申请/专利权人：南开大学

申请日：2017-09-05

公开（公告）日：2017-11-24

公开（公告）号：CN107384917A

主分类号：C12N15/11(2006.01)I

分类号：C12N15/11(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.20#授权;2017.12.19#实质审查的生效;2017.11.24#公开

摘要：本发明提供了mini‑gene剪接报告质粒及其构建方法与应用，所述mini‑gene剪接报告质粒具有序列表4001所示序列，通过PCR扩增获得三段DMD基因上的非连续序列，分别插入到pcDNA3.1中构建得到，可用于:1.鉴定和分析外显子及内含子中的剪接调控元件；2.检测微小突变点突变和微缺失重复是否会对外显子的剪接带来影响。

主权项：一种mini‑gene剪接报告质粒，其特征在于：为质粒NKU‑YC‑1，具有序列表4001所示序列。

全文数据：mini-gene剪接报告质粒及其构建方法与应用技术领域[000Ί]本发明涉及分子生物学领域，尤其是mini-gene剪接报告质粒及其构建方法与应用。背景技术[0002]RNA剪接是真核细胞基因表达中非常重要的一个生物过程，通过去除内含子并连接外显子，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mRNA，它对生物的发育及进化至关重要。[0003]mRNA前体的剪接就是在剪接体的催化下，除去内含子并将外显子拼接起来形成成熟的mRNA的过程，是高等真核生物基因表达的必要步骤，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。整个剪接过程是在细胞核中完成的，受到精细严格的调控。剪接位点的突变必然引起剪接模式的改变，正确的剪接位点序列及其位置都是保证RNA正常剪接的必要条件。剪接过程需要三个重要的剪接信号，分别是5’剪接位点（供体位点）、3’剪接位点（受体位点）和分支位点（内含子3’端附近）。5’端剪接位点一般是GU加上后续的几个不是特别保守的碱基，3’端剪接位点区域含有多个保守元件，依次是分支点，多聚嘧啶区和内含子3’端的AG。此外，剪接过程还需要一些其它的顺式调控元件的辅助作用，按照它们所在的位置和功能分为外显子剪接增强子ESE、外显子剪接沉默子ESS、内含子剪接增强子（ISE、内含子剪接沉默子ISS四类。若某些核苷酸的改变影响了剪接信号和作用元件，基因的剪接模式将会改变从而导致某些疾病的发生。另一方面，通过改变基因的剪接模式还可以修饰某些疾病的临床表型。随着反义寡核苷酸药物在临床上的应用和发展，mini-gene可以明确影响剪接模式的特定核苷酸序列，从而为寻找药物治疗靶点提供了一个有效的方法。此外，mini-gene可以通过研究某些化合物对基因剪接模式的的影响来对一些革El向治疗药物进行筛选，可用于脊髓性肌肉萎缩、肌营养不良症、家族性自主神经机能异常症以及其他的遗传性疾病的药物筛选。[0004]—般情况下，这些辅助调控元件通过招募一些反式作用因子即剪接调控蛋白来促进或抑制剪接位点的识别，并能通过调控剪接体的组装来实现对剪接过程的调控。目前已知的剪接调控蛋白主要是富含丝氨酸精氨酸蛋白（SR蛋白）家族和核不均一性核糖核蛋白hnRNP家族。一般情况下，SR蛋白结合在富嘌呤的ESE和ISE上，促进UlsnRNP与5’ss结合、U2AF与3’ss结合，还有U4U6-U5snRNP三聚体组装到剪接体上，进而增强剪接的效率;hnRNP家族成员则通常结合在ESS和ISS上抑制剪接位点识别及使用。通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用才能实现正确的剪接过程。[0005]在某些基因中由于剪接的供体、受体部位或其旁侧保守序列的突变，改变RNA前体的剪接方式，使得产生的成熟RNA中含有内含子或缺失外显子序列。剪接模式的正确性依赖于正确的剪接位点，而剪接模式发生错误与疾病关系重大，约14的遗传病是由于基因突变改变了正常剪接位点而导致的。