申请/专利权人：天津大学

申请日：2018-02-13

公开（公告）日：2018-08-21

公开（公告）号：CN108424924A

主分类号：C12N15/62(2006.01)I

分类号：C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2018.09.14#实质审查的生效;2018.08.21#公开

摘要：本发明公开了融合蛋白HFBI‑RGD基因及蛋白，融合蛋白HFBI‑RGD基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示。本发明的融合蛋白HFBI‑RGD具有溶解性好、生产周期短以及产量高的特点。本发明的HFBI‑RGD融合蛋白既具有HFBI的结构和功能，又具有细胞黏附活性，这种融合蛋白能够定位到含整合素的肿瘤部位而具有较好的靶向性。HFBI‑RGD融合蛋白仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，可以作为分散剂分散石墨烯、碳纳米管以及疏水性荧光探针，解决疏水性材料分散问题，并且由于该融合蛋白包含短肽RGD，这又赋予该融合蛋白整合素靶向性，可用于肿瘤诊断、药物传输等领域。

主权项：1.融合蛋白HFBI‑RGD基因，其特征是所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示。

全文数据：融合蛋白HFBI-RGD基因及蛋白技术领域[0001]本发明属于蛋白的基因工程领域，具体地涉及一种融合蛋白HFBI-RGD基因及其制备方法。背景技术[0002]真菌疏水蛋白（hydrophobins是由丝状真菌分泌产生的含有丰富的疏水氨基酸的分子量大约为IOkDa的两性蛋白，具有特殊的物理和化学性质，在菌丝与空气的接触中起到重要作用。真菌疏水蛋白具有疏水和亲水两部分，通过自组装可以使得在界面处形成约IOnm的两性蛋白膜，这些膜可以使亲水和疏水表面发生逆转，使得亲水性的物质具有疏水性，疏水性物质具有亲水性。根据疏水蛋白形成的蛋白膜的溶解性，真菌疏水蛋白分为I型和II型。其中，II型疏水蛋白包含HFBI。真菌疏水蛋白HFBI被认为是已知的表面活性最高的蛋白之一。近些年真菌疏水蛋白在国际上得到了广泛的应用，在不同领域有许多不同的理论价值和应用价值，如个人护理产品和乳液，分离技术，生物传感器和电极，生物材料等等。[0003]癌症已经成为威胁人类生命的重大病症之一，因此研究诊断和治疗癌症的方法已成为许多科研工作者的研究焦点。为了能更好的探测肿瘤，为了提高药物的利用率，肿瘤靶向性的研究成为主要的研究方向。RGD是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg-GlyAsp的三肽序列。整合素是一个异源二聚体组成的膜受体蛋白家族，能特异性识别RGD13R⑶肽广泛存在于生物体内，具有分子质量小、剪切力分散和有机溶剂影响较小的优点。整合素由α和β亚基组成，位于细胞表面。迄今为止已发现有18种不同的α亚基和8种不同的β亚基组成的24种异源二聚体。其中ανβ3研究较为广泛，主要在肿瘤血管生成和肿瘤细胞转移中起作用。RGD是整合素与其配体蛋白相互作用的识别位点，介导细胞与胞外基质及细胞间的黏附作用，同时具有信号传导功能，从而介导许多重要的生命活动。RGD与肿瘤细胞表面的整合素ανβ3有强的亲和性，被用于给肿瘤细胞传送药物，基因的靶向载体等。[0004]目前，尚未有将一种真菌疏水蛋白HFBI和RGD序列制备成融合蛋白的报道。尽管对于疏水蛋白而言具有许多重要的理论和应用价值，但要将其应用于分子诊断，药物传输及靶向载体等方面仍存在不足。发明内容[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种融合蛋白HFBI-RGD基因。[0006]本发明的第二个目的是提供一种融合蛋白HFBI-RGD基因表达的蛋白。[0007]本发明的第三个目的是提供一种含有融合蛋白HFBI-R⑶基因的质粒。[0008]本发明的第四个目的是提供一种含有融合蛋白HFBI-R⑶基因的重组菌株。