申请/专利权人：中国农业科学院生物技术研究所

申请日：2018-08-10

公开（公告）日：2018-12-07

公开（公告）号：CN108948168A

主分类号：C07K14/415(2006.01)I

分类号：C07K14/415(2006.01)I;C12N15/29(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;A01H5/00(2018.01)I;A01H6/46(2018.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.03#授权;2019.01.01#实质审查的生效;2018.12.07#公开

摘要：本发明涉及玉米籽粒大小基因ZmSWEET1b及应用，属于玉米遗传育种。糖转运蛋白ZmSWEET1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。实验结果表明，玉米ZmSWEET1b基因是影响玉米籽粒大小的基因，合理利用ZmSWEET1b基因可以提高玉米产量，进行高产稳产育种。

主权项：1.糖转运蛋白ZmSWEET1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。

全文数据：玉米籽粒大小基因ZmSWEETIb及应用技术领域[0001]本发明属于玉米遗传育种领域，具体涉及一个影响玉米叶片衰老和籽粒大小的基因ZmSWEETIb及应用背景技术[0002]植物在生长发育过程中，如果一个器官产生的光合作用产物大于它消耗的光合作用产物，这样的器官被称为“源”；反之，如果一个器官消耗或储存的光合作用产物大于其产生的光合作用产物，这样的器官称为“库”；光合作用产物从“源”向“库”的运输称为“流”HerbersKandSonnewaldU.CurrOpinPlantBiol,1998,13:207-216；Borchers-ZampiniC，etal.PlantPhysiol,1980,656:1116-1120。玉米灌楽期的源和库分别为叶片和雌穗，在这一时期，雌穗（“库”）的生长依赖于叶片（“源”）源源不断地向它提供光合作用产物。因此，灌浆期“源库关系”是影响玉米产量的关键因素BorrasL，etal.FieldCropRes，2004,862-3:131-146。玉米灌浆期的“源库关系”，不仅涉及碳水化合物从“源”到“库”的转运，还涉及到“源”器官（叶片）的衰老。灌浆期光合作用器官（主要是叶片）如果衰老速率过快，会导致光合作用效率迅速降低、光合作用产物积累不足、产量降低YangL，etal.PLoS0ne，2016，ll9:e0162201。如果玉米在灌浆结束后仍然保持滞绿的表型，会导致营养元素大量滞留在叶片，而没有通过营养物质的再动员remobilization转运到轩粒中（DonnisonIS,etal.NewPhytol,2007,1733:481-494。因此，合理调节灌浆和衰老二者的速率，对于实现玉米产量最大化具有重要意义。[0003]细胞的大小和数量决定了籽粒的大小和重量，在发育的种子中，高效的糖运输机制对籽粒的大小和重量起着决定性的作用WangE，etal.NatureGenet,2008,4011:1370-1374。种子碳水化合物的多少直接决定种子的大小，并且这种籽粒产量的增加可以通过驯化来达到。玉米中已发现的糖转运蛋白是ZmSWEET4c，ZmSWEET4c在玉米授粉后10-17天的表达量升高，同时伴随着大量的糖运输进发育的种子中。ZmSWEET4c运输糖至基底胚乳转移层（BasalEndospermTransferLayer,BETL后可引起BETL的膜面积增加，进而增强ZmSWEET4c的转运，其最终的结果就是糖运输进胚乳的能力增强，籽粒糖积累增加（SossoD，etal.NatureGenet,2015,4712:1489-1493C3ZmSWEET^的突变体籽粒明显小于正常植株的籽粒，该基因的缺失导致了BETL中己糖转运功能的丧失，进一步的影响了糖从韧皮部的转运。