无特殊说明，即为普通市售。[0044]实施例1茎瘤芥总RNA的提取：[0045]在离心管中加入5mLTrizol试剂，取0.5g茎瘤芥叶片在液氮中快速研磨至粉末，然后转移到试管中，立即充分混匀，在室温放置10min后，在冷冻离心机中进行离心，温度设置为4°C，转速为7200rpmmin，离心25min后吸取上层液体；向所述上层液体中加入CHChImL和5molLNaCl溶液ImL，剧烈振荡后放置3min，再于4°C，7200rpmmin离心25min，这时样品会分成3层，取上清；向上清中加入2.5mL异丙醇，放置10min后再次离心20min，弃上清，离心管底部侧面形成胶状沉淀；向离心管中加5mL乙醇洗涤沉淀后离心5min，弃上清，待乙醇挥发完全后加0.25mLDEPC处理的水溶解沉淀，并于-72°C保存。[0046]实施例2总RNA的凝胶电泳检测[0047]在锥形瓶中加入25mLIXTAE缓冲液和0.25g琼脂糖，放进微波炉加热至琼脂糖融化，冷却到手背可以承受的温度时，再加入2.5yL的GoldviewTM核酸染料，混合后倒入制胶板当中。取出4yL实施例1提取溶解的总RNA与IyL的Loadingbuffer混合后进行加样，在70mA、100V下进行电泳30min后，在紫外光下观察，结果如图1所示，图1中各泳道标号分别是:Rl，R2，R3，三个泳道均为提取的RNA，从图1可以看到三条带，并且28S条带与18S条带亮度比大约为2:1，证明提出的总RNA可以用于后面的实验。[0048]实施例3第一链cDNA的合成[0049]采用上海生工生物工程有限公司的AMV第一链cDNA合成试剂盒，合成第一链cDNA，将离心管插入冰中加入以下反应试剂：[0050]实施例1提取溶解的总RNA2yL[0051]OligodtPrimer0.5ygyLIyL[0052]RNasefreeCldH2O使终体积为12yL[0053]将上述配制好的总体积为12yL的溶液，于4000rpmmin离心2min，再将反应混合物放在65°C的水浴锅中水浴5min，再插入冰中30s，离心2min，取上清液。[0054]将装有上清液的试管置于冰上，再加入如下组份：[0059]混勾后离心2min，在PCR仪上进行反转录反应，42°C处理60min以便cDNA的合成，然后85°C处理5min使酶失活，处理后，置于-20°C冰箱中保存。[0060]实施例4硫苷酶基因的扩增[0061]比较油菜、芥菜等植物硫苷酶基因的核苷酸序列，选取同源性较高的区域，设计一对正反向引物，以实施例3合成的第一链cDNA为模板进行PCR反应。[0062]上引物1:[0064]上引物2:[0066]下引物：[0068]准备4个离心管，置于冰上依次均加入如下组份：[0069]10XPCRBuffer5yL含ImMMgCl2[0070]IOXdNTP5yL[0071]上引物110μΜ2yL[0072]上引物210μΜ2yL[0073]下引物（10μΜ2yL[0074]PfuDNA聚合酶0.5yL5U[0075]用枪将混合液混匀，再加入实施例3合成的模板cDNA2yL，补水使终体积为50μL，离心2min，分装到PCR管中，再加入25yL的灭菌石蜡油。[0076]在PCR仪中进行如下反应：[0082]4°C保存。[0083]PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并进行回收纯化;然后以此为模板进一步扩增获得硫苷酶基因的全长序列。电泳图如图2所示，图2中泳道分别标示为:？1，？2，？3，？4，1;1是DNAMarker2000;其余四道分别都是代表扩增的DNA;由图2可以看出，已经扩增出了目的条带。经测序，扩增的基因全长序列如SEQIDNO.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0084]将获得的茎瘤芥硫苷酶基因全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列在NCBI网站上BLAST，如图3所示，结果表明该序列与芥蓝、欧洲油菜、菜心、大白菜、萝卜的硫苷酶基因的同源性比较分别是98%、97%、96%、96%、95%。[0085]在氨基酸水平上，莖瘤芥硫苷酶的氨基酸序列与芥蓝、欧洲油菜、菜心、大白菜、萝卜分别有97%、98%、94%、93%、93%的相似性，如图4所示。[0086]实施例5重组子的构建、筛选和表达[0087]1、制备感受态大肠杆菌DHlOB:[0088]将-80°C冻存的甘油菌种DHlOB取出，挑取一环接种在LB琼脂平板上，37°C培养过夜。待菌落长出后，挑取单克隆至装有3mLLB培养液的试管中，37°C，250rpmh振摇过夜。