[0009]本发明的技术方案概述如下：[0010]融合蛋白HFBI-R⑶基因，所述基因的核苷酸序列是SEQIDNO.1所示。[0011]融合蛋白HFBI-R⑶基因表达的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列是SEQIDNO.2所示。[0012]含有融合蛋白HFBI-RGD基因的质粒，用下述方法构建：以瑞氏木霉Trichodermareesei中SEQIDNO.3所示的HFBI核苷酸序列为模板，以Fl为正向引物，以Rl为反向引物，进行第一轮PCR，得到第一种PCR产物；以第一种PCR产物为模板，以Fl为正向引物，以R2为反向引物，进行第二轮PCR，得到第一种含有融合蛋白HFBI-RGD基因的序列，经酶切及T4DNA连接酶连接，将融合蛋白HFBI-RGD基因构建到PET-28a载体上，得到PET-28a-HFBI-R⑶质粒；以PET-28a-HFBI-R⑶质粒为模板，以F2为正向引物，以R3为反向引物，进行PCR，得到第二种含有融合蛋白HFBI-RGD基因的序列，经酶切及T4DNA连接酶连接，将融合蛋白HFBI-RGD基因构建到pPIC9k载体上，得到pPIC9k-HFBI-RGD质粒；[0013]Fl的核苷酸序列是SEQIDNO.6所示；[0014]Rl的核苷酸序列是SEQIDNO.7所示；[0015]R2的核苷酸序列是SEQIDNO.8所示；[0016]F2的核苷酸序列是SEQIDNO.9所示；[0017]R3的核苷酸序列是SEQIDNO.10所示；[0018]融合蛋白HFBI-R⑶基因的核苷酸序列是SEQIDNO.1所示。[0019]含有融合蛋白HFBI-R⑶基因的重组菌株，用下述方法构建:将pPIC9k-HFBI-R⑶质粒电转化到毕赤酵母GS115菌株中，得到含有融合蛋白HFBI-RGD基因的重组菌株。[0020]本发明的优点：[0021]本发明采用毕赤酵母的表达系统，利用基因工程的方法对原有的HFBI基因进行改造，获得的融合蛋白HFBI-RGD具有溶解性好、生产周期短以及产量高的特点。实验表明，IL的BMM培养基可以得到15mg目的蛋白HFBI-RGD。本发明的HFBI-RGD融合蛋白既具有HFBI的结构和功能，又具有细胞黏附活性，这种融合蛋白能够定位到含整合素的肿瘤部位而具有较好的靶向性。HFBI-RGD融合蛋白仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，可以作为分散剂分散石墨烯、碳纳米管以及疏水性荧光探针，解决疏水性材料分散问题，并且由于该融合蛋白包含短肽RGD，这又赋予该融合蛋白整合素靶向性，可用于肿瘤诊断、药物传输等领域。附图说明[0022]图1为BCA蛋白总量分析筛选阳性克隆。[0023]图2为HFBI-R⑶蛋白高效液相色谱层析检测图。[0024]图3为HFBI-RGD蛋白SDS-PAGE凝胶检测图。[0025]图4为HFBI-R⑶蛋白分散荧光探针B0DIPY。[0026]图5为HFBI-R⑶蛋白分散的BODIPY富集于小鼠U-87MG及HeLa肿瘤部位图。[0027]图6为融合蛋白HFBI-R⑶修饰多壁碳纳米管。[0028]图7为册81-1«08001?¥进入1]-871«及拖1^细胞共聚焦成像。具体实施方式[0029]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。[0030]pPIC9k和PET-28a为市售。毕赤酵母GS115菌株市售。[0031]实验材料：[0032]ILB培养基:配制每IOOOmL培养基，在IOOOmL的一次蒸馏水中加入蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，溶解后，121°C、0.1MPa灭菌20min。配置固体LB培养基时向培养基内补加1.5%的琼脂粉。[0033]2YPD培养基:配制每IOOOmL培养基，在IOOOmL的一次蒸馏水中加入蛋白胨20g，酵母粉10g，NaCl8g，葡萄糖20g。