另一类糖转运蛋白是鹿糖转运蛋白（Sucrosetransporter，SUT，在SUT的作用下，韧皮部外质体的蔗糖进入筛管伴胞复合体并被富集。然后，蔗糖在韧皮部中经过长途运输，最终到达“库”器官（EomJS,etal.CurrOpinPlantBiol，2015,25:53-62;ChenLQ，etal.Annurevbiochem,2015,84:865-894。但是，除了SUT家族的鹿糖转运蛋白SUTl和SUT2SlewinskiTL,etal.JExpBot，2009,603:881-892;LeachKA，etal.JIntegrPlantBiol,2017,596:390-408，以及SWEET家族的ZmSWEET4c，目前还没有玉米的其他糖转运蛋白参与玉米光合产物的源库转运和籽粒大小形成的报道。发明内容[0004]本发明提供一种糖转运蛋白ZmSWEETlb，其参与玉米光合产物的源库转运和籽粒大小，影响玉米叶片衰老和籽粒大小，对玉米的高产育种有重要的指导意义。[0005]糖转运蛋白ZmSWEETlb，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所述。[0006]编码糖转运蛋白ZmSWEETlb的基因。[0007]所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述。[0008]上述基因在玉米育种中的应用。[0009]本发明采用EMS甲基磺酸乙酯）诱变玉米郑58自交系，获得了一个突变体earlysenescencel简称esl保藏编号:CGMCC15471，esl突变体的籽粒小于野生型的籽粒。通过基因分析，表明GRMZM2G153358的第四个外显子发生了一个G到A的变异，导致其蛋白质序列发生了谷氨酰胺突变为赖氨酸。[0010]GRMZM2G153358是玉米糖转运蛋白ZmSWEETlb基因，位于玉米第6号染色体长臂。其基因组序列GenomicDNA如SEQIDNO.1所示，cDNA序列如SEQIDNO.2所示，翻译的蛋白质序列如SEQIDNO.3所示。通过蛋白结构分析，ZmSWEETlb蛋白有7个跨膜区，在esl突变体中是ZmSWEETlb基因的第3个跨膜区的谷氨酰胺E81突变为赖氨酸K81图4。通过ZmSWEETlb基因验证，结果说明ZmSWEETlb基因上G到A的突变确实造成了esl表型，用CRISPRCas9系统在玉米COl自交系背景下敲除了ZmSWEETlb基因，在Tl代转基因玉米中获得了4个纯合变异类型（esl-cl，esl-c2，esl-c3，esl_c4，所有的纯合突变体都表现出早衰和百粒重降低的表型，因此说玉米ZmSWEETlb基因是影响玉米籽粒大小的基因，合理利用ZmSWEETlb基因可以提尚玉米广量，进彳丁尚广稳广育种。[0011]ZmSWEETlb基因位于玉米叶片的副卫细胞膜上，可以调节气孔的开度，提高光合效率，在育种上可以利用基因工程手段提高ZmSWEETlb基因的表达量或者在玉米自交系中寻找ZmSWEETlb基因表达量较高的单倍型材料，与玉米骨干自交系杂交转育，提高玉米产量。所以通过选育ZmSWEETlb基因表达水平高的玉米来培育高产玉米进行育种应用。[0012]玉米Zeamaysesl突变体，其保藏编号：CGMCC15471。[0013]保藏日期：2018年7月19日[0014]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0015]保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所附图说明[0016]图1玉米esl突变体表型图：灌浆期叶片早衰、光合作用效率下降和百粒重降低[0017]其中a为野生型和esl突变体玉米在吐丝前5天和吐丝后15天叶片比较图、b为不同叶片标记说明、c为野生型和esl突变体玉米在吐丝前6天到吐丝后30天叶绿素含量变化图、d为野生型和esl突变体玉米在吐丝后0天、10天、20天和30天光合速率比较图、e为野生型和esl突变体玉米在授粉后0天至60天百粒重比较、f