由于正常剪接位点与剪接系统有高度的亲和性，一旦剪接点发生突变，会造成相应外显子跳读或邻近的隐蔽剪接位点的活化，这些隐蔽剪接位点存在于内含子或外显子中，因此在成熟mRNA分子中，就会保留一段内含子或缺失掉一段外显子，有时还可使正常基因转变成癌基因。大多数前体mRNA由于长度较大难以对其剪接作用进行研究，而且细胞中的一些内源性基因的突变也会改变剪接模式使得所表达的蛋白功能受到影响，因此对剪接作用的研究也尤为重要。另外，由于人类基因中会发生各种不同的突变，这些突变是否会对基因的剪接带来影响也难以得知，这对掌握突变与剪接以及剪接与疾病之间的关系带来困难。发明内容[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种mini-gene剪接报告质粒。[0007]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述mini-gene剪接报告质粒的构建方法。[0008]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述mini-gene剪接报告质粒的应用。[0009]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：[0010]一种mini-gene剪接报告质粒，为质粒NKU-YC-I，具有序列表〈4001所示序列。[0011]优选的，所述mini-gene剪接报告质粒，重组序列两端及其中间设有相应的酶切位点供待测基因的检测使用，该重组序列全长980bp。[0012]上述mini-gene剪接报告质粒的构建方法，通过PCR扩增获得三段人类DMD基因上的非连续序列，分别插入到pcDNA3.1中构建成minigene报告质粒NKU-YC-I，插入部分序列具有序列表〈4002所示序列。[0013]上述mini-gene剪接报告质粒的应用，用于鉴定和分析外显子和内含子中剪接调控元件。[0014]上述mini-gene剪接报告质粒的应用，用于检测微小突变（点突变和微缺失重复）是否会对外显子的剪接带来影响。[0015]本发明的有益效果是：[0016]上述mini-gene剪接报告质粒具有序列表〈4001所示序列，通过PCR扩增获得三段DMD基因上的非连续序列，分别插入到pCDNA3.1中构建得到，可用于鉴定和分析外显子和内含子中的剪接调控元件，检测微小突变（点突变和微缺失重复是否会对外显子的剪接带来影响。附图说明[0017]图1是mini-geneNKU-YC-1质粒的结构示意图。[0018]图2是插入片段的结构示意图。[0019]图3是重组质粒电泳鉴定图，其中，[0020]M:DNA分子量标准；[0021]1:插入片段PCR扩增产物，约980bp;[0022]2:重组载体双酶切产物。[0023]图4是mini-gene剪接报告系统的功能性验证，其中，[0024]M:DNA分子量标准；[0025]NKU:NKU-YC-Imini-gene在Hela细胞中的剪接图。[0026]图5是待检测外显子中剪接调控元件的鉴定分析，其中，[0027]a图WT为minigene报告质粒中正常待检测外显子的示意图；D1-6为待检测外显子不同区域缺失的示意图；[0028]b图为上述WT和区段缺失Mutant的外显子在Hela细胞中剪接结果的电泳图；[0029]c图为利用缺失区段探针进行RNApulldown后，通过Westernblot检测pulldown产物中剪接因子SF的结果图。NE为Hela细胞核提取物，D2为D2缺失区段的pulldown产物。[0030]图6是对突变影响外显子剪接的检测，其中，[0031]a图为患者1的突变模式简图；[0032]b图为患者1的cDNA分析结果图，C为正常对照，P为患者1;[0033]c图为构建含有上述突变外显子的minigene简图及其体外剪接结果图，W为正常minigene剪接图，M为点突变的minigene剪接图。具体实施方式[0034]为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。[0035]下述实施例中所涉及的基因扩增引物，由北京华大基因有限公司合成。[0036]实施例1[0037]minigene剪接报告质粒的构建过程[0038]通过PCR扩增获得三段DMD基因上的非连续序列，分别插入到pcDNA3.1中构建成minigene报告质粒NKU-YC-1。