[0034]3MD固体培养基:配制每IOOmL培养基，在IOOmL的一次蒸馏水中加入无氨基酸酵母氮源1.34g，葡萄糖2.0g，琼脂2.2g。[0035]4MM固体培养基:配制每IOOmL培养基，在IOOmL的一次蒸馏水中加入无氨基酸酵母氮源1.34g，琼脂2.2g。灭菌后，倒入平板前，加入0.75mL无水甲醇。[0036]5BMG培养基:配制每IOOOmL培养基，在890mL的一次蒸馏水中加入无氨基酸酵母氮源14.4g，IOOmLIMpH6.0的磷酸盐缓冲液，IOmL甘油。[0037]6BMM培养基:配制每IOOOmL培养基，在890mL的一次蒸馏水中加入无氨基酸酵母氮源14.4g，IOOmLIMpH6.0的磷酸盐缓冲液，6mL无水甲醇。[0038]7SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳）[0039]30%丙烯酰胺溶液（IOOmL:将30g丙烯酰胺与0.Sg的甲叉双丙烯酰胺溶解在IOOmL的双蒸水中，溶解后放置于4°C棕色瓶内。[0040]1.5MTris-HClρΗ=8·8缓冲液（IL:称取181.71gTris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8,定容至1L，室温保存。[0041]0.5MTris-HClρΗ=6·8缓冲液500mL:称取60.57gTris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至50〇11^，室温保存。[0042]10%十二烷基硫酸钠（10%303溶液（501^:称取58303，加纯水至501^，室温保存。[0043]10%过硫酸铵（10%APS溶液20mL:称取2g过硫酸铵，加纯水至20mL，每管500yL分装，-20°C保存备用。[0044]表I12%SDS-PAGE分离胶配制（IOmL[0045][0046]表2SDS-PAGE浓缩胶配制（5mL[0047][0048]85XTris-甘氨酸电泳缓冲液5L:称取75.5gTris，470g甘氨酸，25gSDS，加纯水溶解，定容至5L。[0049]96X蛋白上样缓冲液：0.35MpH=6.8Tris-HCl，10.28%WVSDS，36%甘油，5%β-巯基乙醇，0.012gmL溴酚蓝，ImL每管分装，-20°C保存备用。[0050]实施例IpET-28a-HFBI-R⑶的构建：[0051]以瑞氏木霉（Trichodermareesei中SEQIDNO.3所示的HFBI核苷酸序列为模板，以Fl为正向引物，以Rl为反向引物，进行第一轮PCR，得到第一种PCR产物；以第一种PCR产物为模板，以Fl为正向引物，以R2为反向引物，进行第二轮PCR，得到第一种含有融合蛋白HFBI-RGD基因的序列，经酶切及T4DNA连接酶连接，将融合蛋白HFBI-RGD基因构建到PET-28a载体上，得到PET-28a-HFBI-R⑶质粒。具体步骤如下：[0052]a酶切体系I,DNA20μΙ,i:L丨kbuil'er5μ!"[0053]Ii!.EcoRi2μ[_.[ν.Xhol2μ].,ν.ddH：02!μΙ..[0054]b条件[0055]i.目的基因酶切lh，37°C。[0056]^.质粒酶切111，37。：。[0057]iii.酶切后80。：灭活511^11。[0058]c以瑞氏木霉（Trichodermareesei中SEQIDNO.3所示的HFBI核苷酸序列为模板，外加设计的linker及RGD序列，进行PCR以得到HFBI-RGD序列。其中linker基因序列如SEQIDNO.4所示，RGD序列如SEQIDNO.5所示。具体步骤如下：[0059]根据瑞氏木霉（TrichodermareeseiHFBI,RGD及Linker的基因序列，通过primer软件，设计出上游引物与下游引物，分别命名为Fl，R1，R2。第一次PCR过程中，上游引物为Fl，下游引物为Rl，模板为含有HFBI基因序列的质粒。第二次PCR体系和第一次体系一样，不同的是，下游引物为R2,模板为第一次的PCR产物。在PCR仪中经过两次PCR，得到目标基因序列。