取5mL的菌液到试管中再加入500mLLB培养液，再次振摇培养3h，当㈤600的值为0.3左右时，将试管取出冰浴半小时。在4°C条件下，分装到50mL离心管中离心，除去上清，每管细菌用0.IMCaCl2溶液重悬，重复一次，即可用于转化。多余菌体分装到离心管中，加入无菌甘油立即保存于-72°C条件下。[0089]2、载体pPIC9K-S的制备：[0090]采用北京天根公司的小提中量试剂盒提取PPIC9K-S质粒，用EcoRI和NotI双酶切，酶切体系和反应条件如下：[0097]将上述混合均匀的反应混合液在37°C条件下酶切过夜，再进行鉴定后将该片段进行回收处理并储存在_20°C的条件下。[0098]3、融合蛋白表达载体的构建与转化：[0099]将实施例4得到的硫苷酶基因与本步骤2已酶切表达载体杂交，杂交体系与反应条件如下：[0100]10X杂交混合液5yL[0101]实施例4得到的硫苷酶基因MYRl25ngyL6yL[0102]步骤2酶切表达载体pPIC9K-S20ngAxL8yL[0103]ddH20IyL[0104]将上述反应溶液混合均匀，于25°C反应30分钟后;将10yL连接产物与200yL本实施例步骤1得到的感受态细胞DHlOB慢慢混匀，冰上放置半小时，不摇动;42°C热休克Imin，使质粒进入细胞，立即置冰上2min;再加入800yLLB培养液，于150rpmh振摇半小时。[0105]取100-150yL上述转化的细胞加到含氨苄抗性的LB平板上，将细胞均匀涂开，直至IJ干燥。倒放平板，37°C培养18小时;将长出的单菌落克隆4°C保存，以备检验。检验过程经过PCR鉴定，挑出阳性克隆菌，送DNA测序鉴定。[0106]4、电转化：[0107]步骤3测序正确的阳性克隆，用小提中量试剂盒抽提质粒20yg，用SalI单酶切线性化处理。[0113]37°C酶切过夜，取10此酶切产物凝胶分析，以确定是否酶切完全。[0114]准备感受态细胞SMDl168，YH平板划板酵母菌株SMDl168，培养3天放4°C冰箱，制备感受态细胞；准备1个1.5mL离心管冰浴，加入100yL浓缩的毕赤酵母感受态细胞3]\«1168，1^8待转化0嫩6311单酶切线性化处理后的？？1091-3-]\^1体积小于等于10yL，混匀，冰上静置5min。将混合物转移到电击杯底部，需轻轻敲至底部，冰上静置3min;以1.5kV、25uF、200Ω做脉冲转化，将比色皿送入电转室中，直到和两个电极接触；电转一次，脉冲参数为时间5.5ms，1.5kV。将比色皿移出，立即加入ImL冰冷的IM山梨醇，轻柔的将稀释后的细胞移入试管中，然后轻轻吹吸混匀。[0115]进行营养缺陷型筛选，细胞30°C培养lh，然后再涂MD板。每板MD涂150yL左右山梨醇孵育的转化细胞，取30yLSMDl168涂MD板，30°C培养3-6天，培养箱需放水防干。板放4°C冰箱保存。[0116]5、筛选遗传酶素抗性转化子：[0117]1准备2个平板，一个的遗传霉素浓度为0.25mgmL，另一个的遗传霉素浓度为2.0mgmL，吸取3mL灭菌水于所有HIS+转化子平板上，用枪头重悬HIS+转化子，将细胞悬液转移到灭菌离心管中，稍涡旋IOS左右。用分光光度计测定浓度（1㈤600=5XIO7细胞mL，在每块含有遗传霉素的YPD平板上涂IO5细胞，抗遗传霉素克隆3天左右出现。[0118]6、表达：[0119]挑取单克隆至3mLYPD培养基培养，平行两管。在28°C条件下，300rpmh振摇到0D600值为2-5之间。取出2mL离心10min其它菌液4°C保存用于保菌），收集细胞，去除上清液，用BMMY重悬细胞到ImL，进行诱导表达。每24小时，加甲醇至甲醇的终体积浓度为0.5%以继续诱导（10yL左右，因会有少量挂壁），诱导72h后取ImL至离心管离心，取上清液。这些样品用于分析表达水平。[0120]6.1SDS-PAGE鉴定[0121]取40yL上述离心后的上清样品，加入6Xloadingbuffer10yL，开盖加热，浓缩样品，然后进行10%Tricine胶电泳，考马斯亮蓝染色。结果如图5所示，由图5可知，在经过72小时的培养后发现了可溶性蛋白和沉淀在90KDa处出现了一条亮带，与硫苷酶的预期值较吻合，且6个克隆均为阳性克隆。[0122]6.2保菌[0123]挑选高表达的菌株划板培养2-3天，挑取菌落在YPD中培养。收集细胞，在含10%甘油的YH中悬浮到㈤600的值为50-100,于-80°C贮存。[0124]6.3大规模表达[0125]pPIC9K-S-Myrl甘油菌划板YPD平板，30°C培养3-4天;挑取单克隆至3mLYPD培养基中培养，平行两管;28°C，振摇培养300rpmh到0D600值为2-6左右;接种至含250mLBMGY的摇瓶中，28-30°C剧烈振荡，至对数生长期测㈤600值为2-6左右，收集细胞，离心去除上清，用BMMY重悬细胞进行诱导表达。