为野生型和esl突变体玉米在授粉后0天至60天百粒重干重比较、g为野生型和esl突变体玉米在授粉后0天至60天含水量比较图，WT为野生型，esl为本发明筛选的突变体[0018]图2玉米郑58和esl突变体的果穗和籽粒图对比图[0019]图3玉米ESl基因的图位克隆结果和esl突变体突变位点[0020]图4玉米ZmSWEETIb蛋白跨膜结构图和突变位置[0021]图5玉米ZmSWEETlb基因敲除突变体表型分析[0022]图6玉米ZmSWEETlb蛋白亚细胞定位图[0023]a转化玉米原生质体;b转化烟草叶片[0024]图7玉米ZmSWEETlb蛋白定位在玉米叶片副卫细胞膜[0025]图8BiFC实验证明玉米ZmSWEETlb蛋白形成寡聚体具体实施方式[0026]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。[0027]实施例1玉米早衰和产量降低突变体的发现[0028]采用EMS甲基磺酸乙酯）诱变玉米郑58自交系构建了库容8000株的突变体库，在突变体库中获得了一个突变体earlysenescencel简称eslCGMCC15471。在灌浆期之前，esl突变体不表现出任何可见的表型。但是，从吐丝前5天（5DBS，daysbeforesilking开始，esl叶片开始出现衰老的表型，表现为下部叶片开始失绿。到吐丝后第15天15DAS,daysaftersilking，esl的大部分叶片都表现出失绿的表型（图la。进一步在灌浆期使用SPAD502叶绿素含量测定仪柯尼卡美能达公司）对叶片的叶绿素含量进行连续观测，发现esl的叶绿素含量降低不仅比野生型发生得早，其发展的速度也比野生型快（图Ic。不仅如此，esl叶片的光合效率也比野生型叶片低（图Id。[0029]灌浆期源器官的光合作用效率是产量的重要决定因素，因此我们进一步研究esl突变是否影响产量。从授粉前5天到授粉后60天，每隔5天对esl突变体和野生型的百粒重包括湿重和干重进行测量。发现从授粉后25天开始，esl的百粒重显著低于野生型，在授粉后60天时，esl的百粒重包括湿重和干重）比野生型低7%图Ie和图If。比较野生型和esl突变体籽粒的脱水速率没有差别（图Ig。收获的野生型和esl突变体的果穗和籽粒见图2,可见果穗的生长受到影响，esl突变体的果穗小于野生型果穗，esl突变体的籽粒长度和宽度都小于野生型的籽粒。[0030]实施例2玉米ESl基因的确定[0031]为了克隆ESl基因，我们构建了eslXB73F2遗传作图群体，对F2代作图群体中野生型和早衰突变体的个数进行统计，在727个F2个体中，169个个体表现出esl表型，558个个体表现出野生型表型，卡方检验结果说明该F2代遗传作图群体并未偏离3:1的孟德尔遗传分离比x2=l.19〈x2〇.Q5=3.84表1。因此，控制该早衰性状的为单隐性突变。[0032]表1卡方检验结果[0034]对esl基因进行图位克隆，第一步采用BSABulkedSegregantAnalysis寻找与esl连锁的分子标记，以期确定esl在玉米基因组中的大概位置。按照表型不同，将早衰玉米突变体的基因组DNA混成一个“池”，将正常表型玉米的基因组DNA混成一个“池”，采用分布在玉米10条染色体的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯凝胶电泳检测，部分引物序列在表2中列出，PCR扩增体系为2XTaqMasterMix10yL，PrimerFR10ymolL_1各lyL，基因组DNAlyL，ddH20补足至20yL;反应条件：94°C预变性2min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸40s，30个循环；72°C延伸5min。通过BSA分析，获得与esl紧密连锁的8个分子标记，分别为SSRl14，SSR012，SSRl12，SSR162，SSRl13，SSR105，SSR132，SSRl15。