PCR体系及程序设定如下表所示：[0060]表3PCR体系[0061][0062]表4PCR仪设定程序[0063][0064]PCR结束，将IyL的ΠGreenBuffer加入到IOyL的PCR产物中，用移液器吹打均匀，然后将样品加入到已配好的2%的琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外灯下切下目的片段，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒天根进行回收。[0065]将上述PCR之后的目的基因片段与载体PET_28a分别用FastDigestEcoRI和FastDigestXhoI进行双酶切，37°C水浴酶切30min，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收，得到含粘性末端的目的基因片段和PET-28a载体。酶切体系50yL，各组分及含量如表5所示：[0066]表5酶切体系[0067][0068]将上述的产物用胶回收试剂盒进行胶回收，得到含粘性末端的目的基因片段和PET-28a载体，并将其按照5:1摩尔比的比例加入到连接体系内，22°C连接2h，得到PET-28a-HFBI-R⑶质粒，连接体系20yL，各组分及含量如表6所示：[0069]表6连接体系[0070][0071]实施例2pPIC9k-HFBI-R⑶的构建：[0072]1选择载体为pPIC9k，酶切位点为NotI和EcoRI，设计引物进行PCR，PCR体系如表3所示。引物设计为F2、R3。将上述实施例1构建的质粒PET-28a-HFBI-R⑶作为模板，PCR可得到酶切位点为NotI和EcoRI的第二种含有融合蛋白HFBI-RGD基因的序列。[0073]2用限制性内切酶NotI和EcoRI对上述PCR产物和载体pPIC9k分别进行双酶切，使目的基因片段和载体出现粘性末端。具体酶切体系及方法如下所示：iDNA20μΙ,ii.lOxbuilbi'5μί_.[0074]iii.iicoRl2μ[ίγ.Ν.οίΐ2uLddH'O2:μ[..[0075]3将有粘性末端的目的基因片段和载体pPIC9k使用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如上表6所示。[0076]4再经过转化及双酶切验证，将得到的阳性结果进行测序验证。最终得到pPIC9k-HFBI-RGD构建成功质粒。[0077]实施例3融合蛋白HFBI-R⑶阳性克隆筛选及表达纯化：[0078]1重组表达载体要在酵母菌细胞中以较高拷贝插入酵母基因组中，需要在转入酵母细胞前对其进行线性化。利用引物设计软件Primer5.0中提供的酶切位点分析功能对pPIC9k以及HFBI-R⑶基因进行酶切位点分析，结合Ivitrogen公司在毕赤酵母表达系统操作手册中提供的酶切位点信息，最终以限制性内切酶Sa11对载体进行酶切线性化。酶切线性化的反应体系如表7所示。此体系在37°C水浴酶切2h。取5yL产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全，再将产物的条带进行胶回收。[0079]表7线性化体系[0080][0081]2毕赤酵母电转化感受态的制备[0082]吸取15yL毕赤酵母GS115菌液转接至5mLYPD试管培养基中，30°C，250rpm培养过夜。第二天从试管培养物中取0.1-0.5mL过夜培养物，接种至含500mL新鲜Yro培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD6qq约为1.3-1.5。从摇床上取酵母培养物，4°：，150^离心51^11以收集细胞，之后在IOOmLYPD-HEPES-DTT77.5mLYPD中加入20mLpH8.0的HEPES缓冲液，再加入2.5mL新鲜配制的IM的DTT培养基中重新悬浮细胞，30°C在摇床上培养15min;从摇床上取下细胞，冰浴半小时；4°C，1500g离心5min以收集细胞，再用250mL预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，再用20mL预冷的IM山梨醇水溶液悬浮细胞;如上离心，用ImL预冷的IM山梨醇水溶液悬浮细胞，至终体积约1.5mL;如上离心，用500yL预冷超纯水重新悬浮细胞，冰浴中备用。