申请/专利权人：天津医科大学

申请日：2018-06-25

公开（公告）日：2018-11-23

公开（公告）号：CN108866179A

主分类号：C12Q1/6883(2018.01)I

分类号：C12Q1/6883(2018.01)I;A61K45/00(2006.01)I;A61P1/16(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.10.11#发明专利申请公布后的驳回;2018.12.18#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明公开了lncRNA‑SCARNA10在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物的用途。针对SCARNA10的特异性序列在制备诊断肝纤维化血清检测试剂盒以及能够靶向干扰SCARNA10的特异性序列在制备治疗肝纤维化的产品中的应用。本发明通过研究SCARNA10在人肝组织和血清中的表达以及其在肝纤维化过程中的作用及机制，发现SCARNA10在肝纤维化患者肝组织和血清中表达明显增高，且抑制肝星状细胞中SCARNA10能够减轻肝纤维化的病情进展。本发明对未来为肝纤维化的早期无创诊断及治疗策略的选择具有重要参考意义。

主权项：1.针对lncRNA‑SCARNA10的特异性序列在制备肝纤维化血清检测试剂盒的用途。

全文数据：IncRNA-SCARNAIO在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物的用途技术领域[0001]本发明涉及IncRNA-SCARNAlO在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物的用途。背景技术[0002]肝纤维化是一种常见的肝脏疾病，是慢性肝病一个共同的病理过程，是肝脏的一种可逆性损伤-愈合反应，主要由酒精滥用、病毒感染、胆管梗阻，以及HBV、HCV、非酒精性脂肪肝等病因引起，在中西方人群中发病都是非常普遍的。其特征表现为细胞外基质ECM的过度产生并在肝内过多沉积，影响肝细胞血流以及肝细胞功能，是肝功能受到损伤，失去基本的生物代谢功能，最终进展为肝硬化、慢性肝功能衰竭。对于晚期肝纤维化及肝癌患者，唯一有效的治疗方法就是肝移植。目前，肝组织活检是诊断的金标准，组织学病理的鉴定可以根据炎症、坏死的情况对肝纤维化的程度进行分级，但是由于其侵入性带来的疼痛，以及取材的随机性导致其临床应用有很大的局限性，因此寻找准确的非侵入性的诊断肝纤维化的方法已经迫在眉睫。[0003]众多关于基因组的研究表明98%的基因不能编码蛋白，而80%的基因都被认为是具有生物学功能的，其转录本被称为非编码RNA，根据长度的不同主要分为小于200bp的小非编码RNA包括miRNAs，小核RNAs等，以及大于200bp的长链非编码RNAIncRNAs等。长期以来IncRNAs被认为是转录过程中的副产物而不具有生物学功能。近年来随着miRNAs的研究进展，揭示了非编码RNAs在人类基因转录后调节、细胞生长、分化及增殖过程中起着相当重要的作用。同时也提示，与miRNAs相比，在细胞内转录比例更高的IncRNAs可能拥有更复杂而重要的生物学功能，而不再认为它是“暗物质”，对其的功能和作用机制也越来越关注，因此近年来很多研究都聚焦在此。[0004]血浆、血清中游离RNA，包括!1^1?熟、811〇1?祖、11«^祖和^代1?嫩，的发现是科学发展史上的一个重大突破。传统观念一直认为，游离RNA不可能稳定存在于血浆、血清中，因为RNA本身极不稳定且血液循环中存在的大量核酸酶也会影响其稳定性。直到20世纪80年代末，几篇报道清楚地阐明了血液循环中可扩增的循环RNA的存在。目前对于循环RNA在循环血中的来源及其能稳定存在机制还未完全阐明。