[0039]材料与试剂：[0040]载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司，LB培养板、培养液购自上海生工生物公司，感受态TransI-T1购自全式金生物公司，琼脂糖回收试剂盒与T4连接酶购自NEB生物公司，实验过程中所使用的限制性内切酶均购自TAKARA生物公司。[0041]1以正常人的基因组DNA为模板，设计引物YlF-NheI序列表〈4003所示序列）和YlR-KpnI序列表〈4004所示序列），进行PCR扩增。引物如下其中下划线处为酶切位点）：[0045]各组分混匀后，放入PCR仪。PCR反应参数:94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸3〇8,35个循环，72°：终止延伸1〇11^11。待反应结束后，电泳检测扩增产物片段。片段大小约204bp，同时切胶回收目的片段。将目的片段和pcDNA3.1同时用NheI和KpnI进行双酶切，酶切体系如下：[0048]37°C条件下反应2-4小时，电泳检测并切胶回收。取回收产物进行连接，16°C过夜反应。第二天取5ul连接产物，加入到50ul的感受态Transl-Tl中，冰浴30min，42°C热激45s，加入500ulLB液体培养基，37°C200r摇菌一小时，离心后重悬沉淀涂布在含有氨苄青霉素抗性的平板，37°C过夜培养。第二天挑菌测序检测是否将目的基因正确的插入到已知的载体上，鉴定成功的质粒即为pcDNA3.1-A。[0049]2以正常人的基因组DNA为模板，设计引物Y2F-KpnI序列表〈4005所示序列）和Y2R-Xh〇I序列表〈4006所示序列），进行PCR扩增。引物如下其中下划线处为酶切位点）：[0052]片段大小约455bp，反应过程同上。[0053]用KpnI和XhoI对回收产物以及质粒A进行双酶切并回收，取回收产物进行连接、转化、涂板并挑菌进行鉴定，鉴定成功的质粒即为pcDNA3.1-AX。[0054]3以正常人的基因组DNA为模板，设计引物Y3F-XhoI序列表〈4007所示序列）和Y3R-XbaI序列表〈4008所示序列），进行PCR扩增。引物如下其中下划线处为酶切位点）：[0057]片段大小约296bp，反应过程同上。[0058]用XhoI和XbaI对回收产物以及质粒pcDNA3.1-AX进行双酶切并回收，取回收产物进行连接、转化、涂板并挑菌进行鉴定，鉴定成功的质粒即为NKU-YC-I见图1、2，具有序列表〈4001所示序列。用片段两端的引物进行PCR检测插入片段并用NheI和XbaI双酶切质粒NKU-YC-I后电泳结果表明，存在大小为980bp左右的条带见图3。[0059]实施例2[0060]突变型mini-gene的构建方法[0063]以NKU-YC-I质粒为模板，设计引物M-F序列表〈4009所示序列）和M-R序列表〈40010所示序列进行PCR扩增，引物如下：[0067]各组分混匀后，放入PCR仪。PCR反应参数:94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸IOmin，35个循环，72°C终止延伸5min。待反应结束后，取5ulPCR产物进行电泳检测扩增产物片段，片段大小约5kb。取20ulPCR产物进行Dpra酶切消化，酶切体系如下：[0069]37°C条件下反应2小时。取5ul酶切产物产物加入到50ul的感受态Transl-Tl中，冰浴30min，42°C热激45s，加入500ulLB液体培养基，37°C200r摇菌一小时，离心后重悬沉淀涂布在含有氨苄青霉素抗性的平板，37°C过夜培养。第二天挑菌测序检测是否将外显子X的碱基A突变成T，鉴定成功的质粒即为突变型。[0070]实施例3[0071]mini-gene剪接报告系统的功能验证[0072]1将质粒NKU-YC-I通过脂质体介导的方法转染Hela细胞，转染试剂使用Invitrogen公司的脂质体Lipo2000,转染方法参照该转染试剂说明书，具体操作如下：[0073]前一天晚上将0.5ug质粒和8ul转染试剂加到200ul的无血清培养基中，室温孵育5min，使脂质体充分的包裹质粒，然后将其加入到2ml生长良好的Hela细胞中，置于培养箱培养过夜，第二天早上将无血清的培养基换成有血清培养基继续培养。