用上述8对SSR引物，在F2代遗传作图群体中对每一棵植株进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，拍照，读带，统计。其中，F2代遗传作图群体中带型与亲本郑58—致的记为Z，与亲本B73—致的记为B，杂合基因型记为H。将统计出的条带输入到Excel软件并计算交换律，通过最大似然函数将重组率转化为遗传图距，结果表明，候选基因位于SSR分子标记bnlgl702和umcl462之间（图3a。[0035]表2SSR引物序列[0037]第二步根据SSR标记定位的结果，比对郑58玉米与B73玉米特定区域的基因组序列，挖掘SNPSingleNucleotidePolymorphism，设计HRM引物见表3，对SSR标记确定的特定区域的重组株，进行HRM-PCR扩增。HRM-PCR反应体系如下：IOXTaqBuffer2yL，PrimerFR10ymol.L_1各lyL，2mMdNTPMixture2.5yL，基因组DNA100ng.yL_1lyL，rTaq酶lyL，高分辨的饱和LCGreen荧光染料试剂2yL，ddH20补足至20μL，进行PCR之前，采用石蜡油进行液封。反应条件：94°C预变性2min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸4〇8,30个循环;72°：延伸51^11。!11«1-?0?反应完成后，将扩增产物放进1^81^3〇3111^^96高分辨溶解曲线分析系统，根据熔解曲线，进一步缩小与目标基因连锁的区域。该区域包含了5个有功能的基因，分别为GRMZM2G153333，GRMZM2G153358，GRMZM2G456568，GRMZM2G701177和GRMZM2G058472图3a。将5个基因利用Sanger测序，结果表明这5个基因中只有GRMZM2G153358的第四个外显子发生了一个G到A的变异，导致其蛋白质序列发生了谷氨酰胺突变为赖氨酸E81K图3b。[0038]表3HRM-PCR引物[0041]实施例3玉米ZmSWEETlb基因分析[0042]在玉米MaizeGDB网站B73RefGen_V3https:www·maizegdb·org检索GRMZM2G153358基因信息。GRMZM2G153358是玉米糖转运蛋白ZmSWEETlb基因，位于玉米第6号染色体长臂。其基因组序列GenomicDNA如SEQIDNO.1所示，cDNA序列如SEQIDNO.2所示，翻译的蛋白质序列如SEQIDNO.3所示。ZmSWEETlb基因有6个外显子、5个内含子，编码250个氨基酸。利用蛋白结构分析软件PROTTERhttp:wlab.ethz.chprotterstart对ZmSWEETlb蛋白进行了结构预测，分析结果显示ZmSWEETlb蛋白有7个跨膜区，N端位于细胞膜的外部，C端位于细胞膜内部，在esl突变体中是ZmSWEETlb基因的第3个跨膜区的谷氨酰胺E81突变为赖氨酸K81图4。[0043]实施例4玉米ZmSWEETlb基因验证[0044]为了验证是否由于ZmSWEETlb基因单位点突变导致了es1突变体的表型，构建了两个CRISPRCas9敲除ZmSWEETlb基因的植物表达载体，靶位点分别位于ZmSWEETlb的第三外显子和第四个外显子载体保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供），将两个植物表达载体通过农杆菌转化方法转化玉米自交系COl，获得TO代转基因玉米种子，将TO代玉米种子种植后，先用PCR方法确定转基因阳性植株，检测引物是barF5’-GCACCATCGTCAACCACTAC-3’）和barR5’-AGAAACCCACGTCATGCCAG-3’），PCR扩增体系为2XTaqMasterMix10yL，PrimerbarFbarR10ymolL-1各lyL，基因组DNAlyL，ddH20补足至20yL;反应条件：94°C预变性2min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环；72°C延伸5min。