[0083]3毕赤酵母的电转化[0084]将5-20yg线性化的pPIC9k-HFBI-RGD加入到80yL感受态细胞中，转入预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5min;1.5kV电击后，立即将ImL预冷的IM山梨醇水溶液至转化杯中，再将其转移至灭菌离心管中，在30°C培养箱中静置复苏Ih，分成200-600yL不等份，涂于MD平板上。在30°C培养箱中培养至克隆产生约需3天），筛选Mut+Muts表型。[0085]4毕赤酵母阳性转化子的筛选[0086]在新的MD平板上画出四方格，并标好序号。用无菌牙签从MD平板上挑选长出的His+转化子至新的MD平板上，每一个小格里挑一个克隆。让其过夜生长，第二天，将40个不同的单克隆挑于40个不同的5mLYPD试管培养基中，250rpm，30°C培养过夜，然后将40个单克隆的菌液吸600yL加入到装有400yL50%甘油的EP管中，保存甘油菌。剩下的进行酵母基因组提取和转化子PCR鉴定。PCR体系如表8所示。[0087]表8PCR体系[0088][0089]扩增条件如下:94°C预变性5min，94°C变性lmin，60°C退火45s，72°C延伸1.5min，共30个循环，最后72°C延伸IOmin13PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过跑胶结果可以检测出是否有HFBI-RGD基因插入基因组，找到阳性克隆。上述引物A0X1-3’及A0X1-5’分别为SEQIDNO.11及SEQIDNO.12所示。[0090]5阳性克隆试表达[0091]经过PCR验证有13个结果为阳性克隆，将这13个单克隆进行试表达。将之前保存的这13个阳性克隆的甘油菌各吸30yL分别转至于5mL的YH培养基中，30°C，250rpm摇床过夜培养。然后吸取一定体积的菌液转到IOmL的BMG培养基中，使得此时的OD值为0.025。每过一段时间测一下OD值，当OD值为2至6时，再吸取一定量的菌液转至BMM中，使得此时的OD值为1。转至BMM后，每隔24h加入IOOyL的甲醇作为诱导剂，诱导120h。诱导完成后收菌，将菌液离心取其上清液，将上清液进行BCA蛋白总量测定，选出表达量最高的阳性克隆8，如图1所示。[0092]6毕赤酵母HFBI-R⑶的大量表达纯化[0093]经过试表达，筛选出表达量最高的阳性克隆8。于是，用该转化子进行表达纯化。吸取30yL的甘油菌到5mL的YPD培养基中，30°C，250rpm过夜培养。然后吸取一定量的菌液分别至5个含有200mL的BMG培养基的IL培养瓶中，使得此时的OD值为0.025。每过一段时间测一下OD值，当OD值为2至6时，再吸取一定量的菌液转至BMM中，使得此时的OD值为1。转至BMM后，每隔24h加入2mL的甲醇作为诱导剂，诱导120h。诱导完成后，离心取上清，然后进行浓缩，将体积浓缩至30mL。将浓缩后的样品进行处理，用HPLC来获取纯的目的蛋白HFBI-RGD。样品处理如下：给样品中加入乙腈至乙腈终浓度为40%，分装到EP管中16000g，40min离心，然后取上清液抽滤。使用HPLC制备柱进行纯化。HPLC纯化如图2所示。得到的HFBI-R⑶融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，由电泳图（图3可知:HPLC系统纯化后，在10kDa-15kDa之间，出现一条纯净的特异性蛋白条带，其分子量与融合蛋白HFBI的分子量相吻合，表明HFBI-RGD疏水蛋白纯化成功。[0094]实施例4[0095]化合物⑴的制备[0096][0097]1对甲氧羰基苯基-1，3,5,7_四甲基二吡咯烯氟硼化合物BODVI的合成[0098]取IOOmL单口圆底烧瓶，加入0.864g5.2mmol对甲氧羰基苯甲醛（III和32mL新蒸的二氯甲烷;加入ImL10.Ommol新蒸的2，4_二甲基吡咯（II。