[0074]2提取RNA:转染48小时后，吸出培养基，用PBS洗两次，加入500ul的Trizol反复吹洗，转移到1.5ml离心管中。加入IOOul三氯甲烷，用力震荡15s，室温静置2-3min后，4度12000转离心15min。将上层相小心转入新的离心管中，加入250ul异丙醇轻轻颠倒混勾，室温静置l〇min，4度12000转离心lOmin。倒掉上清，加入500ul提前预冷的75%无水乙醇，4度7500转离心五分钟。倒掉上清，待沉淀彻底晾干后加入EBbuffer溶解。[0075]3cDNA合成:使用TAKARA反转录试剂盒，将提取的RNA反转录成cDNA。[0076]4PCR:以cDNA为模板，用引物YlF-NheI和Y3R-XbaI进行PCR扩增。取5ul的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。检测目的基因的剪接模式。[0077]5结果分析:如图4所示，根据PCR产物的电泳及测序结果可以得出，NKU-YC-I所携带的三个外显子在Hela细胞中被正确识别，其剪接模式与dystrophin基因在人体内的剪接模式相同，从而证实了该剪接报告系统的有效性。[0078]实施例4[0079]鉴定和分析外显子中的剪接调控元件[0080]在minigeneNKU-YC-I的基础上，设计待检测外显子X中不同区段缺失D1-6的质粒见图5a。将Wildtype和不同区段缺失的质粒分别转染Hela细胞，通过RT-PCR来检测外显子X的剪接情况见图5b。结果分析D2和D6区段缺失的质粒影响了外显子X的识别导致外显子跳读，表明缺失的这两段序列含有与特定反式作用因子结合从而影响剪接的顺式作用元件。接下来我们对影响剪接最为显著的D2区段进行重点研究，设计D2区段序列的RNA探针，通过与细胞核提取物共同孵育进行RNApulldown实验，检测与之结合的剪接因子。Pulldown产物经质谱分析并通过westernblot验证后发现四个剪接因子与该缺失区段结合，参与调控外显子X的剪接见图5c。本实验证明minigeneNKU-YC-I可用于鉴定外显子和内含子中的剪接调控元件。[0081]实施例5[0082]检测点突变是否会影响外显子的剪接。[0083]一例DMD患者，其dystrophin基因含有一个AT的无义突变见图6a，经cDNA分析发现该突变导致相应外显子发生一定程度的跳读如图6b。我们将含有该突变的外显子及侧翼序列插入质粒NKU-YC-I，构建突变型的质粒见图6c。将野生型与突变型的mini-gene分别转染到Hela细胞中，培养48小时后提取RNA，进行反转录得到cDNA，通过PCR分析待检测外显子的剪接效率。PCR结果产生两条大小不一的条带，一条为正常剪接的条带inclusion，另一条是外显子被跳读的条带（skipped见图6c，该结果与患者自身的剪接模式一致，说明以minigeneNKU-YC-I为基础的剪接报告系统是体外研究微小突变对外显子剪接影响的良好模型。[0084]上述参照具体实施方式对该mini-gene剪接报告质粒及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种mini-gene剪接报告质粒，其特征在于：为质粒NKU-YC-I，具有序列表〈4001所示序列。2.根据权利要求1所述的mini-gene剪接报告质粒，其特征在于：重组序列两端及其中间设有相应的酶切位点供待测基因的检测使用，该重组序列全长980bp。3.权利要求1所述mini-gene剪接报告质粒的构建方法，其特征在于:通过PCR扩增获得三段DMD基因上的非连续序列，分别插入到pcDNA3.1中构建而成。4.权利要求1所述mini-gene剪接报告质粒的应用，其特征在于：用于鉴定和分析外显子和内含子中的剪接调控元件。5.权利要求1所述mini-gene剪接报告质粒的应用，其特征在于：用于检测微小突变是否会对外显子的剪接带来影响。

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