确定阳性植株后用靶位点两侧序列设计引物E3F5’-AAACTGATCATCTGTCGGG-3’）和E3R5’_TTAGCTTGCTACTAGCTAGC-3’），扩增靶位点序列，发现在ZmSWEETlb基因的第三个外显子靶位点处有13个碱基的缺失，导致ZmSWEETlb蛋白无法正常表达，同样方法发现在第四个外显子处有三个位点的纯合突变，分别缺失lbp、Ibp和5bp，导致ZmSWEETlb基因移码突变，无法正常表达ZmSWEETlb蛋白，这4个纯合变异类型称为681_cl，eSl-C2，esl-c3,esl-c4图5，四个纯合突变体都表现出叶片早衰、失绿的表型（图5，同时百粒重降低（图5，与esl突变体的表型是一致的，这些结果说明ZmSWEETlb基因上G到A的突变确实造成了esl表型。[0045]实施例5ZmSWEETlb基因亚细胞定位和组织定位[0046]通过ZmSWEETlb蛋白结构预测，其有7个跨膜区，但是ZmSWEETlb基因在玉米中的亚细胞定位和组织定位如何?首先利用两个瞬时表达体系（玉米原生质体转化和烟草叶片注射转化）分析ZmSWEETIb蛋白的亚细胞定位，构建了三个转化载体，载体骨架来源于PCAMBIA3300商业载体，可以从生物公司购买），对照载体为CaMV35S:eYFP，是花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子与增强型黄色荧光蛋白相连再连接到pCAMBIA3300骨架中获得，CaMV35S:ZmSWEETlb-eYFP从郑58玉米中克隆ZmSWEETlb基因的CDS序列与eYFP融合表达再连接到PCAMBIA3300载体骨架中获得，CaMV35S:ZmSWEETlBE81K-eYFP载体是从esl突变体中克隆的ZmSWEETlb突变基因的⑶S序列与eYFP融合表达再连接到pCAMBIA3300载体骨架中获得质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供），首先将三个载体分别转化玉米原生质体，转化方法见李圣彦博士论文中所述李圣彦.玉米萜类合成酶基因TPSlO表达调控的研究[博士学位论文].北京：中国农业大学，2015，转化完成后，避光过夜培养，培养后将原生质体转移到2mL灭菌处理的EP管中。制片时，加入FM4-64作为膜Marker，使用LSM700激光共聚焦显微镜观察原生质体中荧光。在转化的玉米原生质体中可见ZmSWEETlb蛋白位于细胞质膜上，与FM4-64染色的细胞质膜正好重合，单位点突变的ZmSWEETlbE81K蛋白也可以定位在细胞质膜上，与ZmSWEETlb蛋白定位一致，说明E81K的突变没有影响基因定位，该结果与预测相同是一个结合在细胞质膜上的蛋白（图6a。为了验证上述结论，我们又进行了烟草瞬时表达实验，先将CaMV35S:eYFP、CaMV35S:ZmSWEETlb-eYFP和CaMV35S:ZmSWEETlbE81K-eYFP三个载体分别转化农杆菌，挑取阳性克隆，继续扩大培养，离心后用重悬浮缓冲液悬浮菌体，室温下培养2-3h后，使用IOmL的注射器注射烟草幼嫩叶片，注射完成后，于原培养环境中培养2-3天，一般在第二天进行观察，观察当天，使用IOmL的注射器以同样的方法注射FM4-64染料，注射孔选择在原注射孔旁边，这样可以增加eYFP荧光和FM4-64染料的重合区域，易于观察。注射后反应5-10min，剪取注射孔附近没有机械损伤的部位，使用LSM700激光共聚焦显微镜观察实验结果。由图6b可以看出，CaMV35S:eYFP、CaMV35S:ZmSWEETlb-eYFP和CaMV35S:ZmSWEETlbE81K-eYFP均成功的在烟草叶肉细胞表达，并且信号比较强。CaMV35S:eYFP为对照载体，其荧光信号在烟草叶片细胞核、细胞膜等部位均能看到eYFP的荧光信号，CaMV35S:ZmSTCETlb-eYFP和CaMV35S:ZmSTCETlbE81K-eYFP的荧光信号在细胞质膜上，eYFP的信号与FM4-64的信号吻合，即ZmSWEETlb蛋白定位在细胞质膜，且突变不影响其定位。[0047]通过上述实验证明ZmSWEETlb蛋白在亚细胞水平定位于细胞质膜。