既往研究推测循环RNA的来源包括被动过程和主动过程，被动过程即疾病细胞坏死后游离RNA进入循环血中；主动过程指循环RNA通过以凋亡小体或者微粒体形式从细胞中释放。另有研究指出血浆RNA的稳定存在，是由于其可以通过与DNA形成杂交体或脂蛋白复合物等物质结合，从而免受Rnase的降解。由于循环生物标志物收集方便和相对非侵入性，使它能够成为疾病的筛选工具。因此，识别与肝纤维化过程直接相关的循环ncRNA，并且可以用作肝纤维化的诊断标记物，有很深远的临床意义。发明内容[0005]为了解决现有技术中的问题，本发明提供IncRNA-SCARNAlO在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物的用途，解决现有技术中肝纤维化检测准确性不高、没有特效药物有效阻止或者逆转肝纤维化的问题。[0006]本发明的技术方案是：[0007]针对IncRNA-SCARNAlO的特异性序列在制备肝纤维化血清检测试剂盒的用途。[0008]靶向敲低IncRNA-SCARNAlO的特异性序列在制备治疗肝纤维化药物的用途。[0009]本发明提供了血清检测SCARNA10在制备诊断肝纤维化检测试剂盒以及能够抑制SCARNA10的物质在制备能够治疗肝纤维化的产品中的应用。本发明通过研究SCARNA10在人肝组织和血清中的表达以及其在肝纤维化过程中的作用及机制，发现SCARNA10在肝纤维化患者肝组织和血清中表达明显增高，且抑制肝星状细胞中SCARNA10能够减轻肝纤维化的病情进展。本发明对未来为肝纤维化的早期无创诊断及治疗策略的选择具有重要参考意义。附图说明[0010]图1:SCARNA10全长序列的确定；以人肝星状细胞系LX-2为研究对象，运用CDNA末端快速扩增技术RACE确定人SCARNA10的全长序列；[0011]图2:SCARNA10在肝纤维化硬化患者的肝组织中表达增多；（A对65例人肝组织包括正常人、肝纤维化病人和肝硬化病人切片进行HE、Mass〇n以及天狼猩红染色并进行组织学分级；⑻提取65例人肝组织的总RNA，qRT-PCR技术检测SCARNA10的表达；⑹在65例肝组织（正常和纤维化硬化肝组织）中检测SCARNA10及Collal的表达并进行相关分析，*ρ〈0·05;[0012]图3:SCARNA10在肝纤维化硬化患者的血清中表达增多；提取正常人、肝纤维化病人和肝硬化病人的血清总RNA，qRT-PCR技术检测SCARNA10的表达，*p〈0.05;[0013]图4:SCARNA10在小鼠纤维化肝组织和激活的HSCs中过表达；（A腹腔注射CC14后第0、2、4、6、8、10周后提取肝组织的总RNA，qRT-PCR检测α-SMActa2和SCARNA10的表达变化；⑻胆管结扎BDL后第0天、第3天、第14天及第21天提取肝组织的总RNA，qRT-PCR检测α-SMA和SCARNA10的表达改变；（C分别提取正常小鼠以及肝纤维化小鼠的原代HSCs的RNA，qRT-PCR技术检测SCARNA10的表达；〇分别提取原代HSCs在体外培养的第3、7、14天的RNA，qRT-PCR技术检测a-SMA、SCARNA10的表达；⑹原代HSCs在体外培养的第3天加TGFP刺激因子处理24小时后运用qRT-PCR技术检测a-SMA、collal和SCARNA10的水平，*p〈0.05;[0014]图5:敲低SCARNA10可以抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化；将小鼠分为四组：对照组、CCU组、干扰SCARNA10组、干扰SCARNAIO+CCU组；通过鼠尾静脉注射高滴度的干扰SCARNA10的慢病毒（lenti-shSCARNAlO或者对照慢病毒（Ienti-NC，并同时构建CC14诱导的小鼠肝纤维化模型；0V观察四组小鼠肝脏外观、HE染色、SiriusRed染色以及a-SMA、CollaUPCNA蛋白的IHC确定肝纤维化的状态；⑻Westernblot检测不同小鼠肝组织中€1-SMAXollal、MMP2和PCNA的表达，GAPDH为对照；（C测量不同小鼠肝组织中羟脯氨酸的含量；（D，E分别提取四组小鼠肝组织的RNA，qRT-PCR检测与肝纤维化、炎症相关基因的表达。