申请/专利权人：江西农业大学

申请日：2014-10-23

公开（公告）日：2017-07-11

公开（公告）号：CN104353071B

主分类号：A61K39/29(2006.01)I

分类号：A61K39/29(2006.01)I;A61K39/39(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2020.10.13#未缴年费专利权终止;2017.07.11#授权;2015.03.25#实质审查的生效;2015.02.18#公开

摘要：本发明公开了一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt，该载体表达的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His‑CTBt‑Bt由组氨酸标签、口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB和难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞抗原表位Bp组成。为便于该疫苗在烟草高效表达，人工合成密码子优化的6His‑CTBt‑Bt基因，克隆至高效植物病毒表达载体马铃薯X病毒载体PVX201，获得丙型肝炎病毒多表位疫苗6His‑CTBt‑Bt的重组表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt，该表达载体接种烟草，以烟草为反应器生产针对难治性丙型肝炎病毒的，易于纯化，有较好口服免疫效果和体外抗病毒感染的抗丙型肝炎病毒疫苗。

主权项：丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt及丙型肝炎病毒多表位6His‑CTBt‑Bt在制备丙型肝炎病毒疫苗中的应用；所述丙型肝炎病毒多表位疫苗6His‑CTBt‑Bt的氨基酸序列为：His His His His His His Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe PheThr Val Leu Leu Ser Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr HisAsn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala GlyLys Arg Glu MetAla Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met LysAsp Thr Leu ArgIle Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys LeuCys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser MetAla Asn Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp MetMet Met Asn TrpSer Gly Ser Ala Ser Gly Ile Thr Ser Leu Phe Ser Arg Gly Pro SerGln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn ArgGly Ser Gly PheLeu Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Arg Phe Gly SerGly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu LeuLeu Asn Gly Ser Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys ThrVal Asn Phe Thr Ile Phe Gly Ser Met Tyr Val Gly Gly Val Glu HisArg Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg。

全文数据：用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt技术领域[0001]本发明涉及抗病毒疫苗研发领域，尤其是涉及一种用于生产丙型肝炎丙肝病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。背景技术[0002]丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子，该病毒感染的世界总人数超过1.7亿，我国感染人数超过4000万。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染，进而引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。据报道，全球40%的慢性肝病和80%的肝细胞癌与丙型肝炎病毒有关，每年全球用于丙肝治疗费用超过1000亿美元。现有的治疗药物只对部分丙型肝炎肝病毒感染者有效，且治疗时间长，成本高和有副作用。疫苗是防治，特别是预防病毒性疾病的一种极其经济、简单和有效的手段。但是，至今还没有疫苗来预防和治疗丙型肝炎病毒感染。因此，研发具有自主知识产权的丙型肝炎病毒特别是难治性丙型肝炎病毒基因工程多表位疫苗具有极其重要的科学价值、无可估量的商业价值和社会效益。[0003]植物作为制备基因工程疫苗生物反应器具有生产成本低、安全性好、可口服、容易运输和保存等优点，因而成为近年来国际上疫苗研究和生产的一个热点和发展趋势。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt〇[0005]本发明的目的是这样实现的：[0006]1疫苗氨基酸组成设计：[0007]丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸组成设计:从N端至C端依次为6个组氨酸便于疫苗纯化），口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB增强疫苗口服免疫效果），难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞中和抗原表位BtE1313—327aa-E2396—424aa-E2438-447aa_E2523—54〇aa_E2610-627aa-E2631-648aa。各个抗原表位之间通过一个甘氨酸和一个丝氨酸残基隔开）。[0008]2疫苗密码子优化：[0009]为了促讲疫苗基闵在烟草的高表汰，利用偏爱密码子在线分析软件http:www_bioinformatics.orgcodoncgi-bincodon.cgi分析，合成6His-CTBt-Bt疫苗戶斤需的优化密码子序列。[0010]3疫苗基因合成[0011]为了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表达，对上述优化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密码子序列，在其5’端引入Clal酶切位点和烟草偏爱Kozak序列，3’端引入终止密码子和Sail酶切位点。使用在线分析软件http:helixweb.nih.govdnaworks设计22条引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。[0012]4疫苗表达载体构建及鉴定测序：[0013]PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和马铃薯X病毒载体PVX201，使用Clal和Sail双酶切，连接，获得疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，对表达载体进行酶切和测序鉴定。[0014]5疫苗在烟草的表达和Westernblot鉴定：[0015]金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，同时以马铃薯X病毒PVX2〇l阴性对照）和PVX204携带GFP基因接种烟叶作为对照，每个叶片接种病毒载体量为2-4wg。通过观察GFP蛋白表达验证、优化病毒接种和复制效果，制备烟草的蛋白提取物，分别使用鼠源的6XHisTag抗体（LanPower™和CTB抗体antibodies-onlineInc，Westernblot检测疫苗表达。Ni柱纯化表达的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt。[0016]6动物实验测定疫苗的免疫特性和安全性：[0017]Ni柱纯化的疫苗蛋白口服免疫四周龄的BALBc鼠三次免疫时间为1，14和28天），每次每只鼠免疫10yg的疫苗蛋白。不含疫苗的烟叶蛋白提取物（10Ug免疫的鼠作为对照。实验组及对照组分别免疫三只鼠。不同时间取血，2倍系列稀释，ELISA测定不同时期（1，14，28，56和70天抗体的滴度。阳性血清的㈤值490nm大于阴性对照（疫苗免疫前的鼠血清和未进行疫苗免疫的鼠血清0D值至少2倍的条件下，阳性血清的最大稀释度为此抗体的滴度。同时，疫苗免疫鼠前后，监测鼠体温和饮食，初步分析疫苗的安全性。[0018]7丙肝病人血清反应实验测定疫苗的人体内抗原性：[0019]ELISA测定3〇个随机选取的临床难治性丙型肝炎病毒基因型1病人血清（来自浙江省）与疫苗蛋白的反应性。20个随机选取的临床丙型肝炎病毒阴性血清来自浙江省）作为阴性对照。阳性血清的㈤值大于阴性对照㈤值20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值）2倍的条件下，判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性。[0020]8病毒进入抑制实验测定疫苗的病毒感染抑制效果：[0021]丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子携带荧光素酶基因）用1mgml的疫苗蛋白或0.5mgml的CD81抗体丙型肝炎病毒进入抑制的阳性对照37度孵育2小时，然后，未孵育和孵育的假病毒粒子分别感染Huh7细胞。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性病毒滴度的指示剂实验测定每种细胞内的病毒滴度，确定疫苗对病毒感染的抑制效果。[0022]本发明依托己有的丙型肝炎病毒及其防治研究基础，基于烟草偏爱密码子和我国流行的难治性丙型肝炎病毒基因型1序列分析，利用马铃薯X病毒载体PVX201，通过分子生物学技术构建了用于生产难治性丙型肝炎病毒多表位疫苗的重组马铃薯X病毒表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，该表达载体接种烟草，可生产具备免疫原性和体外抗型肝炎病毒感染的丙肝疫苗。[0023]丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt可用来生产预防性或治疗性的丙型肝炎病毒疫苗或生产丙型肝炎病毒诊断试剂盒。[0024]附图说明：[0025]图1:PVX-6His-CTBt-Bt载体的构建示意图，A:PVX-6His-CTBt-Bt载体示意图；B:ApalSall酶切鉴定重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt;[0026]图2:疫苗在烟草的表达和鉴定示意图，A:PVX204和PVX201接种烟叶，12天后，制备烟叶蛋白提取物，Westernblot检测（;B:PVX-6His-CTBt-Bt和PVX201接种烟叶，I2天后，制备蛋白提取物，分别使用6XHisTag抗体上图）和CTB抗体下图），Westernblot检测；[0027]图3:疫苗的纯化和免疫原性示意图，A:Ni柱纯化的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt;B:丙肝疫苗6His-CTBt-Bt免疫鼠血清的抗体滴度，M1，M2和M3表示疫苗免疫的三只鼠；[0028]图4:疫苗与丙型肝炎病毒感染病人血清反应的示意图，ELISA测定丙肝疫苗与临床难治性丙型肝炎病毒基因型1感染病人血清反应性，临床丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。丙型肝炎病毒阳性血清的0D值大于阴性对照0D值20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值2倍的条件下，判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性；[0029]图5:疫苗体外抑制难治性丙型肝炎病毒基因型1的感染示意图，丙型肝炎病毒基因型1假病毒粒子用疫苗蛋白Mlis-CTBt-Bt，37度孵育2小时后感染Huh7细胞。3天后，收获细胞，测定荧光素酶活性病毒粒子滴度的指示剂。[0030]具体实施方式：[0031]下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。[0032]实施例[0033]PVX-6HiS-CTBt-Bt载体的构建与鉴定，其方法如下：[0034]1疫苗氨基酸组成设计：[0035]丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸组成设计:从N端至C端依次为6个组氨酸便于疫苗纯化），口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB增强疫苗口服免疫效果），难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞中和抗原表位BtEl313-327aa-E2396-424aa_E2438-447aa-E2523-540aa-E261Q-627aa-E2631-648aa。各个抗原表位之间通过一个甘氨酸和一个丝氨酸残基隔开。[0036]按上述要求设计的丙型肝炎肝病毒疫苗6His-CTBt-Bt氨基酸序列为：[0037]HisHisHisHisHisHisMetlieLysLeuLysPheGlyValPhePhe[0038]151015[0039]ThrValLeuLeuSerSerAlaTyrAlaHisGlyThrProGinAsnlie[0040]202530[0041]ThrAspLeuCysAlaGluTyrHisAsnThrGinHeHisThrLeuAsn[0042]354045[0043]AspLysliePheSerTyrThrGluSerLeuAlaGlyLysArgGluMet[0044]505560[0045]AlalielieThrPheLysAsnGlyAlaThrPheGinValGluValPro[0046]65707580[0047]GlySerGinHislieAspSerGinLysLysAlalieGluArgMetLys[0048]859095[0049]AspThrLeuArglieAlaTyrLeuThrGluAlaLysValGluLysLeu[0050]100105110[0051]CysValTrpAsnAsnLysThrProHisAlalieAlaAlalieSerMet[0052]115120125[0053]AlaAsnlieThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMetAsnTrp[0054]130135140[0055]SerGlySerAlaSerGlylieThrSerLeuPheSerArgGlyProSer[0056]145150155160[0057]GinLyslieGinLeuValAsnThrAsnGlySerTrpHislieAsnArg[0058]165170175[0059]GlySerGlyPheLeuAlaAlaLeuPheTyrAlaHisArgPheGlySer[0060]180185190[0061]GlyValProThrTyrAsnTrpGlyGluAsnGluThrAspValLeuLeu[0062]195200205[0063]LeuAsnGlySerAspTyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThr[0064]210215220[0065]ValAsnPheThrliePheGlySerMetTyrValGlyGlyValGluHis[0066]225230235240[0067]ArgLeuAspAlaAlaCysAsnTrpThrArg[0068]245250[0069]2疫苗密码子优化：[0070]为了促进疫苗基因在烟草的高表达，利用偏爱密码子在线分析软件http:www.bioinformatics.orgcodoncgi-bincodon.cgi分析，合成6His_CTBt-Bt疫苗戶斤需的优化密码子序列为：[0071]catatcg已tgcc已tgggacatc已tc已teatcatcat已tgattaagcttaagtttggagtt60[0072]ttttttactgttcttctttcttctgcttatgctcatggaactccacaaaatattactgat120[0073]ctttgtgctgaatatcataatactcaaattcatactcttaatgataagattttttcttat180[0074]actgaatctcttgctggaaagagagaaatggetattattacttttaagaatggagctact240[0075]tttcaagttgaagttccaggatctcaacatattgattctcaaaagaaggctattgaaaga300[0076]atgaaggatactcttagaattgettatettactgaagctaaggttgaaaagctttgtgtt360[0077]tggaataataagactccacatgetattgetgetatttetatggetaatattactggacat420[0078]agaatggettgggatatgatgatgaattggtctggatctgcttctggaattaettetett480[0079]ttttctagaggaccatctcaaaagattcaacttgttaatactaatggatcttggcatatt540[0080]aatagaggatctggatttcttgctgctcttttttatgctcatagatttggatctggagtt600[0081]ccaacttataattggggagaaaatgaaactgatgttcttcttcttaatggatetgattat660[0082]ccatatagactttggcattatccatgtactgttaattttactatttttggatetatgtat720[0083]gttggaggagttgaacatagaettgatgetgettgtaattggactaga768[0084]3疫苗基因合成[0085]为了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表达，对上述优化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密码子序列，在其5’端引入Clal酶切位点和烟草偏爱Kozak序列，3’端引入终lh密码子和Sail酶切位点。使用在线分析软件http:helixweb.nih.govdnaworks设计如下22条引物：[0086]1[0087]catategatgccatgggacatcatcatcatcatcatatgattaagcttaagttt54[0088]2[0089]cagaagaaagaagaacagtaaaaaaaactccaaacttaagcttaatcatatgatgatgat60[0090]3[0091]gttttttttactgttcttctttcttctgcttatgctcatggaactccacaaaatattact60[0092]4[0093]tgaatttgagtattatgatattcagcacaaag已tcagt已已tattttgtggagttccatg已60[0094]5[0095]gtgctgaatatcataatactcaaattcatactcttaatgataagattttttcttatactg60[0096]a61[0097]6[0098]gccatttctctctttccagcaagagattcagtataagaaaaaatcttatcattaagagta60[0099]7[0100]gctggaaagagagaaatggctattattacttttaagaatggagctacttttcaagttgaa60[0101]8[0102]cttcttttgagaatcaatatgttgagatcctggaacttcaacttgaaaagtagctccatt60[0103]9[0104]tctcaacatattgattctcaaaagaaggctattgaaagaatgaaggatactcttagaatt60[0105]10[0106]agcttttcaaccttagcttcagtaagataagcaattctaagagtatccttcattctttca60[0107]11[0108]ctgaagctaaggttgaaaagctttgtgtttggaataataagactccacatgctattgctg60[0109]12[0110]aagccattctatgtccagtaatattagccatagaaatagcagcaatagcatgtggagtct60[0111]13[0112]aatattactggacatagaatggcttgggatatgatgatgaattggtctggatctgcttct60[0113]14[0114]cttttgagatggtcctctagaaaaaagagaagtaattccagaagcagatccagaccaatt60[0115]15[0116]tttttctagaggaccatctcaaaagattcaacttgttaatactaatggatcttggcatat60[0117]16[0118]aaaagagcagcaagaaatccagatcctctattaatatgccaagatccattagtattaaca60[0119]17[0120]ctggatttcttgctgctcttttttatgctcatagatttggatctggagttccaacttata60[0121]18[0122]taagaagaagaacatcagtttcattttctccccaattataagttggaactccagatccaa60[0123]19[0124]aaaatgaaactgatgttcttcttcttaatggatctgattatccatatagactttggcatt22[0125]20[0126]gatccaaaaatagtaaaattaacagtacatggataatgccaaagtctatatggataatca60[0127]21[0128]tgtactgttaattttactatttttggatctatgtatgttggaggagttgaacatagactt60[0129]22[0130]gaggtcgacttatctagtccaattacaagcagcatcaagtctatgttcaactcctccaa59[0131]使用上述22条引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。[0132]4疫苗表达载体构建及鉴定测序：[0133]PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和马铃薯X病毒载体PVX201英国DavidBaulcombe教授惠赠），使用Clal和Sail双酶切，连接，获得疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，对表达载体进行酶切和测序鉴定。[0134]按前面所述实验方法构建丙型肝炎病毒基因工程多表位疫苗的重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt载体（图1A，ApaISaII酶切鉴定表明构建载体正确（图1B，测序进一步证实：疫苗6His-CTBt-Bt的序列与设计序列吻合，表明重组表达载体PVX-6His-CTBt_Bt己成功构建。[0135]疫苗6His-CTBt-Bt的测序序列如下：[0136]gccatggg已catcatcBtcBtcatc已tatg已tt已已gctta已gtttggagttttttttact60[0137]gttcttctttcttctgcttatgctc已tgga已ctcc已caaaat已ttactgatctttgtgct120[0138]g已已tatcataat已etc已已attcatactctt已已tgataagattttttcttat已ctgaatct180[0139]cttgctggaaagagagaaatggetattattacttttaagaatggagctacttttcaagtt240[0140]gaagttccaggatctcaacatattgattetcaaaagaaggctattgaaagaatgaaggat300[0141]已ctcttag已已ttgett已tettactgaagct已已ggttgaaaagctttgtgtttggaat已已t360[0142]已已gactccacatget已ttgctgctatttctatggctaat已ttactggacatag已已tgget420[0143]tggg已tatgatgatg已attggtctggatctgcttctgga已ttaettetettttttctaga480[0144]ggaccatctcaaaagattcaacttgttaatactaatggatettggeatattaatagagga540[0145]tctggatttcttgctgctcttttttatgctcatagatttggatctggagttccaacttat600[0146]aattggggagaaaatgaaactgatgttcttettettaatggatetgattatccatataga660[0147]ctttggcattatccatgtactgttaattttactatttttggatctatgtatgttggagga720[0148]gttgaacatagaettgatgetgcttgtaattggactagataa762[0149]实施例2[0150]疫苗在烟草的表达和Westernblot鉴定，其方法如下：[0151]金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，同时以马铃薯X病毒PVX201阴性对照）和PVX204携带GFP基因接种烟叶作为对照，每个叶片接种病毒载体量为2_4ug。通过观察GFP蛋白表达验证、优化病毒接种和复制效果，制备烟草的蛋白提取物，分别使用鼠源的6XHisTag抗体LanPower™和CTB抗体antibodies-onlineInc，Westernblot检测疫苗表达。Ni柱纯化表达的疫苗蛋白fflis-CTBt-Bt。[0152]按前面所述实验方法，重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt接种烟草。同时，作为病毒载体接种的阳性对照PVX204表达GFP基因）接种烟叶，12天后，Westernblot检测证实接种PVX204烟叶表达了GFP蛋白，但是，接种PVX201的烟叶，没有GFP蛋白表达（图2A。因此，12天后，制备重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt接种烟草的蛋白提取物，分别使用6XHisTag抗体（图2A上和CTB抗体（图2A下），Westernblot检测发现转染疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt的烟草成功表达了疫苗图2B，作为阴性对照，接种空载体PVX201的烟草中没有疫苗蛋白带的出现（图2B。这些结果表明：重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt接种的烟草成功表达了丙肝疫苗6His-CTBt_Bt。[0153]实施例3[0154]动物实验测定疫苗的免疫特性和安全性，其方法如下：[0155]Ni柱纯化的疫苗蛋白口服免疫四周龄的BALBc鼠三次免疫时间为1，14和28天），每次每只鼠免疫10yg的疫苗蛋白。不含疫苗的烟叶蛋白提取物（10Ug免疫的鼠作为对照。实验组及对照组分别免疫三只鼠。不同时间取血，2倍系列稀释，ELISA测定不同时期（1，14，28，56和70天抗体的滴度。阳性血清的㈤值490nm大于阴性对照（疫苗免疫前的鼠血清和未进行疫苗免疫的鼠血清0D值至少2倍的条件下，阳性血清的最大稀释度为此抗体的滴度。同时，疫苗免疫鼠前后，监测鼠体温和饮食，初步分析疫苗的安全性。[0156]按前面所述实验方法，Ni柱纯化疫苗蛋白6His-CTBt-Bt图3A，Lane1，疫苗蛋白量约为烟草提取物总蛋白量的0.18%，纯化的疫苗蛋白口服免疫BALBc鼠三次免疫时间为1，14和28天），ELISA测定不同时期（1，14，28,56和70天抗体的滴度。与对照组不含疫苗的烟草提取物免疫鼠）相比，14天时疫苗免疫鼠检测到抗体出现，56天时达到峰值三只疫苗免疫鼠血清的抗体滴度分别为:1:9〇〇〇〇;1:60000;1:80000，然后抗体滴度下降（图3B。这些结果表明：烟草表达的丙肝疫苗免疫鼠，诱导了体液免疫反应。同时，疫苗免疫前后，鼠体温和进食量没有明显变化，表明疫苗免疫鼠并没有对鼠产生明显的体内毒性。[0157]实施例4[0158]丙肝病人血清反应实验测定疫苗的人体内抗原性，其方法如下：[0159]ELISA测定30个随机选取的临床难治性丙型肝炎病毒基因型1病人血清来自浙江省）与疫苗蛋白的反应性。20个随机选取的临床丙型肝炎病毒阴性血清来自浙江省作为阴性对照。阳性血清的0D值大于阴性对照0D值20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值2倍的条件下，判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性。[0160]实施例3发现烟草表达的疫苗6His-CTBt-Bt诱导鼠产生高滴度的抗体，说明烟草表达的丙肝疫苗6His_CTBt-Bt在鼠体内具有很好的免疫原性。为了进一步确定是否烟草表达的疫苗在人体内也具有免疫原性，ELISA实验测定丙肝疫苗与临床难治性丙型肝炎病毒基因型1病人血清的反应性。临床丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。丙肝疫苗6His-CTBt-Bt与30个临床难治性丙型肝炎病毒基因型1病人血清中的29个发生反应，反应率为96.67%图4。这些结果表明烟草表达的丙肝疫苗6咐3-^^1：-81:在人体内具有很好的抗原性，也说明烟草表达的6His-CTBt-Bt可应用于临床难治性丙型肝炎病毒基因型1感染者的诊断。[0161]实施例5[0162]病毒进入抑制实验测定疫苗的病毒感染抑制效果，其方法如下：[0163]丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子携带荧光素酶基因，日本TakajiWakita教授惠赠用1tngml的疫苗蛋白或0.5mgml的CD81抗体丙型肝炎病毒进入抑制的阳性对照）37度孵育2小时，然后，未孵育和孵育的假病毒粒子分别感染Huh7.5.1细胞美国FrancisV.Chisari教授惠赠）。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性病毒滴度的指示剂实验测定每种细胞内的病毒滴度，确定疫苗对病毒感染的抑制效果。[0164]按前面所述实验方法，难治性丙型肝炎病毒基因型1假病毒粒子用疫苗蛋白孵育，感染Huh7.5.1细胞。3天后，收获细胞，测定荧光素酶活性病毒粒子滴度的指示剂）。与未孵育的难治性丙型肝炎病毒基因型1假病毒粒子相比，丙肝疫苗6His-CTBt-Bt孵育强烈抑制病毒粒子感染，使病毒感染性降低了86.5%。作为阳性对照，CD81孵育病毒粒子显著降低了病毒感染性（图4。这些结果表明：烟草表达的疫苗6His-CTBt-Bt在体外具备很强的中和难治性丙型肝炎病毒基因型1病毒感染的能力。

权利要求：1.丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位6His-CTBt-Bt在制备丙型肝炎病毒疫苗中的应用；所述丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt的氨基酸序列为：HisHisHisHisHisHisMetHeLysLeuLysPheGlyValPhePheThrValLeuLeuSerSerAlaTyrAlaHisGlyThrProGinAsnlieThrAspLeuCysAlaGluTyrHisAsnThrGinlieHisThrLeuAsnAspLysliePheSerTyrThrGluSerLeuAlaGlyLysArgGluMetAlalielieThrPheLysAsnGlyAlaThrPheGinValGluValProGlySerGinHislieAspSerGinLysLysAlalieGluArgMetLysAspThrLeuArglieAlaTyrLeuThrGluAlaLysValGluLysLeuCysValTrpAsnAsnLysThrProHisAlalieAlaAlalieSerMetAlaAsnlieThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerGlySerAlaSerGlylieThrSerLeuPheSerArgGlyProSerGinLyslieGinLeuValAsnThrAsnGlySerTrpHislieAsnArgGlySerGlyPheLeuAlaAlaLeuPheTyrAlaHisArgPheGlySerGlyValProThrTyrAsnTrpGlyGluAsnGluThrAspValLeuLeuLeuAsnGlySerAspTyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrValAsnPheThrliePheGlySerMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuAspAlaAlaCysAsnTrpThrArg〇

百度查询： 江西农业大学 用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt

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