为了确定ZmSTCETlb蛋白在玉米中的组织器官定位，构建了两个植物表达载体PromoterZmSWEETlb:ZmSWEETlb_eYFP:terminatorZmSWEETlb和PromoterZmSWEETlb:ZmSWEETlb-GUS:terminatorZmSWEETlb，载体骨架为PCAMBIA3300是一个商业载体，可以从生物公司购买），先克隆ZmSWEETlb的启动子及基因区域，在终止子前一小段序列插入eYFP报告基因或者⑶S报告基因，融合表达后，后连接ZmSWEETlb基因的3’端终止子序列（质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供），载体构建完成后，以HiII玉米胚为材料进行遗传转化，获得转基因玉米种子，种子播种后，待幼苗的第二片叶子长到l〇-15cm时，对转基因幼苗进行eYFP荧光观察和⑶S染色分析。在观察eYFP荧光时，剪取Icm左右的叶片，浸泡于含有11000TritonX-100FM4-64溶液中，抽真空15min，便可制片使用LSM700激光共聚焦显微镜观察实验结果并拍取照片。结果如图7a所示，FM4-64将玉米叶片细胞的细胞质膜染成红色，eYFP荧光定位于气孔的副卫细胞膜上，FM4-64信号与eYFP信号重合，所以，ZmSWEETlb蛋白定位在玉米气孔的副卫细胞膜。GUS染色结果与eYFP相同，也定位在气孔的副卫细胞膜上，由于⑶S连接在ZmSWEETlb基因的C端，C端位于细胞膜内，所以⑶S的蓝色在细胞内可见（图7b。[0048]实施例6ZmSWEETlb蛋白以二聚体或寡聚体的形式转运葡萄糖[0049]以上研究发现ZmSWEETlb蛋白与突变蛋白ZmSWEETlbE81K蛋白都可以定位在细胞膜上，但esl突变体的表型与野生型差别很大。拟南芥和水稻中的SWEET蛋白都可以形成寡聚体结构，这种结构可在疏水性的膜上形成亲水的孔道，利于糖分子的通过。为了验证ZmSTCETlb蛋白是否也具有相似的性质，我们设计了双分子荧光互补（BimolecularFluorescenceComplementation，BiFC实验。eYFP焚光蛋白按照一定规则切分为氨基端和羧基端后，两者空间上彼此接近时会组合成具有活性的荧光基团，如果ZmSWEETlb蛋白以二聚体或者寡聚体的形式存在，就会使eYFP荧光蛋白的氨基端和羧基端接近，可以观察到黄色荧光。将ZmSWEETlb基因的⑶S序列和ZmSWEETlbE81K基因的⑶S序列分别与eYFP的氨基端NE和羧基端CE融合，构建融合表达载体质粒均保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供）。将各载体转化农杆菌，稀释菌液至〇D_值0.4，注射烟草幼嫩叶片，注射后在原培养环境中继续培养烟草2-3天，观察当天，使用IOmL的注射器注射FM4-64染料，注射孔选择在原注射孔旁边，注射后反应5-10min，剪取注射孔附近没有机械损伤的部位，使用LSM700激光共聚焦显微镜观察实验结果。实验结果表明ZmSWEETlb蛋白即ESl蛋白）可以形成二聚体或寡聚体，产生黄色荧光，但是ZmSWEETlbE81K蛋白没有观察到黄色荧光，不能形成寡聚体，无法形成跨膜孔道（图8，所以影响了玉米叶片光合作用产生糖的运输，最终导致玉米的籽粒变小，产量降低。玉米ZmSWEETlb基因是影响玉米籽粒大小的基因，合理利用ZmSWEETlb基因可以提高玉米产量，进行高产稳产育种。

权利要求：1.糖转运蛋白ZmSWEETlb，其氨基酸序列如SEQIDN0:3所述。2.编码权利要求1所述的糖转运蛋白ZmSWEETlb的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所述。4.权利要求1所述的糖转运蛋白ZmSWEETlb的cDNA序列，如SEQIDN0:2所述。5.权利要求2或3所述的基因在玉米育种中的应用。

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