*#p〈0·05。吨〈0·05vs对照组;#p〈0·05vs对照+CC14组。具体实施方式[0015]下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明。[0016]实施例1[0017]SCARNA10的序列全长[0018]以人肝星状细胞系LX-2为研究对象，运用cDNA末端快速扩增技术RACE购买自Clontech公司SMARTerKRACE5’3’试剂盒确定人SCARNA10的全长序列（SEQIDNO.1。如图1所示）[0019]方法：3’RACE:以基因特异引物GSPl为上游引物（3’外侧引物：GATTACGCCAAGCTTGGTCTGTAATCTTGGTGGGCGATACAGASEQIDNO.2；3'内侧引物：GATTACGCCAAGCTTTGTGTTCACTGTAAGGGCAGACCAACSEQIDNO·3，以通用引物UPM为下游引物含有部分接头序列），通过PCR扩增目的基因3’末端的DNA片段，上图为PCR跑胶图，随后胶回收送基因公司测序;5’RACE:以通用引物UPM为上游引物，基因特异引物GSP2为下游引物（5’外侧引物:GATTACGCCAAGCTTTAGGACCCTTGGCCCTGATACCCTGSEQIDNO·4;5’内侧引物：GATTACGCCAAGCTTTGCCCTGTTCCTACTCTCTCACTCCSEQIDN0·5，通过PCR扩增目的基因5’末端的cDNA片段上图为PCR示意图，随后胶回收送基因公司测序。[0020]实施例2[0021]为了更好的研究SCARNA10在肝纤维化中的作用，我们分别收集了65例人肝组织标本，首先，我们对这65例标本进行病理学分析，以国际通用标准，通过组织学常规染色技术HE、Mass〇n以及天狼猩红染色将这65例肝组织标本分为5级。[0022]HE染色步骤：[0023]1脱蜡:将石蜡切片首先放入二甲苯120分钟，然后放入二甲苯Π中室温静置20分钟（当室温过低时可以将二甲苯放入37°C恒温箱中）；[0024]2水化:从二甲苯Π中取出石蜡切片，分别放入梯度无水乙醇中再水化100%1、100%Π、95%、90%、80%、70%各5分钟，每道可以稍微沥干;然后蒸馏水洗3次，每次5min;[0025]3细胞核染色:使组织块周围水分吸干，将载玻片放入盛有苏木精的5片染色杯中，完全浸没载玻片，室温静置Smin;[0026]⑷返蓝:准备盛有自来水的十片染缸中，将苏木精冲洗后，将载玻片放置20min，细胞核将逐渐变为蓝色，镜下观察待蓝色明显后进行下一步；[0027]5细胞浆染色:使组织块周围水分吸干，将载玻片放入盛有伊红的染色杯中，完全浸没载玻片，室温静置3min，显微镜下观察细胞浆红色适宜即可；[0028]6透明：用镊子夹取载玻片依次于70%、80%、90%、95%的乙醇中快速润洗，然后在100%的无水乙醇Ι、Π中分别静置lmin、3min;将载玻片从100%无水乙醇Π中取出，稍微沥干后于二甲苯I静置5min和Π中静置8min;[0029]⑺封片：取出载玻片，擦干二甲苯，水平放置，在载玻片一侧滴加适量中性树脂，用镊子取盖玻片从树脂一侧缓慢放下直至组织块全部被封闭;所有操作步骤中保持组织块湿润。[0030]天狼猩红染色步骤：[0031]1常规脱蜡、水化石蜡切片；[0032]⑵从PBS中取出片子，用纸巾擦干组织周围残留的PBS;[0033]3天狼猩红染色液滴染45分钟；[0034]⑷流水稍微冲洗，去除切片表面染液；[0035]5将载玻片在70%、80%、90%、95%的梯度乙醇中速洗，在100%的无水乙醇I中静置2分钟，在100%的无水乙醇Π中静置3分钟；[0036]6透明：二甲苯13〜5分钟，二甲苯Π5〜10分钟[0037]⑺在组织块处滴加中性树胶，用盖玻片封片。自然干燥后即可在显微镜下观察。[0038]随后，我们针对SCARNAI0设计了2对特异性引物（上游引物1:CTTGGTGGGCGATACAGAGTSEQIDN0.6;下游引物I:CTTTAGGACCCTTGGCCCTGSEQIDNO·7;上游弓丨物2:AATCTTGGTGGGCGATACAGSEQIDNO·8;下游弓丨物2:CAGCAACTGGAAGAATCACCSEQIDN0.9，并运用qPCR技术检测SCARNA10的表达，发现与正常肝组织相比，SCARNA10在纤维化、硬化肝组织中的表达显著升高。同时检测Colla1的表达，并与SCARNA10的表达做相关分析。以上结果表明SCARNA10与肝纤维化程度密切相关。[0039]结果如图2所示，SCARNA10在肝纤维化硬化患者的肝组织中表达增多㈧对65例人肝组织包括正常人、肝纤维化病人和肝硬化病人切片进行HE、Masson以及天狼猩红染色并进行组织学分级；⑻提取65例人肝组织的总RNA，qRT-PCR技术检测SCARNA10的表达，结果证实SCARNA10在肝纤维化及肝硬化患者的肝组织中表达量明显增多；（C在65例肝组织（正常和纤维化硬化肝组织）中检测SCARNA10及Collal的表达并进行相关分析，发现SCARNA10与肝纤维化标志物Colla1显著相关。*p〈〇·05。[0040]实施例3[0041]为了更好的研究SCARNA10在肝纤维化中的作用以及探讨其作为肝纤维化早期诊断血清标志物的潜能，我们分别收集了35例正常人血清、38例肝纤维化病人血清和45例肝硬化病人的血清，从中提取RNA，并运用上述的3对特异性引物检测SCARNA10的表达，发现与正常人血清相比，SCARNA10在纤维化病人血清中的表达显著升高，并且在肝硬化病人血清中的表达高于肝纤维化病人的血清。以上结果表明SCARNA10与肝纤维化程度密切相关，随着肝纤维化的发生发展逐渐升高，揭示SCARNA10在临床上有作为检测纤维化的血清标志物的潜能，从而通过非侵入性的手段早期发现并诊断肝纤维化，及时采取干预措施缓解肝纤维化的进展，达到逆转肝纤维化的目的。[0042]如图3所示，SCARNA10在肝纤维化硬化患者的血清中表达增多。提取正常人、肝纤维化病人和肝硬化病人的血清总RNA，qRT-PCR技术检测SCARNA10的表达。*p〈0.05。[0043]实施例4[0044]由于HSCs的激活是肝纤维化的核心环节，通过激活HSCs可以促进肝纤维化的发生发展。因此我们探讨SCARNA10是否在HSCs激活中有功能。首先我们分别从健康小鼠和疾病小鼠肝脏中提取肝星状细胞，在培养的第1天提取RNA检测a-SMA、SCARNA10的表达水平。提取前在显微镜下观察到正常小鼠的原代HSCs可见大量脂滴，表明其为静息状态，而纤维化的小鼠的原代HSCs中脂滴消失，表明其在肝纤维化的过程中已经激活。qRT-PCR结果显示与正常小鼠的原代HSCs相比，a-SMA在纤维化小鼠的原代HSCs中表达显著升高，SCARNA10在纤维化小鼠的HSCs中表达也明显升高，说明体内激活状态的HSCs中SCARNA10高表达。有研究表明静息的HSCs在体外培养的过程中会逐渐激活，为了验证上述实验结果，我们提取正常小鼠的原代HSCs进行体外培养，分别在第3天、第7天、第14天提取RNA。通过这三个时间点体现原代HSCs的静息状态、部分激活状态以及完全激活状态，qRT-PCR检测α-SM、SCARNA10的表达水平，结果发现α-SM的表达水平在第14天显著高于第7天，而第7天显著高于第3天，说明α-SMA的表达随着HSCs的激活而升高（图4⑹），与文献报道的原代HSCs在体外培养的第3天为静息状态，第7天为部分激活状态，第14天为完全激活状态相一致。我们的结果表明SCARNA10的表达与α-SMA的表达趋势一致，在第14天显著高于第7天，而第7天显著高于第3天，说明SCARNA10水平也随着原代HSCs体外培养逐渐激活的过程而升高。此外，由于TGFP是HSCs激活的一个重要的细胞因子，我们进一步检测TGFP能否调节SCARNA10的表达。我们分离的正常小鼠原代HSCs在体外培养第3天时加入10ngmlTGFβ处理24小时，提取RNA检测a-SMA、collaI、SCARNA10的表达水平。结果表明TGF0处理HSCs后刺激其激活，a-SMA、collal等与HSCs激活相关基因表达均升高，同时SCARNA10的表达水平明显增多，说明SCARNA10可能受到TGFP的调节并参与促进HSCs的激活。[0045]如图4所示，㈧腹腔注射CCU后第0、2、4、6、8、10周后提取肝组织的总RNA，qRT-PCR检测a-SMAActa2和SCARNA10的表达变化;结果证实a-SMA和SCARNA10在纤维化的肝组织中表达量逐渐增多；⑻胆管结扎BDL后第0天、第3天、第14天及第21天提取肝组织的总RNA，qRT_PCR检测a-SMA和SCARNA10的表达改变;结果证实a-SMA和SCARNA10在纤维化的肝组织中表达量逐渐增多。（C分别提取正常小鼠以及肝纤维化小鼠的原代HSCs的RNA，qRT-PCR技术检测SCARNA10的表达;结果证实SCARNA10在激活的HSCs中表达量显著增多。⑼分别提取原代HSCs在体外培养的第3、7、14天的RNA，qRT-PCR技术检测a-SMA、SCARNA10的表达;结果证实a-SMA和SCARNA10的表达量随着HSCs的培养激活逐渐增多。⑹原代HSCs在体外培养的第3天加TGFI3刺激因子处理24小时后运用qRT-PCR技术检测a-SMA、colIal和SCARNA10的水平;结果证实SCARNA10在TGF0刺激的HSCs中表达量显著增多。*p〈0.05。[0046]实施例5[0047]为了探究SCARNA10在体内与肝纤维化发生发展的关系。首先我们将实验动物分为四组，分别为阴性对照组、CC14组、干扰SCARNA10组、干扰SCARNA10+CC14组。阴性对照组腹腔注射橄榄油，鼠尾静脉注射阴性对照慢病毒（Ienti-NC;CCl4组小鼠腹腔注射5%CCl4，鼠尾静脉注射对照慢病毒（Ienti-NC;干扰SCARNA10组小鼠腹腔注射橄榄油，产高滴度的干扰Inc-SCARNAlO的慢病毒（lenti-shSCARNAlO:siRNA序列1:GGGACCUUUGGCCU⑶UAASEQIDN0.10;siRNA序列2:CACAGAUCUUUGGUAAUCUSEQIDN0.11;siRNA序列3:CCAAGG⑶CCUAAAGGACUSEQIDNO.12后小鼠尾静脉注射;干扰SCARNA10+CC14组腹腔注射5%CCU，鼠尾静脉注射高滴度的干扰Inc-SCARNAlO的慢病毒。CCU组以及干扰Inc-SCARNA10+CC14组在四氯化碳腹腔注射14天后再进行鼠尾静脉注射相的慢病毒一次，然后继续注射CCl46周，每周两次，到时间终点后麻醉处死取肝组织冻存以及石蜡包埋。[0048]通过对肝组织大体外观进行观察，发现与对照组相比CCl4组小鼠肝脏表面粗糙且颜色晦暗、结节增多，而干扰SCARNA10+CC14组与CCl4组相比肝脏表面较光滑且颜色尚可，结节减少。然后将肝组织切片进行HE染色，可见CCl4组小鼠肝脏结构被破坏，肝细胞坏死，肝索排列紊乱。干扰SCARNA10+CC14组与CCl4组相比肝脏结构明显恢复，肝细胞坏死减少，肝索围绕中央静脉呈放射状排列。将肝组织切片进行天狼猩红染色以及a_SMA、C〇llal和PCNA的免疫组化染色，对结果进行观察发现，CCl4组小鼠肝脏细胞外基质、胶原纤维明显增多、HSCs增殖标志物明显，而肝纤维化程度明显，而干扰SCARNA10+CC14组的纤维化程度明显缓解，与CCl4组相比小鼠肝脏细胞外基质、胶原纤维明显减少、HSCs增殖标志物减低。此外，我们通过测量肝脏中羟脯氨酸的量来判断胶原的量以及间接反映肝纤维化的状态，结果显示CC14组小鼠羟脯氨酸含量显著升高，而干扰SCARNA10+CC14组与CC14组相比，羟脯氨酸含量明显降低。以上形态学结果可以表明干扰SCARNA10+CC14组的纤维化程度明显减轻。[0049]羟脯氨酸含量测定实验步骤：[0050]1秤取湿重:从-80°C取出组织，用高压灭菌过的剪刀镊子将组织块剪碎，然后准确称取组织湿重，并转移至试管中；[0051]2碱水解:用Iml的移液枪准确加入Iml碱水解液，混匀、保鲜膜封口后放入95°C的水浴中，水解20分钟，期间混匀依次；[0052]3调节pH至6.0〜6.8:滴加一滴指示剂，此时溶液变为红色;滴加pH甲液Iml，此时溶液仍为红色;缓慢滴加pH乙液，每滴加一滴均需混匀，直至溶液变为黄绿色，即红色刚消失时；向溶液中加双蒸水8ml、混匀；[0053]⑷活性炭吸附:取4ml上述水解液，并加入30mg左右的活性炭；[0054]53500rpm，室温离心10分钟；[0055]⑹检测样品的配制[0056]空白管：Iml双蒸水+0·5ml试剂一+0·5ml试剂二+0·5ml试剂三[0057]标准管：Iml的标准品+0.5ml试剂一+0.5ml试剂二+0.5ml试剂三[0058]测定管：Iml上清液+0·5ml试剂一+0·5ml试剂二+0·5ml试剂三[0059]混匀后用于羟脯氨酸检测；[0060]⑺检测:在波长550nm处测每管的吸光度，并作好记录；[0061]⑻计算。[0062]此外，我们也进行了分子生物学相关基因的检测。提取了四组小鼠肝组织的RNA，通过qRT-PCR技术检测与肝纤维化、炎症相关的基因，结果显示CCl4组小鼠肝组织中a-SMA，Collal，Mmp2,Timpl，Ctgf，Tnfa，IL-HMcp-I的表达明显升高，而敲低SCARNA10的表达后再注射CCl4,与CCl4组相比，这些基因的表达明显降低。然后分离不同小鼠肝组织的蛋白，通过蛋白质电泳技术检测，结果显示干扰SCARNA10后抑制CCl4造成的与纤维化相关基因〇_SMA、Collal、MMP2、PCNA的高表达。[0063]如图5所示，敲低SCARNA10可以抑制CC14诱导的小鼠肝纤维化[0064]将小鼠分为四组:对照组、CC14组、干扰SCARNA10组、干扰SCARNA10+CC14组。通过鼠尾静脉注射高滴度的干扰SCARNA10的慢病毒（lenti-shSCARNAlO或者对照慢病毒Ienti-NC，并同时构建CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型。㈧观察四组小鼠肝脏外观、HE染色、SiriusRed染色以及€^1^、：〇11€[1、？0祖蛋白的1!1：确定肝纤维化的状态;结果证实对照+CC14组的纤维化严重程度大于干扰SCARNA10+CC14组。⑻Westernblot检验不同小鼠肝组织中0-5]\^、：〇11〇1、]\^32和？0嫩的表达，64?0!1为对照；结果证实〇-5]\^、：〇11〇1、]\^32和PCNA的蛋白量为对照+CCl4组〉干扰SCARNA10+CC14组。⑹测量不同小鼠肝组织中羟脯氨酸的含量;结果证实对照+CCl4组的小鼠肝组织中羟脯氨酸的含量〉干扰SCARNA10+CC14组的含量。（D，E分别提取四组小鼠肝组织的RNA，qRT-PCR检测与肝纤维化、炎症相关基因的表达;结果证实促纤维化和促炎症相关基因的表达量均为对照+CCl4组〉干扰SCARNA10+CC14组。*#p〈0·05。吨〈0·05vs对照组。#口〈0·05vs对照+CC14组。

权利要求：1.针对IncRNA-SCARNAlO的特异性序列在制备肝纤维化血清检测试剂盒的用途。2.靶向敲低IncRNA-SCARNAlO的特异性序列在制备治疗肝纤维化药物的用途。

百度查询： 天津医科大学 lncRNA-SCARNA10在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物的用途

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