避光环境下，氮气鼓泡30min，除去烧瓶中的氧气;常温下磁力搅拌。鼓泡结束后，氮气保护下，用注射器缓慢加入0.08mL三氟乙酸，继续避光反应。反应间隙，每隔30min取样进行TLC分析，约4h后，原料点消失，得到化合物（IV。2,4_二甲基吡咯反应完全后，除去氮气保护，用5mL二氯甲烷和5mL四氢呋喃溶解1.2g2.6mmol2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌（DDQ，用恒压滴液漏斗逐滴20min左右加入到上述反应液中，磁力搅拌下继续反应1小时，得到化合物V。量取8.6mL三乙胺逐滴加入，持续约IOmin;之后用冰水浴冷却反应液5min，然后逐滴加入8.6mL三氟化硼乙醚，持续时间约20min。半小时后撤去冰水浴，室温下磁力搅拌避光反应。反应3h后，新生成的物质浓度不再发生变化，停止反应。用水洗反应液三次，二氯甲烷萃取，加入无水硫酸钠过夜干燥。将所得物质先用短硅胶柱初步分离，完全除去紫黑色的焦油部分;旋干所得到的深紫色粗产品溶液。柱层析分离，选用300-400目硅胶，二氯甲烷:石油醚=2:1vv淋洗，接取第二个橙黄色色带的洗脱剂，旋干，用二氯甲烷和正己烷进行重结晶，得到红色粉末状固体肋0化合物¥121011^0.524_〇1，产率为12%。1!1匪1?4001抱，〇：1348.181，J=8.0Hz,2H,7.41d,J=8.0Hz,2H,5.99s,2H,3.97s,3H,2.56s,6H,1.36s,6H.MALDI-TOF-MS:[M]+caIcdforC21H21BF2N2O2,382.1660,found382.30.[0099]2目的BODIPY衍生物化合物I的合成[0100]取50mL单口圆底烧瓶，加入20mg0·0524mmol化合物BOD化合物VI和42·7mg0.157mmolN-乙基-3-甲酰基二卞化合物VII，溶于3mL溶剂苯中，同时用注射器向溶液中加入催化剂哌啶和冰醋酸，各0.ImL。在90°C下冷凝回流，避光下磁力搅拌。反应过程中，TLC检测反应进程。Ih后，反应液变为砖红色，而且颜色越来越深，2.5h后，反应液逐渐变成绿色，继续反应，若溶剂减少，则补加溶剂和催化剂哌啶、冰醋酸，反应11-12h后，原料和产物浓度基本不再变化，停止反应，避光自然冷却。用水洗涤反应液，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，将产物旋干，柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:石油醚=2:1vv，接收蓝色色带，用二氯甲烷和正己烷重结晶，得到深绿色固体18.7mg，产物产率为50%。1K^MR400MHz，DMSO:59.37s,8.37Hz,2H,8.23d,J=7.7Hz,4H,7.864m,7.86Hz,4H,7.52m,J=13.8Hz,6H,7.46m,J=8.2Hz,4H,7.32t,J=7.4Hz,2H,6.74s,2H,4.34t,J=7.1Hz,4H,4.02s,3H,1.90m,4H；MALDI-TOF-MS:[M]+calcdforC55H53BF2N4O2850.4230,found848.0673。（化合物I[0101]实施例5[0102]融合蛋白HFBI-R⑶修饰多壁碳纳米管[0103]1准确称取Img的融合蛋白HFBI-RGDSEQIDNO.2，加双蒸水至500yL融合蛋白HFBI-RGD的浓度2mgmL;[0104]2吸取75yL步骤⑴配制的融合蛋白HFBI-RGD溶液，加入PBSρΗ=7·4至ImL;[0105]3用步骤2获得的融合蛋白HFBI-RGD溶液与Img多壁碳纳米管MWCNTs混合，使用探头超声仪进行超声，功率为180W，超声lh，得到稳定分散的HFBI-RGDMWCNTs，见图6。