在每个摇瓶中加入400mL的上述培养物，加盖四层灭菌纱布，放入摇床培养。第二天加甲醇至甲醇终体积1%，之后每诱导24小时加甲醇至甲醇终体积浓度为1%，72h收集上清。[0126]实施例6融合蛋白的纯化和活性鉴定[0127]1、纯化：[0128]用2倍柱体积的平衡缓冲液20mMTrisCl,300MmNaCl,20mM咪唑，pH8.0以15mLmin的流速平衡Ni2+柱，待平衡完毕，将预先调好pH为8.0的发酵液上述培养并诱导表达后的目的酶发酵液）以10mLmin的流速上样。待上样完毕，用平衡缓冲液淋洗5-10个柱体积直至流出基线水平，用洗脱缓冲液（20mMTrisCL，300mMNaCL，300mM咪唑，PH8.0进行洗脱，收集硫苷酶融合蛋白流出峰，电泳检测。结果如图6所示，由图6可见，经过纯化后的融合蛋白在凝胶上有一条90KDa大小的条带，经过纯化后的融合蛋白可以进一步的测定活性。[0129]2、活性测定：[0130]按下列的反应体系进行测定，所述样品酶为上述表达并纯化后的茎瘤芥硫苷酶，标准酶为Sinigrin黑芥子苷;测定结果如表1所示：[0131]表1反应试剂表[0134]上述反应体系于45°C水浴反应10min反应，反应结束后立即将反应液于100°C沸水浴中灭活10min，冷却后进行HPLC分析，检测剩余硫苷含量。结果如图7所示，由图可得，在45°C条件下，重组子所表达的粗蛋白能够水解硫苷，表现出了硫苷酶的生物活性，达到了预期的效果，而将样品与标准样品所对比发现，样品的硫苷峰高同加入0.5U酶标准品的硫苷峰高接近，因此样品中的硫苷酶比活力约为〇.003UyL。[0135]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

权利要求：1.一种茎瘤芥硫苷酶基因MYRl，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的序列，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的序列。2.—种茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法，其特征在于，包括如下步骤：1取茎瘤芥叶片，提取总RNA;2以步骤1提取的总RNA为模板，在PCR仪上通过反转录反应，合成第一链cDNA;3比较油菜和芥菜硫苷酶基因的核苷酸序列，设计一对正反向引物，所述引物为：上引物1:5’_GATCCGGTTCTGGCGAATTCGACGACGACGACAAGGATGAAGAAATCAC-3’；上引物2:5,-CGACGACGACAAGGATGAAGAAATCACATGTGAAGAAAATAACC-3,；下引物：5’-GGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTATTAAGCATCTGCGAAACGCTTCTTTTG-3’；4以步骤2合成的第一链cDNA为模板，采用步骤3所设计的引物，进行PCR反应，扩增获得硫苷酶基因MYRl的全长序列，所述硫苷酶基因MYRl的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；5提取载体PPIC9K-S质粒，并用EcoRI和NotI双酶切所述质粒；6将步骤4获得的硫苷酶基因MYRl与步骤5双酶切后的表达载体杂交，获得重组表达载体PPIC9K-S-MYR1;7将步骤6重组表达载体转化感受态细胞大肠杆菌DHlOB，将转化后的细胞在含氨苄抗性的LB平板上于37°C培养18小时，经PCR鉴定筛选阳性克隆菌并测序；8将步骤7测序正确的阳性克隆培养，并提取质粒，采用SalI单酶切线性化处理，用于毕赤酵母SMD1168电转化；9将SalI单酶切线性化处理的重组表达载体pPIC9K-S-MYRl，电转化入毕赤酵母SMDl168，涂布MD平板于30°C培养3-6天，并通过G418抗性，筛选得到遗传霉素抗性转化子；10挑取遗传霉素抗性转化子的单克隆至YPD培养基培养，在28°C条件下，以300rpmh的转速振摇到0D600值为2-5之间，离心弃去上清液，向沉淀中加入BMMY液体培养基重悬细胞；利用甲醇连续诱导表达，期间每24小时加甲醇至甲醇的终体积浓度为0.5%以继续诱导，诱导72h后，利用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白的表达。

百度查询： 长江师范学院 一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法

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