[0106]实施例6[0107]融合蛋白HFBI-R⑶修饰BODIPY衍生物（化合物I[0108]1准确称取Img的融合蛋白HFBI-RGDSEQIDNO.2，加双蒸水至500yL融合蛋白HFBI-RGD的浓度2mgmL;[0109]2吸取75yL步骤⑴配制的融合蛋白HFBI-RGD溶液，加入PBSρΗ=7·4至ImL;[0110]⑶用步骤⑵获得的融合蛋白HFBI-RGD溶液与ImgBODIPY衍生物混合，使用探头超声仪进行超声，功率为180W，超声lh，得到稳定分散的HFBI-RGDBODIPY，如图4。[0111]实施例7[0112]实施例6获得的稳定分散的HFBI-RGDBODIPY用于活体成像[0113]1细胞荧光成像[0114]使用DMEM培养基培养Hela细胞，使用RPMI1640培养基培养U-87MG细胞，待细胞生长至60%左右铺板率时，使用胰酶消化细胞，分别加入到提前加入细胞爬片的48孔板内培养细胞。细胞铺板密度分别为:HeIa细胞，每孔1万细胞;U-87MG细胞，每孔8000细胞。每孔加入原先各自使用的培养基200μ1培养细胞。细胞培养24h后，吸弃原培养液，分别用含ΙμΜHFBI-RGDBODIPY的各自的培养基加入细胞中继续培养。培养4h，将细胞爬片使用DAPI染色，封片。具体封片过程如下：[0115]1将培养4h后，吸弃原含HFBI-RGDBODIPY的培养基，使用PBSpH=7.4清洗细胞三次；[0116]2向细胞中加入ΙΟΟμΙ4%多聚甲醛固定4min;[0117]3加入PBSpH=7.4清洗3次；[0118]⑷向细胞中加入DAPI染色5min，使用PBSpH=7.4清洗3次；[0119]5将防荧光淬灭剂加入到载玻片上，将处理好的细胞爬片倒扣在其上，使用透明指甲油密封，4°C保存；[0120]⑶使用共聚焦显微镜拍照，结果如图7所示。[0121]2小鼠活体成像[0122]购买20只6周龄的雌性裸鼠（nudemouse进行饲养，然后将U-87MG和Hela细胞接种于裸鼠右前腿腋下，让其长出肿瘤，再将HFBI-RGDBODIPY通过尾静脉注射到老鼠体内，进行活体成像。具体步骤如下：[0123]1复苏Hela和U-87MG细胞，进行培养，经过细胞传代，得到足够数量的Hela和U-87MG细胞。[0124]2将培养好的细胞用PBSpH=7.4制成细胞悬浮液，U-87MG细胞体积为lmL，他1细胞悬浮液体积为80^匕[0125]⑶裸鼠腋下注射肿瘤细胞。每只裸鼠腋下注射50yL的肿瘤细胞，约IxlO7个。[0126]⑷接种好肿瘤细胞后，饲养裸鼠大概2-3周的时间，待其肿瘤大小达到5-8mm进行测试。[0127]5待肿瘤长好后，给裸鼠尾静脉注射制备好BODIPY-HFBI-RGD样品。每只老鼠尾静脉注射200yL含17·7nmol的HFBI-RGDBODIPY的样品。[0128]6分别在注射后的2h，4h，6h，8h，24h，48h和72h用活体成像仪对小鼠进行观察，结果如图5所不。[0129]BODIPY荧光探针衍生物该荧光探针具有良好的近红外荧光特性，发射波长732nm，可应用于细胞或生物体内进行活体成像，减少细胞或组织的背景干扰。[0130]融合蛋白HFBI-RGD基因序列SEQIDNO.1人工合成）[0131]AGCAACGGCAACGGCAATGTTTGCCCTCCCGGCCTCTTCAGCAACCCCCAGTGCTGTGCCACCCAAGTCCTTGGCCTCATCGGCCTTGACTGCAAAGTCCCCTCCCAGAACGTTTACGACGGCACCGACTTCCGCAACGTCTGCGCCAAAACCGGCGCCCAGCCTCTCTGCTGCGTGGCCCCCGTTGCCGGCCAGGCTCTTCTGTGCCAGACCGCCGTCGGTGCTGGTGGAGGAGGTTCTGGCGGTGGAGGTTCTCGTGGTGATTGA[0132]融合蛋白HFBI-R⑶氨基酸序列SEQIDNO.2人工合成）[0133]SNGNGNVCPPGLFSNPQCCATQVLGLIGLDCKVPSQNVYDGTDFRNVCAKTGAQPLCCVAPVAGQALLCQTAVGAGGGGSGGGGSRGD[0134]HFBI核苷酸序列是SEQIDNO.3瑞氏木霉（Trichodermareesei[0135]ATGAAGTTCTTCGCCATCGCCGCTCTCTTTGCCGCCGCTGCCGTTGCCCAGCCTCTCGAGGACCGCAGCAACGGCAACGGCAATGTTTGCCCTCCCGGCCTCTTCAGCAACCCCCAGTGCTGTGCCACCCAAGTCCTTGGCCTCATCGGCCTTGACTGCAAAGTCCCCTCCCAGAACGTTTACGACGGCACCGACTTCCGCAACGTCTGCGCCAAAACCGGCGCCCAGCCTCTCTGCTGCGTGGCCCCCGTTGCCGGCCAGGCTCTTCTGTGCCAGACCGCCGTCGGTGCTTGALinker核苷酸序列SEQIDNO.4人工合成）[0136]GGTGGAGGAGGTTCTGGCGGTGGAGGTTCT[0137]R⑶核苷酸序列SEQIDNO.5人工合成）[0138]CGTGGTGAT[0139]正向引物Fl核苷酸序列SEQIDNO.6人工合成）[0140]GGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGTTTGCCCTCC[0141]反向引物Rl核苷酸序列SEQIDNO.7人工合成）[0142]GAACCTCCTCCACCAGCACCGACGGCGGTCTG[0143]反向引物R2核苷酸序列SEQIDNO.8人工合成）[0144]CCGCTCGAGATCACCACGAGAACCTCCACCGCC[0145]正向引物F2核苷酸序列SEQIDNO.9人工合成）[0146]GGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT[0147]反向引物R2核苷酸序列SEQIDNO.10人工合成）[0148]TTGCGGCCGCATCACCACGAGAACCTCCACCGCCAGA[0149]A0X1-3’核苷酸序列SEQIDN0.11人工合成）[0150]GCAAATGGCATTCTGACATCC[0151]A0X1-5’核苷酸序列SEQIDNO.12人工合成）[0152]GACTGGTTCCAATTGACAAG〇

权利要求：1.融合蛋白HFBI-R⑶基因，其特征是所述基因的核苷酸序列是SEQIDNO.1所示。2.权利要求1的融合蛋白HFBI-RGD基因表达的蛋白，其特征是所述蛋白的氨基酸序列是SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1的融合蛋白HFBI-RGD基因的质粒，其特征是用下述方法构建：以瑞氏木霉（Trichodermareesei中SEQIDNO.3所示的HFBI核苷酸序列为模板，以Fl为正向引物，以Rl为反向引物，进行第一轮PCR，得到第一种PCR产物；以第一种PCR产物为模板，以Fl为正向引物，以R2为反向引物，进行第二轮PCR，得到第一种含有融合蛋白HFBI-RGD基因的序列，经酶切及T4DNA连接酶连接，将融合蛋白HFBI-RGD基因构建到PET-28a载体上，得到PET-28a-HFBI-R⑶质粒；以PET-28a-HFBI-R⑶质粒为模板，以F2为正向引物，以R3为反向引物，进行PCR，得到第二种含有融合蛋白HFBI-RGD基因的序列，经酶切及T4DNA连接酶连接，将融合蛋白HFBI-RGD基因构建到pPIC9k载体上，得到pPIC9k-HFBI-R⑶质粒；Fl的核苷酸序列是SEQIDNO.6所示；Rl的核苷酸序列是SEQIDNO.7所示；R2的核苷酸序列是SEQIDNO.8所示；F2的核苷酸序列是SEQIDNO.9所示；R3的核苷酸序列是SEQIDNO.10所示；融合蛋白HFBI-R⑶基因的核苷酸序列是SEQIDNO.1所示。4.含有权利要求1融合蛋白HFBI-RGD基因的重组菌株，其特征是用下述方法构建:将权利要求3的pPIC9k-HFBI-RGD质粒电转化到毕赤酵母GS115菌株中，得到含有融合蛋白HFBI-R⑶基因的重组菌株。

百度查询： 天津大学 融合蛋白HFBI-RGD基因及蛋白

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD