申请/专利权人：布莱恩·J·赫尔尼奇

申请日：2016-04-07

公开（公告）日：2017-09-26

公开（公告）号：CN107206045A

主分类号：A61K38/00(2006.01)I

分类号：A61K38/00(2006.01)I;A61K38/16(2006.01)I;C07K2/00(2006.01)I;C07K16/28(2006.01)I

优先权：["2015.07.17 US PCT/US2015/041034","2016.03.04 US PCT/US2016/021042"]

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2021.09.17#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.08.10#实质审查的生效;2017.09.26#公开

摘要：本发明提供了可以刺激免疫系统并且可以用于治疗与HER‑3蛋白的过表达相关的恶性肿瘤的组合物、方法和疫苗。这样的组合物包括HER‑3蛋白的表位。

主权项：一种分离肽，其选自由以下组成的组：p11‑13肽51‑75：KLYERCEVVMGNLEIVLTGHNADLSFLQWSEQ ID NO.1，p81‑83肽401‑425：SWPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNSEQ ID NO.2，p84‑86肽416‑440：TTIGGRSLYNRGFSLLIMKNLNVTSSEQ ID NO.3，p12肽56‑70：CEVVMGNLEIVLTGHSEQ ID NO.4，p81肽401‑415：SWPPHMHNFSVFSNLSEQ ID NO.5，p84肽416‑430：TTIGGRSLYNRGFSLSEQ ID NO.6和p91肽451‑465：AGRIYISANRQLCYHSEQ ID NO.7。

全文数据：用于基于免疫的治疗的免疫原性MHCII类肽的鉴定[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请是于2016年3月4日提交的申请序列号PCTUS1621042的部分继续申请，PCTUS1621042又是2015年7月17日提交的PCTUS1541034的部分继续申请，PCTUS1541034又要求了以下优先权和权益:2014年11月7日提交的美国临时申请序列号62076，789以及2014年7月17日提交的美国临时申请序列号62025,681，将以上每个的内容以其全文并入本申请参考。[0003]本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入本文。所述ASCII复制，在2006年6月14日创建，被命名为319_003_PCT_CIP2_SL，txt，大小为2，666字-K-To背景技术[0004]在25-30%的乳腺癌中，生长因子受体基因HER2人表皮生长因子受体-2,也称为neuerbB2的扩增和过表达与增强的肿瘤浸润性以及复发和死亡的高风险性相关Slamon，D.等，1987，Science235:177;Yarden，Υ·，2001,Oncology1:1。该致癌基因编码185千道尔顿kDa的跨膜受体酪氨酸激酶RTK。作为人类表皮生长因子受体EGFR家族的四个成员之一，HER2本身以如下几种方式与其他进行区别。首先，HER2是孤儿受体。没有鉴定到高亲和力配体。第二，对其他EGFR家族成员（HER1EGFR、HER3和HER4，HER2是用于形成异二聚体的优选配偶体，异二聚体显示高配体亲和力和优异的信号传导活性。第三，全长HER2进行蛋白水解切割，释放出可溶性细胞外结构域ECD。脱落的ECD在体外和体内均已经显示出可作为全长HER2活化机制的替代物，因为其留下了具有激酶活性的膜锚定片段。不管其表达水平如何，HER2在EGFR家族信号传导中的中心作用与其参与的几种癌症类型的肿瘤发生相关，如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和胃癌（Slamon，D.等，1989，Science244:707;Hynes，Ν·等，1994,Biochem.Biophys.Acta.1198:165DHER2还可以使肿瘤细胞对某些化学治疗剂具有抗性Pegram，M.等，1997,0ncogene15:537。鉴于其在肿瘤发生中的重要作用，HER2是癌症治疗的重要靶标。[0005]受体酪氨酸激酶的人类EGF受体HER家族调节多种生物过程，包括细胞增殖、迀移、侵袭和存活。该家族由四个成员组成：EGFRHERl、HER2neu或ErbB2、HER3ErbB3和HER4ErbB4。迄今为止，已经报道了11种配体，包括表皮生长因子EGF、肝素结合性EGF样生长因子HB-EGF、转化生长因子aTGFa、双调蛋白（AR、上皮调节蛋白、辟田胞素和调蛋白。这些配体直接结合其同源受体，这导致受体同二聚体或异二聚体的形成，其触发多个信号传导途径的活化。通过激活突变、受体过表达或异常配体释放，HER-家族成员的失调导致各种人类肿瘤的发展。HER3在乳腺癌、卵巢癌和肺癌中过表达，并且这种遗传特征与不良预后相关。一旦被调蛋白激活，HER3与HER2、EGFR二聚化以形成有效的致癌受体异二聚体。在这个复合体内，HER3优先募集PI3激酶到其细胞质对接位点，从而调节细胞增殖和存活。到目前为止，人们假定HER3是激酶-失活kinase-inactive的，因为其激酶结构域中有明显异常的序列特征，并且人们假定HER3需要与HER家族的激酶-完整成员进行异二聚化以便启动信号事件。与此相一致，据显示HER2需要HER3以驱动乳腺肿瘤细胞增殖。然而，最近的研究结果表明，HER3能够磷酸化Pyk2,其导致人神经胶质瘤细胞中MAH通路的激活。此外，HER3特异性的单克隆抗体可以抑制癌细胞系的增殖和迀移。有趣的是，最近显示癌细胞通过上调HER3信号传导而逃避HER家族抑制剂治疗，并且HER3的抑制消除了乳腺癌细胞中HER2驱动的他莫昔芬耐药性。此外，据显示，对吉非替尼（Iressa—种EGFR小分子抑制剂）治疗的抗性与HER3信号激活有关。[0006]HER3是在调节正常细胞生长中起重要作用的受体蛋白。HER3缺乏内在激酶活性，并且依赖于HER2的存在进行跨细胞膜转导信号。最初转录时，HER3的前体mRNA含有28个外显子和27个内含子。完全剪接好的HER3mRNA由28个外显子组成，该HER3mRNA中内含子已经被剪接出来了。[0007]在过去的十年中，靶向治疗已经成为癌症治疗的基石。因为这些受体酪氨酸激酶在许多癌症中会失调，所以，EGF受体家族成员-S卩EGFR或HERl和ErbB2或HER2neu已经演变为非常有吸引力的靶标。因为在介导对HER2和PI3K通路-导向的治疗的抗性中起主要作用，EGF受体家族的另一成员ErbB3或HER3的致癌功能在最近被仔细考察，。已经在许多不同的肿瘤类型，包括乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和黑色素瘤中鉴定了HER3的激活突变和或过表达，这些在这些肿瘤中预示一个较差的总体预后。[0008]尽管在该领域有所进展，仍然不确定使用基于细胞或基于蛋白质的以HER-3为靶向的疫苗策略是否可以在人类中产生有效的免疫应答。因此，本领域需要具有其他的免疫治疗方法用于治疗或预防与HER-3蛋白的过表达相关的乳腺癌和其他恶性肿瘤。本具体实施方式满足了这种需求。附图说明[0009]当结合附图阅读时，将更好地理解本发明中以下详细描述的优选实施例。为了说明本发明的目的，附图中显示出了目前优选的实施例。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确布置和手段。[0010]图1显示了在许多患者中具有激活CD4T细胞能力的来自HER-3的免疫原性肽（SEQIDNO:1-3,按照出现的顺序）。[0011]图2显示具有10个肽片段的组的HER3全局筛选。图2还显示了具有单肽的HER3筛选SEQIDNO:4-7,按照出现的顺序）。[0012]图3显示具有10个肽片段的组的HER3全局筛选。图3还显示了具有单肽的HER3筛选SEQIDNO:4-7,按照出现的顺序）。[0013]图4显示具有10个肽片段的组的HER3全局筛选。图4还显示了具有单肽的HER3筛选SEQIDNO:1-3,按照出现的顺序）。[0014]图5显示来自不同HER3肽的IFN-γ产量。[0015]图6显示来自不同HER3肽的IFN-γ产量。[0016]图7显示了来自“反向”筛选的IFN-γ产量，从先前鉴定的肽开始，对肽和HER3细胞外结构域敏化。[0017]图8显示了来自“反向”筛选的IFN-γ产量，从先前鉴定的肽开始，对肽和HER3细胞外结构域敏化。[0018]图9显示了在患者中来自“反向”筛选的IFN-γ产量，该患者先前未用HER细胞外结构域敏化，从先前鉴定的肽开始，对肽和HER3细胞外结构域敏化。[0019]图10显示了在患者中来自“反向”筛选的IFN-γ产量，该患者先前未用HER细胞外结构域敏化，从全肽文库开始，对肽和HER3细胞外结构域敏化。[0020]图11显示了在患者中来自“反向”筛选的IFN-γ产量，该患者先前未用HER细胞外结构域敏化，从全肽文库开始，对肽和HER3细胞外结构域敏化。[0021]图12显示了先前未用HER细胞外结构域敏化的患者的来自“反向”筛选的IFN-γ产量，从肽开始，对肽和HER3细胞外结构域敏化。[0022]图13显示了供体#UPCC15107-24中的连续肽筛选。[0023]图14显示了供体#UPCC15107-38中的连续肽筛选。[0024]图15显示了供体#UPCC15107-38和UPCC15107-24中的“反向”敏化。[0025]图16显示了供体#UPCC15107-30和UPCC15107-32中的免疫原性HER3表位-脉冲的DCl敏化⑶4+Thl和克服抗HER3免疫耐受性两个患者具有已知的对鉴定的HER3肽和或天然HER3ECD的抗HER3非反应性）。[0026]图17显示了表明MHCII类异位的免疫原性CD4+HER3表位。[0027]图18显示了在腔室中将激活的HER-3⑶4+细胞放置在临近HER-3表达细胞旁边，HER-3⑶4+细胞引起HER-3表达细胞乳腺癌细胞的凋亡或死亡。[0028]图19显示了使用HER3的ECD作为肿瘤抗原鉴定免疫原性II类混杂的HER3CD4+肽的方法，以产生抗HER3Thl细胞免疫。[0029]图20显示了通过“反向”敏化鉴定的⑶4+HER3E⑶表位的免疫原性的验证。使用所示的单肽进行HER3E⑶筛选。[0030]图21显示了通过“反向”敏化鉴定的⑶4+HER3E⑶表位的免疫原性的验证的另外结果。[0031]图22显示了HER染色的免疫组织化学评分的照片。[0032]图23A和23B是显示了在低度异型增生LGD或高度异型增生HGD的Barrett食管中HER家族过表达比率的柱状图（图23A，和与Barrett病变与癌相关的HGD相关的高度异型增生或无相关浸润性癌的高度异型增生中HER家族过表达比率的柱状图（图23B。[0033]图24A-24C显示了来自HDs健康供体）至ERIBCERP°SIBC雌激素受体阳性浸润性乳腺癌（IBC和TNBCC三阴性IBC的抗HER3CD4Thl细胞应答下降。附图显示了系统性⑶4+Thl细胞应答的IFN-γELISpot分析的柱状图（左图）。研究的患者组为:健康供体HD;良性乳腺活检BD;HER2阳性（“HER2P°S”）原位导管癌DCIS;HER2浸润性乳腺癌HER2阳性浸润性乳腺癌HER2IBCHER2P°SIBC;雌激素受体浸润性乳腺癌雌激素受体阳性浸润性乳腺癌ERIBCERP°SIBC;和三阴浸润性乳腺癌TNIBC。与各个柱状图的右侧对应的表是个体比较，通过在同一时间内两组间“学生”t检验得到的。对所有组进行单向方差分析。图24A显示了通过ELISpot测定的由IFN-γ斑点数百万细胞测量的累积抗HER3CD4T细胞应答，其显着地从HDs下降到BDs到DCIS到HER2P°SIBC到ERpcisIBC，最后降到TNIBC分别为90、80、66、79、48、40，p=0.01。图24B显示了响应库，或具有阳性CD4Thl应答的HER3肽的数目，显着地从HDs下降到BDs到DCIS到HER2P°SIBC到ERpcisIBC，最后到TNIBC分别为1.0、0.6、0.8、0.8、0.5、0.3，p=0.003。图24C显示了响应率，与至少1种肽响应的受试者的百分比显着地从HDs下降到BDs到DCIS到HER2P°SIBC到ERposIBC，最后到TNIBC分别为76·7%、63·6%、53·8%、66·7%、45·0%、33·3%，ρ=0·02。[0034]图25Α和25Β显示了⑶4Τ细胞应答的丧失是HER3特异性的，因为在测试的患者组之间在破伤风或抗CD3CD28刺激方面没有差异。附图显示了系统性CD4+Thl细胞应答的IFN-YELISpot分析的柱状图（左图）。研究的患者组为:健康供体；良性乳腺活检;HER2阳性原位导管癌;HER2浸润性乳腺癌HER2阳性浸润性乳腺癌;雌激素受体浸润性乳腺癌雌激素受体阳性浸润性乳腺癌;和三阴浸润性乳腺癌。与各个柱状图的右侧对应的表是个体比较，通过在同一时间内两组间“学生”t检验得到的。对所有组进行单因素方差分析。图25A显示了在健康供体、良性乳腺活检、HER2阳性原位导管癌、HER2浸润性乳腺癌HER2阳性浸润性乳腺癌、雌激素受体浸润性乳腺癌雌激素受体阳性浸润性乳腺癌和三阴浸润性乳腺癌之间，通过ELISpot测定的由IFN-γ斑点数200，000个细胞测量的破伤风反应中没有统计学上的显着性差异分别为37、30、19、34、24、29，ρ=0.01。图25Β显示了在健康供体、良性乳腺活检、HER2阳性原位导管癌、HER2浸润性乳腺癌HER2阳性浸润性乳腺癌、雌激素受体浸润性乳腺癌雌激素受体阳性浸润性乳腺癌和三阴浸润性乳腺癌之间，通过ELspot测定的由IFN-γ斑点数200,000个细胞测量的抗⑶3抗⑶28多克隆刺激中没有统计学上的显着性差异（分别为688、549、804、699、629、675，ρ=0·68。[0035]图26A-26C显示了抗HER3CD4T细胞反应与新辅助化疗的复发和反应相关，但与淋巴结转移无关。图26Α是四个柱状图，通过初始手术淋巴结状态下（淋巴结阳性（“LN+”或“LNpos”）与淋巴结阴性（“LN-”或“LNneg”））比较IBC患者的免疫应答，显示了累积应答没有统计学上的显着性差异上图）（分别为40、56，？=0.12，响应库第二图）（分别为0.4、0.6，ρ=0·08，响应率第三图）（分别为35·7%、54·8%，ρ=0·19或破伤风反应下图）（分别为22、29，？=0.35。图268是四个柱状图，其通过至少1年我们诊断的复发与非复发无疾病）患者比较IBC患者的免疫应答，显示了具有显着较低的累积应答上图）（分比为17、66，ρ=0.04，响应库第二图）（分比为0·0、0·6，ρ〈0·05，响应率第三图）（分比为0%、55·6%，ρ=0.01，在复发性和非复发性IBC患者之间的破伤风反应没有差异下图）（分比为27、35，ρ=0.65。图26C是四个柱状图，其通过对新辅助化疗病理完全缓解（“pCR”）对残留疾病（“〈PCR”））的响应比较IBC患者的免疫应答。在接受新辅助化疗的患者中，与那些具有〈pCR的患者相比，具有?〇?的患者显示出显着更高的累积应答上图）（分别为144、32，？=0.004，响应库第二图）（分别为〇.8、0.4，？=0.05，在?0?和〈?0?患者免疫应答之间响应率第三图）分别为80.0%、27.3%，？=0.10或破伤风反应下图）（分别为17、59，？=0.15没有差异。[0036]图27A-27D显示在绝经后HDBD中抗HER3CD4T细胞应答显着升高，但是不随年龄、种族或妊娠史而不同。图27A是四个柱状图，其通过年龄〈50岁和50岁）比较HD患者的免疫应答。累积应答（上图）（分别为77、103，？=0.25，响应库（第二图）（分别为0.8、1.1，？=0.38，响应率第三图）（分别为72.0、75.0%，p=1.0或破伤风反应下图）（分别为39、30，P=O.40没有统计学上的显著性差异。图27B是四个柱状图，通过种族高加索人、非洲裔美国人与其他人比较HD患者的免疫应答。累积应答上图）（分别为87、83、95，？=0.96，响应库（第二图）（分别为〇.9、0.7、1.4，？=0.31，响应率（分别为69.0%、71.4%、100%，？=0.35或破伤风反应下图）（分别为33、51、26，？=0.30没有统计学上的显著性差异。图27〇是四个柱状图，通过妊娠史胎次〇个妊娠、1个或更多个妊娠）比较HD患者的免疫应答。累积应答上图）（分别为82、91，？=0.71，响应库第二图）（分别为1.0、0.9，？=0.62或响应率第三图）（分别为76.5%、70.8%，p=0.74在妊娠史中没有统计学上的显着性差异。感兴趣的是，与具有至少一个妊娠的相比，未经产女性的破伤风反应下图）显着更高分别为47、27，p=0.04。图27D是四个柱状图，通过绝经状态绝经前与绝经后）比较HD患者的免疫应答。与绝经前HDBD相比，绝经后HDBD显示出显着更高的累积应答上图）（分别为每百万个细胞136、70个，p=0.005和响应库第二图）（分别为1.4肽、0.8肽，p=0.03。绝经后和绝经前HDsBDs的响应率第三图）（分别为90.9%、66.7%，p=0.23或破伤风反应（下图）分别为38、28，p=0.37没有差异。[0037]图28是ELISpot线性测定图。通过操作者，ELISpot测定法确定为线性和精确的，该操作者通过将已知的抗HER3CD4T细胞应答的系列稀释到培养基中进行本研究的所有测定。累积应答遵循线性回归曲线，该曲线来自稀释度1.〇、〇.1、〇.〇1、〇.〇〇1每百万细胞分别为230、35、12、5个点，口〈0.0001，¥=0.88。[0038]发明详述[0039]本实施方式提供了HER家族蛋白质的分离肽以及其它受体酪氨酸激酶。在一个实施方案中，提供了HERl、HER3和c-MET蛋白中的一种或多种的分离肽。在一个实施方案中，肽代表HERl的表位。在一个实施方案中，肽代表HER3的表位。在一个实施方案中，肽代表c-MET的表位。[0040]在一些实施方案中，蛋白质的相应HER家族的表位以及其他受体酪氨酸激酶是免疫原性的。本实施方式另外提供了包含一种或多种本实施方式的肽的组合物。在一个实施方案中，提供了嵌合肽，其中所述嵌合肽包含一种或多种本实施方式的肽。[0041]在一个实施方案中包括包含多价肽的组合物。多价肽包括两种或更多种本发明的肽。[0042]另外提供了刺激免疫应答的方法和治疗受试者中的癌症的方法。还提供了用于治疗和预防疾病用途的疫苗。如本文所述的，本实施方式的肽能够单独的或包含在嵌合肽中引发免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答是体液应答。在另一个实施方案中，免疫应答是细胞介导的应答。根据一些实施方案，本发明的肽提供保护作用。[0043]在另一个实施方案中，HER3表达可以用作胃食管结合部癌前病变中肿瘤进展的标志物。[0044]在另一个实施方案中，由包括使用HER3MHCII类免疫原性肽来确定抗HER3⑶4Thl的丧失。[0045][0046]ϋ另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本发明所述相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实验或测试，仍将优选的方法和材料进行了描述。[0047]通常，本发明使用的术语和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验步骤是本领域中公知并且常用的那些。[0048]标准技术用于合成核酸和肽。技术和步骤通常按照本领域中的常规方法和本文献通篇提供的各种一般性参考文献进行的（例如SambrookandRussell，2012,MolecularCloning，ALaboratoryApproach，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，和Ausubel等，2012，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileySons，NYο[0049]本发明使用的术语和下文所述的分析化学和有机合成中采用的实验方法是本领域中公知且常用的那些。标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。[0050]正如本发明所使用的，以下每个术语的含义与其在本章节中的含义相关联。[0051]本发明使用的冠词“一种”是指冠词语法对象的一个或多于一个（即至少一个）。例如“一种元件”是指一个元件或多于一个元件。[0052]当涉及可测量的值例如数量、持续时间等时，本发明所用的“约”是指包括定值±20%，或±10%，或±5%，或±1%，或±0.1%的变化，因为这些变化适于实施所公开的方法。[0053]当术语“异常”用在生物体、组织、细胞或其组分的上下文中时，是指那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一种可观察或可检测的特征例如年龄、治疗、时间等）中不同于那些显示正常期望的）的各自特征的生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型来说是正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。[0054]如本发明所用的用于乳腺癌的“辅助治疗”是指在主要治疗（即手术后给予的任何治疗，以增加长期存活的机会。“新辅助或新-辅助疗法”是在主要治疗之前给予的治疗。[0055]本发明所用的术语“抗原”或“ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者都包括。本领域技术人员应理解，任何大分子，实际上包括所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。本领域技术人员应理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的部分核苷酸序列或核苷酸序列的任何DNA编码如本发明所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员应理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列进行不同的组合以引发所需的免疫应答。而且，本领域技术人员应理解，抗原不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生的或可以衍生自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。[0056]“抗原呈递细胞”（APC是能够激活T细胞的细胞，其包括但不限于单核细胞巨噬细胞、B细胞和树突状细胞DC。[0057]“抗原负载的APC”或“抗原脉冲的APC”包括已暴露于抗原并被抗原活化的APCt^U如，APC可以在体外例如在有抗原存在的培养期间）负载AgJPC也可以通过暴露于抗原而在体内被负载。“抗原负载的APC”通常以两种方式之一制备：（1称为抗原肽的小肽片段直接“脉冲”到APCs的外部;或2APC与完全蛋白质或蛋白质颗粒孵育，然后完全蛋白质或蛋白质颗粒由APC摄取。这些蛋白质通过APC被消化成小的肽片段，并且最终被运输并呈递在APC表面上。此外，还可以通过将编码抗原的多核苷酸导入细胞中来产生负载抗原的APC。[0058]“抗HER3应答”、“抗HER3CD4Thl应答”、“抗HER3CD4T细胞应答”等是指特异性针对HER3蛋白的免疫应答。[0059]本发明使用的术语“抗肿瘤效应”是指一种生物效应，其可以通过肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加或改善与癌性病症相关的各种生理症状来证实。“抗肿瘤效应”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体的首先预防肿瘤发生的能力来证实。[0060]本发明使用的术语“自身免疫性疾病”定义为由自身免疫应答引起的失调。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于艾迪森疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩氏病、糖尿病I型）、营养不良性大疱性表皮松解、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病综合征、吉兰-巴雷综合症、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃肠性结肠炎等。[0061]如本发明使用的术语“自体的”意指来源于相同个体的任何材料，其随后将被重新引入个体中。[0062]本发明使用的术语“B细胞”定义为源自骨髓和或脾的细胞。B细胞可以发展成产生抗体的浆细胞。[0063]本发明使用的术语“癌症”定义为细胞的过度增殖，其具有独特性状-丧失正常控制-导致不受控制的生长，缺乏分化，局部组织侵入和或转移。实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、生殖细胞肿瘤和类似病症。[0064]“CD4+Thl细胞”、“Thl细胞”、“CD4+T辅助型1细胞”、“CD4+T细胞”等被定义为表达表面蛋白⑶4和产生高水平的细胞因子IFN-γ的T辅助细胞的一种亚型。也参见，“T辅助细胞”。[0065]“累积应答”是指患者组的组合免疫应答，表示为来自给定患者组的所有MHCII类结合肽的反应点的总和来自IFN-γELISpot分析的每IO6个细胞的点形成细胞“SFC”）。[0066]“DC疫苗接种”、“DC免疫”、“DC1免疫”等是指使用自体树突状细胞来管理免疫系统识别特定分子并针对它们产生特异性应答的策略。[0067]术语“树突状细胞”或“DC”是一种抗原呈递细胞，其存在于体内、体外、离体或在宿主或受试者中，或其可源自造血干细胞或单核细胞。树突状细胞及其前体可以从多种淋巴器官例如脾、淋巴结以及骨髓和外周血中分离。树突状细胞具有薄片薄片状伪足）的特征形态，该薄片在多个方向上远离树突状细胞体延伸。通常，树突状细胞表达高水平的MHC和共刺激分子例如B7-1和B7-2。树突状细胞可在体外诱导T细胞的抗原特异性分化，并能以发起在体外和体内初级T细胞应答。在疫苗生产的环境中，“活化的DC”是已经暴露于Toll样受体激动剂例如脂多糖“LPS”的DC。活化的DC可以或可不负载有抗原。[0068]“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且如果疾病没有改善，则动物的健康会继续恶化。[0069]动物中的“失调”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是动物的健康状况不如没有失调时那样良好。未经治疗，失调不一定引起动物健康状态的进一步降低。[0070]如果患者经历的疾病或失调的至少一种体征或症状的严重性或频率降低，则疾病或失调是“减轻”的。[0071]“有效量”或“治疗有效量”在本发明中可互换使用，并且是指如本发明所述的有效实现特定生物学结果的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于通过本领域任何合适的方法测定的病毒感染的抑制。[0072]如本发明所用，术语“内源的”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内的任何材料。[0073]如本发明所用，术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。[0074]“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFRErbBl，HER1，HER2ErbB2，HER3ErbB3和HER4ErbB4受体。HER受体通常包含：胞外结构域，其可以结合HER配体和或与另一个HER受体分子二聚化;亲脂性跨膜结构域;保守的细胞内酪氨酸激酶结构域;和具有可被磷酸化的几个酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。优选地，HER受体是天然序列人类HER受体。[0075]“HER途径”是指由HER受体家族介导的信号传导网络。[0076]“HER激活”是指任何一种或多种HER受体的激活或磷酸化。通常，HER活化导致信号转导例如其由HER受体的细胞内激酶结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基导致的）C=HER激活可以通过HER配体与包含目标HER受体的HER二聚体结合来介导。HER配体与HER二聚体的结合可激活二聚体中一个或多个HER受体的激酶结构域，从而导致一个或多个HER受体中的酪氨酸残基的磷酸化和或另外的底物多肽中的酪氨酸残基的磷酸化，例如Akt或MPK细胞内激酶。[0077]“册1?2”是人表皮生长因子受体（16?1〇家族的成员。册1?2在约20-25%的人乳腺癌中过表达，并在许多其它癌症中表达。[0078]“HER2P°S”是一种乳腺癌以及许多其他类型的癌症的分类或分子亚型。HER2阳性目前通过FISH荧光原位杂交测定的基因扩增和病理染色的强度2+或3+进行定义。[0079]“HER2neg”通过FISH测定的基因扩增的缺乏进行定义，并且在大多数情况下可以包括0至2+的病理染色范围。[0080]“HER3”和“ErbB3”是指所公开的受体多肽，例如，美国专利号5，183，884和5，480，968以及Kraus等人PNASUSA86:9193-91971989。[0081]“HER3胞外结构域”或“HER3ECD”是指位于细胞外部的HER3结构域，其锚定于细胞膜或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER3的细胞外结构域可以包含四个结构域:结构域I、结构域Π、结构域III和结构域IV。在一个实施方案中，HER3ECD包含氨基酸1-636编号包括信号肽）。在一个实施方案中，HER3结构域III包含氨基酸328-532编号包括信号肽）。[0082]如本发明所用的“HER3免疫原性肽”、“HER3结合肽”、“HER3表位”等是指衍生自或基于HER3蛋白，特别是HER3ECD的序列及其等同物的MHCII类肽。HER3肽可以激活许多患者的CD4T细胞。所述肽可用于脉冲树突状细胞并教导T细胞识别HERSt3HERS在三阴性乳腺癌中表达，并且可以在ERpcis乳腺癌中赋予针对抗-雌激素的抗性。HER3也在其它癌症中表达，包括黑素瘤、肺癌、结肠癌、前列腺癌和转移性脑肿瘤。根据优选的实施方案，如下鉴定了四种HER3免疫原性肽表位或结合肽：[0087]本发明所用的“同源”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列相似性。当两个分子两者中的亚基位置被相同的单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每一个DNA的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是完全或100%同源的。两个序列之间的同源性百分比是匹配或同源位置数目的直接函数，例如，如果两个化合物序列中位置的一半例如，聚合物长度上的十个亚基中的五个位置是同源的，则两个序列是50%相同，如果90%的位置，例如10个中的9个匹配或同源，则两个序列具有90%的同源性。例如，DNA序列5’ATTGCC3’和5’TATGGC3’具有50%的同源性。[0088]此外，当本发明使用术语“同源性”或“同一性”来指核酸和蛋白质时，应将其解释为应用于核酸和氨基酸序列水平的同源性或同一性。[0089]术语“过度增殖性疾病”定义为由细胞过度增殖引起的疾病。示例性的过度增殖性疾病包括但不限于癌症或自身免疫性疾病。其它过度增殖性疾病可包括例如血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化或炎性肠病。[0090]如本发明所用“教材”包括可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其它表达介质。本发明试剂盒的教材可以是如粘附到含有本发明的核酸、肽和或组合物的容器中，或者与含有核酸、肽和或组合物的容器一起运输。或者，教材可以与容器分开装运，目的是接受者协同使用教材和化合物。[0091]如本发明所用的“免疫应答”是指响应于抗原引入的宿主免疫系统的激活，如哺乳动物的免疫系统的激活。免疫应答可以是细胞或体液应答的形式，或两者兼有。[0092]“分离的”是指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。[0093]本发明所用术语“调节”是指与未接受治疗或未使用化合物的受试者中的应答水平相比，和或与在其它方面相同但未经治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中应答水平的可检测的增加或降低。该术语包括干扰和或影响天然信号或应答，从而在受试者，优选人类中介导有益的治疗反应。[0094]通过分析每个受试者组的抗HER3⑶4+Thl免疫应答来定义⑶4+Thl应答的“度量”或“免疫应答的度量”：（a总抗HER3响应性表示为对多1种免疫原性肽响应的受试者的百分比）；（b响应库表示为每个受试组识别的免疫原性肽的平均数η;和c累积应答表示为来自每个受试组的4个MHCII类HER3免疫原性肽的反应点（来自IFN-γELISpot分析的每IO6个细胞的点形成细胞“SFC”）的总和）。[0095]如本发明所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然和合成的修饰或组合。[0096]如本发明所用，“群体”包括提及包括同质、基本上同质或异质细胞培养物的分离培养物。通常，“群体”也可以被认为是“分离的”细胞培养物。[0097]受体酪氨酸激酶（“RTK”）是许多多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体。RTK的人EGF受体（“HER”）家族调节多种生物过程，包括细胞增殖、迀移、侵袭和存活。家族由四个成员HERlErbBl、HER2neu或ErbB2、HER3ErbB3和HER4ErbB4组成。[0098]如本发明所用，“重组细胞”是包含重组多核苷酸的宿主细胞。[0099]“响应率”或“抗HER3应答率”在本发明中可互换使用，意指响应4种HER3免疫原性肽中至少1种的受试者的百分比。[0100]“响应库”定义为每个受试者组识别的HER3免疫原性肽的平均数（“η”）。[0101]如本发明所用的“样品”或“生物样品”是指来自受试者的生物材料，包括但不限于器官、组织、外来体、血液、血浆、唾液、尿液和其他体液。样品可以是从受试者获得的任何来源的材料。[0102]如本发明所用的“信号Γ通常是指从激活的DC传递到T细胞的第一生化信号。信号1由在DC表面表达的抗原提供，并通过T细胞受体由T细胞感测。[0103]如本发明所用的“信号2”通常是指由DC提供到T细胞的第二信号。信号2由激活的DC上的“共刺激”分子提供，通常是⑶80和或⑶86虽然已知有其他共刺激分子），并且通过表面受体CD28由T细胞感测。[0104]如本发明所用的“信号3”通常是指由激活的DC产生的可溶性蛋白质通常为细胞因子产生的信号。这些信号通过T淋巴细胞上的受体来感测。第三个信号指示T细胞应该获得哪些表型或功能特征以最好地处理当前的威胁。[0105]本发明所用的术语“特异性结合”是指分子，例如抗体识别并结合另一种分子或特征，但基本上不识别或结合样品中的其他分子或特征。[0106]术语“受试者”、“患者”、“个体”等在本发明中可互换使用，并且指可适用于本发明所述方法的任何动物或其无论是体外还是原位的细胞。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。[0107]本发明使用的术语“靶向治疗”是指使用药物或其他物质的癌症治疗，其干扰参与癌细胞生长的特定靶分子，但通常对正常细胞几乎没有损害从而实现抗肿瘤效果。相比之下，传统的细胞毒性化疗药物作用于所有活跃分裂的细胞。在乳腺癌治疗单克隆抗体中，特别是曲妥珠单抗HERCEPTIN寬HER2neu受体为靶向。[0108]本发明使用的术语“T细胞”定义为参与多种细胞介导的免疫反应的胸腺衍生的细胞。[0109]本发明关于细胞使用的术语“T辅助”指本领域技术人员可识别的包括不同细胞类型的淋巴细胞（白血细胞或白血球的亚组。特别地，根据本发明公开的T辅助细胞包括效应Th细胞例如Thl、Th2和Thl7。这些Th细胞分泌可刺激其他白细胞或与其他白细胞相互作用的细胞因子、蛋白质或肽。[0110]本发明中关于细胞使用的术语“T辅助细胞”、“辅助T细胞”、“Th细胞”等表示本领域技术人员可识别的包括不同细胞类型的淋巴细胞（白血细胞或白血球的亚组。特别地，T辅助细胞是效应T细胞，其主要功能是促进其他B和T淋巴细胞和或巨噬细胞的活化和功能。辅助T细胞分化为称为“Thl”或“1型”和“Th2”或“2型”表型的两种主要亚型。这些Th细胞分泌细胞因子、蛋白质或肽，该细胞因子、蛋白质或肽可刺激其他白细胞或与其他白细胞相互作用。[0111]如本发明所用的“Thl细胞”、“CD4+Thl细胞”、“CD4+T辅助1型细胞”、“CD4+T细胞”等是指表达表面糖蛋白CD4的成熟T细胞。当抗原呈递细胞（“APC”）例如树突状细胞的表面上表达的MHCII类分子向⑶4+T辅助细胞呈递肽抗原时，CD4+T辅助细胞被激活。当通过MHC-抗原复合物激活CD4+T辅助细胞时，其分泌高水平的细胞因子例如干扰素-γ“IFN-γ”）。这样的细胞对于存在于宿主细胞内的某些引起疾病的微生物被认为是高度有效的，并且对人类癌症中对抗宿主细胞内生活的某些致病微生物以及癌症的抗肿瘤反应是至关重要的。[0112]如本发明所用的“Thl7T细胞”是指产生高水平的细胞因子IL-17和IL-22并被认为对于在粘膜表面上存活的致病微生物是高度有效的T细胞，。[0113]“治疗有效量”是本发明化合物的量，其当施用于患者时改善疾病的症状。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量根据化合物、疾病状态及其严重性、待治疗患者的年龄等而变化。治疗有效量可以由本领域普通技术人员考虑到他自己的知识和本公开内容来常规地确定。[0114]术语“治疗”是指本发明所述的治疗或预防措施。“治疗”方法是对需要这种治疗的受试者施用本发明的组合物，例如患有疾病或失调的受试者，或最终可能获得这样的疾病或失调的受试者，为了预防、治愈、延迟、降低严重性或改善失调或复发失调的一种或多种症状，或者为了延长受试者的存活使其超过在没有这种治疗的情况下预期的存活时间。[0115]“三阴性”和“TN”乳腺癌是指任何对雌激素受体（卞1〇、孕酮受体（“?1〇和!^2测试为阴性的乳腺癌细胞。[0116]本发明使用的术语“疫苗”定义为一种施用给动物后引发免疫应答的材料，其中动物优选哺乳动物，更优选人类。在引入受试者后，疫苗能够引发免疫应答，包括但不限于抗体、细胞因子的产生和或其他细胞应答。[0117]“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代，氨基酸序列发生变化但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以指具有与参照蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质，参照蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质例如亲水性，带电区域的程度和分布的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中被认为通常涉及微小的改变。这些微小的变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域所理解的（Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-1321982。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，相似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可以用于揭示将导致蛋白质保留生物学功能的取代。考虑肽中的氨基酸的亲水性，其允许计算该肽的最大局部平均亲水性，美国专利US4,554,101已报道的有用量度与抗原性和免疫原性良好地相关，其全部内容通过引用并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致肽保留生物活性，例如免疫原性，如本领域所知。可用亲水性值彼此在±2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察结果一致，与生物功能相符合的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性能所显示的。[0118]范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以用范围形式呈现。应当理解，范围表格的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6，且无论被描述的范围的宽度如何，这种解释都适用。[0119]发明详述[0120]本实施方式提供了包含HER家族蛋白的肽以及其它受体酪氨酸激酶的免疫组合物。在一个实施方案中，本发明提供了一种或多种HER-l、HER-3和c-MET蛋白中的分离的肽。在一个实施方案中，本发明的肽可用于引发免疫应答。包含本发明的肽的组合物可用作初始保护的预防性治疗剂，以及可用作治疗正在进行的情况的治疗剂。[0121]本发明还提供了用于治疗或预防癌症的方法。这样的方法包括向有需要的受试者施用本发明的肽或肽的组合的步骤。施用这种肽导致抗肿瘤免疫的诱导。因此，本发明提供了在受试者中诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的肽或肽组合以及药物组合物和由其衍生的细胞组合物的步骤。[0122]本发明包括在哺乳动物中诱导T细胞应答的方法。该方法包括施用特异性诱导T细胞增殖的抗原呈递细胞APC。在一个实施方案中，方法包括施用已采用本发明的肽脉冲过的树突状细胞疫苗，从而特异性诱导针对对应于所述肽的抗原的T细胞增殖。[0123]在一个实施方案中，用本发明的肽脉冲的APC可用于培养扩增T细胞。使用APC扩增T细胞，一旦获得足够数量的抗原特异性T细胞以，就将如此获得的抗原特异性T细胞给予哺乳动物，从而在哺乳动物中诱导抗原特异性T细胞应答。[0124]本发明包括激活的DC的制备。在一个实施方案中，DC制剂的纯度大于90%。在另一个实施方案中，DC制剂被完全激活。例如，用DC激活方案激活DC，包括使DC与TLR激动剂（例如LPS接触进行激活。在另一个实施方案中，通过钙促动治疗与其它增强不同第三信号细胞因子的DC激活方案例如激活剂）的结合使DC活化。[0125]本发明包括通过任何DC激活方案激活的成熟的、抗原负载的DC。本发明的DC产生所需水平的细胞因子和趋化因子。在一个实施方案中，本发明提供了脉冲和激活细胞的方法，由此细胞在冷冻保存后保持活性状态。本发明的DC制剂的益处在于，来自于单次白细胞分离术从患者收集的细胞有效地冷冻保存为初始疫苗加上多个“加强”剂量例如10个或更多）的形式，在没有任何专门的细胞处理设施或进一步要求的质量控制测试的情况下，其可以根据需要在远程治疗位置解冻。[0126]本发明还涉及这些激活的DC的冷冻保存，以保留了解冻后它们在呈递抗原中以及在各种细胞因子和趋化因子的产生中的效力和功能的方式，使得冷冻保存和随后解冻的激活的DC与新鲜收获和激活的DC—样具有临床有效性。[0127]如本发明所预期的，本发明提供了一种用于产生和冷冻保存在产生对T细胞更强信号的方面具有优异功能的DC的方法，并因此产生更有效的基于DC的疫苗。通过有效冷冻保存这样的细胞，可以储存和解冻样品用于以后使用，从而减少在疫苗生产期间重复分离和淘析过程的需要。能够冷冻DC，然后将其在后期解冻是一个优点，因为这意味着单轮疫苗生产可以分成小部分，冷冻离开，然后在数星期、数月、数年的疗程内一次一个地给予患者，以给予加强免疫的“加强”疫苗接种。[0128]本实施方案还包括采用HER3表达作为胃食管结合部也称为Barrett食管）的癌前病变中肿瘤进展的标志物的用途。该标志物在浸润性胃食管癌中具有预后和治疗用途。[0129]组合物[0130]本发明提供了HER家族蛋白质的分离肽以及其它受体酪氨酸激酶。在一个实施方案中，本发明提供了HER-l、HER-3和c-MET蛋白中的一种或多种的分离肽。在一个实施方案中，本发明的肽代表相应的HER或c-MET蛋白的表位。在一些实施方案中，相应的HER或c-MET蛋白的表位是免疫原性的。[0131]本发明提供了包含一种或多种本发明的肽的组合物。本发明还提供了包含一种或多种嵌合肽的组合物。在一个实施方案中，嵌合肽包括相应的HER或c-MET蛋白的一个或多个表位。[0132]另外，本发明提供了具有一种或多种多价肽的组合物。这些多价肽包括两个或多个本发明的表位。[0133]本发明包括使用本发明的组合物在受试者中刺激免疫应答的方法和治疗癌症的方法，还提供了用于治疗和预防用途的疫苗。本发明的表位能够单独地或如本文所述的包含在嵌合肽中引起免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答是体液应答。在另一个实施方案中，免疫应答是细胞介导的应答。根据一些实施方案，本发明的表位或肽提供保护作用。[0134]在一个实施方案中，本发明的HER-3表位或其它肽包括：[0142]本发明的HER-3肽或任何肽可以是环化的或线性的。当环化时，表位可以以任何合适的方式环化。例如，可以在选择的半胱氨酸Cys对之间形成二硫键，以提供期望的确认。据信，环化表位的形成可以提供改善体液应答的构象，从而提高保护效果。[0143]由SEQIDNO:4定义的HER-3表位代表HER-3蛋白的位置56-70。由SEQIDNO:5定义的HER-3表位代表HER-3蛋白的位置401-415。由SEQIDN0:6定义的HER-3表位代表HER-3蛋白的位置416-430。由SEQIDNO:7定义的HER-3表位代表HER-3蛋白的位置451-465。[0144]如本发明所述，本发明的HER-3表位还包括肽，其为由SEQIDNOs定义的肽的功能等同物。这种功能等同物具有改变的序列，其中相应的HER-3表位序列中的一个或多个氨基酸被取代，或其中一个或多个氨基酸从相应的参考序列缺失或添加到相应的参考序列。例如，可以向氨基末端、羧基末端或两者添加1至3个氨基酸。在一些实例中，HER-3表位是糖基化的。[0145]在其它实例中，HER-3表位可以是HER-3表位的逆向-反转式异构体。逆向-反转修饰包括肽主链内所有酰胺键的逆转。这种逆转可以通过逆转序列的方向并通过使用D-氨基酸而不是L-氨基酸翻转每个氨基酸残基的手性来实现。这种逆向-反转式异构体形式可以保留至少一些肽键的平面性和构象限制。[0146]可以进行非保守氨基酸取代和或保守取代。当取代的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸具有相似的结构或化学性质时，取代是保守的氨基酸取代。举例来说，保守氨基酸取代包括用另一个取代一个脂肪族或疏水性氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；用另一个取代一个含羟基的氨基酸，例如丝氨酸和苏氨酸；用另一个取代一个酸性残基，例如谷氨酸或天冬氨酸；用另一个取代一个含酰胺残基，例如天冬酰胺和谷氨酰胺；用另一个取代一个芳族残基，例如苯丙氨酸和酪氨酸；用另一个取代一个碱性残基，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸;和用另一个取代一个小氨基酸，例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸。[0147]在一些实例中，缺失和添加位于本发明的肽的序列之一的氨基末端、羧基末端或两者。例如，HER-3表位等价物与相应的HER-3表位序列具有至少70%同一性，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性。每个参考序列的10个氨基酸至少90%相同的序列具有不超过1个改变，即任何缺失、添加或取代的组合。通过使用本领域已知或开发的程序将变体的氨基酸序列与参考序列进行比较来确定同一性百分比。[0148]功能等同物比相应的HER-3表位序列更长，功能等同物可以具有与野生型HER-3蛋白中HER-3表位序列和位于HER-3表位序列侧翼的序列至少90%相同的序列。[0149]HER-3表位的功能等同物可以通过修饰表位的序列，然后测定所得多肽刺激免疫应答的能力，例如抗体的产生来鉴定。这样的抗体可以在多种体液包括血清和腹水中发现。简而言之，从温血动物例如人分离体液样品，对于其需要确定是否存在对HER-3多肽特异的抗体。在足以允许在多肽和蛋白质特异性抗体之间形成免疫复合物的条件和时间下，将体液与HER-3多肽培养，然后优选使用ELISA技术进行测定。[0150]根据本发明的其它实施方案，提供了嵌合肽和包含一个或多个嵌合肽的组合物。根据各种实施方案，嵌合肽包含HER-3表位、另一表位以及将HER-3表位与另一表位连接的接头。在一个实施方案中，其它表位可以包括但不限于另一个HER-3表位、HER-I表位、HER-2表位和c-Met表位。还应当理解，可以使用任何合适的接头。例如，根据所使用的表位，HER-3表位可以连接到另一表位的氨基或羧基末端。其它表位的位置和选择取决于HER-3表位的结构特征，无论是α螺旋或β转角或链。[0151]在一个实施方案中，接头可以是长度为约2至约15个氨基酸，约2至约10个氨基酸或约2至约6个氨基酸的肽。嵌合肽可以是线性的或环化的。另外，HER-3表位、其它表位和或接头可以是逆向-反转形式。因此，HER-3表位可以是逆向-反转形式。或者，HER-3表位和其他表位可以是逆向-反转形式。在另一个实例中，HER-3表位、其他表位和接头可以是逆向-反转形式。[0152]在另一个实施方案中，本发明的肽可以以在混合物中的形式而不是嵌合肽的形式。在任何情况下，包含肽的本发明的组合物可以是用于脉冲抗原呈递细胞例如树突状细胞）以产生细胞疫苗的有用试剂。在另一个实施方案中，包含肽的本发明的组合物可以是用于诱导抗体产生的有用的免疫原。本发明的组合物还可用于免疫受试者并延缓或预防肿瘤发展。本发明的组合物可以用于疫苗中以提供保护效果。[0153]根据本发明的另外实施方案，提供了包含两种或更多种本发明的肽或嵌合肽的混合物的组合物。在一些实例中，两种或更多种嵌合肽中的每一种的HER-3表位是不同的。在其它实例中，HER-3表位之一选自SEQIDNOs:1-7。[0154]本发明的肽，包括嵌合肽，可以使用熟知的技术制备。例如，可以使用重组DNA技术或化学合成，合成制备肽。本发明的肽可以单独合成或作为由两个或更多个肽组成的更长的多肽合成。本发明的肽优选是分离的，即基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白及其片段。[0155]本发明的肽和嵌合肽可以使用市售的肽合成仪合成。例如，Kaumaya等人在“DeNovo”EngineeringofPeptideImmunogenicandAntigenicDeterminantsasPotentialVaccines，inPeptides,Design，SynthesisandBiologicalActivity1994，第133-164页”中描述的化学方法可以使用，其通过引用将其并入本文。例如，HER-3表位可以与另一表位共线性合成以形成嵌合肽。肽合成可以使用Fmoct-But化学进行。肽和嵌合肽可以以任何合适的方式环化。例如，可以使用差异保护的半胱氨酸残基、碘氧化、加水以促进Acm基团的去除和伴随形成二硫键和或甲娃烧基氣-亚讽方法来获得二硫键。[0156]肽和嵌合肽也可以使用无细胞翻译系统和衍生自编码表位或肽的DNA构建体的RNA分子产生。或者，表位或嵌合肽通过用表达载体转染宿主细胞，然后诱导多肽在宿主细胞中表达来制备，此表达载体包含编码相应表位或嵌合肽的DNA序列。对于重组产生，通过常规方法将包含编码表位、嵌合肽或其变体的一个或多个序列的重组构建体引入宿主细胞，所述常规方法例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、刮擦、弹道引入或感染。[0157]本发明的肽可以含有修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化；只要所述修饰不破坏肽的生物活性即可。其它修饰包括掺入D-氨基酸或其他可用于例如增加肽的血清半衰期的氨基酸模拟物。[0158]本发明的肽可以作为组合制备，其包括两种或更多种本发明的肽，用作用于疾病的疫苗，例如，癌症。肽可以在混合物中或可以使用标准技术彼此缀合。例如，肽可以单个多肽序列进行表达。组合中的肽可以相同或不同。[0159]本发明还应当解释为包括本发明的肽或编码其的DNA的“突变体”、“衍生物”和“变体”，其中突变体、衍生物和变体是在一个或多个更多的氨基酸或当提及编码其的核苷酸序列时，在一个或多个碱基对中改变）中改变的肽，使得所得的肽或DNA与本文所述的序列不同，但具有与本文公开的肽具有相同的生物学性质。[0160]本发明还提供编码至少一种肽的多核苷酸，所述肽选自具有SEQIDNOs:1-7中任一个或多个序列的肽。核酸序列包括转录成RNA的DNA序列和翻译成肽的RNA序列。根据其它实施方案，本发明的多核苷酸是从本发明的肽的氨基酸序列推断的。如本领域已知的，由于冗余密码子，几个替代的多核苷酸是可能的，同时保留翻译肽的生物活性。[0161]此外，本发明包括分离的核酸，此核酸编码与本发明公开的肽具有基本同源性的肽。优选地，编码本发明的肽的分离的核酸的核苷酸序列是“基本上同源的”，即约60%同源，更优选约70%同源，甚至更优选约80%同源，更优选约90%同源，甚至更优选约95%同源，甚至更优选约99%同源于编码本发明的肽的分离的核酸的核苷酸序列。[0162]应当清楚地理解，本发明的范围包括同源物、类似物、变体、衍生物和盐，包括更短和更长的肽和多核苷酸，以及具有一个或多个氨基酸或核酸取代的肽和多核苷酸类似物，以及本领域已知的氨基酸或核酸衍生物、非天然氨基或核酸和合成氨基或核酸，规定这些修饰必须保持原始分子的生物学活性。具体地，根据本发明的原理公开了活性肽的任何活性片段以及延伸物、缀合物和混合物。[0163]本发明应解释为包括与本发明所述和所参考的核酸同源的任何和所有分离的核酸，只要这些同源DNA具有本发明公开的肽的生物活性即可。[0164]本领域技术人员将理解，本发明的核酸包括编码本发明的肽及其任何修饰形式的RNA或DNA序列，包括DNA或RNA的化学修饰，其使得核苷酸序列在其不含细胞或当其与细胞相关时更稳定。核苷酸的化学修饰也可以用于增强核苷酸序列被细胞吸收的效率或其在细胞中表达的效率。本发明涵盖核苷酸序列的任何和所有修饰组合。[0165]进一步，任何数量的程序可以用于使用本领域公知的重组DNA方法产生本发明的蛋白质的突变体、衍生物或变体形式，如于Sambrook和Russel1同上），和Ausube1等人描述的方法。通过改变编码多肽的DNA序列，在肽或多肽中引入氨基酸变化的方法是本领域公知的，并且在这些地方、其他地方和论文中也详细描述。[0166]编码本发明的肽的核酸可以掺入合适的载体中，例如，逆转录病毒载体。这些载体在本领域是公知的。含有它们的核酸或载体可有效地转移到所需细胞中，该细胞优选来自患者。有利地，本发明提供了一种现成的组合物，其允许快速修改患者自身的细胞或另一种哺乳动物的细胞以快速和容易地产生具有优异的癌细胞杀伤性质的修饰细胞。[0167]雛[0168]在其它相关方面，本发明包括编码一种或多种具有选自SEQIDNOs:1-7组成的组中的序列的肽的分离核酸。[0169]在一个实施方案中，本发明包括编码一种或多种本发明的肽的核酸序列，其可操作地连接至包含启动子调节序列的核酸，使得核酸优选能够指导核酸编码的蛋白质的表达。因此，本发明包括用于将外源DNA引入细胞中并伴随外源DNA在细胞中表达的表达载体和方法，例如Sambrook等人（2012，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork，Ausubel等人（1997，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileySons,NewYork所述。将期望的多核苷酸惨入载体中以及载体的选择是本领域公知的，如Sambrook等人（同上和Ausubel等人（同上所述。[0170]可以将多核苷酸克隆到多种类型的载体中。然而，本发明不应被解释为限于任何特定载体。相反，本发明应当解释为包括本领域中容易获得和或公知的大量载体。例如，本发明的多核苷酸可以克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。[0171]在具体实施方案中，表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体。存在许多包含至少部分或全部上述组合物的表达载体系统。基于原核和或真核生物载体的系统可以用于本发明以产生多核苷酸或其同源多肽。许多这样的系统在商业上可广泛获得。[0172]进一步，表达载体可以以病毒载体的形式向细胞提供。病毒载体技术是本领域公知的，并且如Sambrook等人2012和在Ausubel等人（1997以及其他病毒学和分子生物学手册所述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记（参见W00196584，W00129058和美国专利号6,326,193。[0173]为了表达本发明的所需核苷酸序列，每个启动子中的至少一个模块用于定位RNA合成的起始位点。其最熟知的实例是TATA盒，但是在缺少TATA盒的一些启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40基因的启动子，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始位置。[0174]另外的启动子元件，即增强子，调节转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游30-1IObp的区域，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，使得当元件相对于彼此反转或移动时可保持启动子功能。在胸苷激酶启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。根据启动子，可以看出个别元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。[0175]启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然相关的启动子，如通过分离位于编码区段和或外显子上游的5’非编码序列可以获得的启动子。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与位于该序列下游或上游的多核苷酸序列天然相关的增强子。或者，通过将编码多核苷酸片段置于重组或异源启动子的控制下获得某些优点，所述启动子是指在其天然环境中通常不与多核苷酸序列相关的启动子。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与多核苷酸序列结合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和或改变表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，可以使用重组克隆和或核酸扩增技术（包括PCRTM，并结合本发明公开的组合物美国专利4，683，202，美国专利5，928，906产生序列。此外，还可以预见也可以使用控制序列，此控制序列刻指导序列在非核细胞器如线粒体、叶绿体等中转录和或表达。[0176]自然地，重要的是采用启动子和或增强子有效地指导细胞类型、细胞器和生物体中的DNA区段的表达。分子生物学领域的技术人员通常知道如何使用启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达，例如参见Sambrook等2012。所使用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和或在适当条件下用于指导引入的DNA区段的高水平表达是有用，例如有利于大规模生产重组蛋白和或肽。启动子可以是异源或内源的。[0177]本发明提供的实验实施例中示例的启动子序列是立即早期巨细胞病毒CMV启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒MMTV、人免疫缺陷病毒HIV长末端重复序列LTR启动子、MoIoney病毒启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌肉肌酸启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。在本发明中使用诱导型启动子提供了能够启动多核苷酸序列表达的分子开关，当期望这种表达时，它可操作地连接，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。此外，本发明包括组织特异性启动子的使用，该启动子仅在所需组织中有活性。[0178]为了评估编码本发明的肽的核苷酸序列的表达，待导入细胞中的表达载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或两者，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他实施方案中，可选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因两者可以与调节序列适当侧接，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记是本领域已知的，并且包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。[0179]报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调节序列的功能。编码易于测定的蛋白质的报道基因是本领域熟知的。通常，报道基因是不存在于受体生物体或组织中或由受体生物体或组织表达的基因，并且编码蛋白质，此蛋白质的表达通过一些容易检测的性质（例如酶活性表现。报道基因的表达是在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定的。[0180]合适的报道基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因（参见例如Ui-Tei等人，2000FEBSLett.479:79-82。合适的表达系统是公知的，并且可以使用熟知的技术制备或商业获得。内部缺失构建体可以使用独特的内部限制性位点或通过非唯一性限制性位点的部分消化产生。然后可将构建体转染到显示高水平的siRNA多核苷酸和或多肽表达的细胞中。通常，具有最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子，此最小5’侧翼区显示报道基因的最高水平表达。这样的启动子区域可以连接到报告基因并用于评估调节启动子驱动的转录能力的试剂。[0181]鍾[0182]Ϊ=个实施方案中，本发明涉及包含本发明的肽的疫苗。本发明的疫苗可以提供特定肽的任何组合，所述特定肽是用于特定预防或治疗需要治疗的受试者中的癌症的。[0183]本发明的疫苗可以诱导抗原特异性T细胞和或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达抗原的癌症或肿瘤的或对表达抗原的癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引起的细胞免疫应答可以包括干扰素-γIFN-γ和或肿瘤坏死因子aTNF-a的诱导或分泌。[0184]在一个实施方案中，本发明涉及抗癌疫苗。疫苗可以包含一种或多种癌抗原。该疫苗可以预防肿瘤生长。该疫苗可以减少肿瘤生长。该疫苗可以预防肿瘤细胞的转移。取决于癌抗原，疫苗可以靶向治疗乳腺癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、血癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、复发性呼吸道乳头状瘤、肛门癌、子宫颈癌、脑癌等。[0185]在一个具体的实施方案中，疫苗可以通过诱导来介导肿瘤细胞的清除或阻止生长，诱导方式包括：（1体液免疫通过B细胞应答产生所需的抗体；（2增加细胞毒性T淋巴细胞如⑶8+CTL以攻击和杀死肿瘤细胞；（3增加T辅助细胞应答；⑷并通过IFN-γ和TFN-a或优选所有上述物质增加炎症反应。疫苗可以使无肿瘤存活增加30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%44%和45%。疫苗可以在免疫后将肿瘤质量减少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%〇[0186]与未施用疫苗的受试者中的细胞免疫应答相比，疫苗可以在施用疫苗的受试者中增加细胞免疫应答约50倍至约6000倍，约50倍至约5500倍，约50倍至约5000倍，约50倍约100倍至约6000倍，约150倍至约6000倍，约200倍至约6000倍，约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，与未施用疫苗的受试者中的细胞免疫应答相比，疫苗可以在施用疫苗的受试者中增加细胞免疫应答约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。[0187]与未施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平相比，疫苗可以在施用疫苗的受试者中增加干扰素γIFN-γ水平约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，与未施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平相比，疫苗可以使施用疫苗的受试者的IFN-γ水平增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。[0188]本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，例如安全，使得疫苗本身不引起疾病或死亡;防止疾病;诱导中和抗体;诱导保护性T细胞应答;并易于给药、副作用少、生物稳定性高和每剂量的成本低。疫苗可以通过含有如下讨论的癌抗原来实现这些特征中的一些或全部。_9]负载脉冲免疫细胞的产生[0190]本发明包括已经暴露于抗原或本发明的肽的、或用抗原或本发明的肽“脉冲”的细胞。例如，APC例如DC可以在体外加载Ag，例如通过在抗原存在下离体培养，或通过暴露于抗原体内培养。[0191]本领域技术人员还将容易理解APC可以通过将APC暴露于抗原一段时间的方式被“脉冲化”，该时间足以促进该抗原在APC表面上呈递。例如，APC可以暴露于被称为抗原肽的小肽片段形式的抗原，其直接“脉冲”至APC的外部Mehta-Damani等人，1994;或APC可以与完全蛋白质或蛋白质颗粒培养，然后通过APC摄取。这些整个蛋白被APC消化成小的肽片段，并最终携带并呈递在APC表面上Cohen等人，1994。肽形式的抗原可通过本发明所述的标准“脉冲”技术暴露于细胞。[0192]不希望受任何特定理论的束缚，外源或自身抗原形式的抗原由本发明的APC加工以保留抗原的免疫原性形式。抗原的免疫原性形式意味着通过片段化处理抗原以产生可被免疫细胞例如T细胞识别并刺激免疫细胞的抗原形式。优选地，这种外源或自身抗原是通过APC加工成肽的蛋白质。由APC产生的相关肽可以被提取和纯化以用作免疫原性组合物。由APC处理的肽也可用于诱导对由APC处理的蛋白质耐受性。[0193]负载抗原的APC，或者称为本发明的“脉冲APC”，是通过在体外或体内将APC暴露于抗原产生的。在APC在体外脉冲的情况下，可以将APC铺在培养皿上，并以足够的量和足够的时间暴露于抗原，以允许抗原结合APC。实现抗原与APC结合所需的量和时间可以通过使用本领域已知的或本文另外公开的方法来确定。本领域技术人员已知的其它方法，例如免疫测定或结合测定，可用于暴露于抗原后检测APC上抗原的存在。[0194]在本发明的另一个实施方案中，APC可以用载体转染，此载体允许APC表达特异性蛋白质。然后可以将由APC表达的蛋白质加工并呈递在细胞表面上。然后可以将转染的APC用作免疫原性组合物，以产生对由载体编码的蛋白质的免疫应答。[0195]如本文其他地方所讨论的，可以制备载体以包括特定多核苷酸，此特定多核苷酸编码和表达需要免疫原性应答的蛋白质。优选地，使用逆转录病毒载体感染细胞。更优选地，使用腺病毒载体用于感染细胞。[0196]在另一个实施方案中，载体可以通过修饰病毒载体以编码被APC上的受体识别的蛋白质或其部分来靶向APC，由此载体对APC受体的占据将启动载体的内吞作用，允许加工和呈递由病毒载体的核酸编码的抗原。由病毒递送的核酸可以原产于病毒，当在APC上表达时，其编码病毒蛋白，然后将其加工并呈递在APC的MHC受体上。[0197]如本发明所预期的，多种方法可用于将多核苷酸转染至宿主细胞中。方法包括但不限于磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔、胶体分散系统（即大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体）。这些方法在本领域中是已知的，并且在公开的文献中描述，以使得本领域技术人员能够执行这些方法。[0198]在另一个实施方案中，编码抗原的多核苷酸可以克隆到表达载体中，并且可以将载体引入APC中，否则产生负载的APC。将各种类型的载体和将核酸引入细胞的方法在可获得的公开文献中进行了讨论。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。参见，例如，Sambrook等（2012，MolecularCloning:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork和Ausubel等（1997，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileySons，NewYork。引入包含编码抗原的多核苷酸的表达载体产生脉冲细胞是容易理解的。[0199]本发明包括用于脉冲APC的各种方法，包括但不限于用蛋白质、cDNA或mRNA形式的完整抗原来负载APC。然而，本发明不应被解释为限于用于脉冲APC的抗原的特定形式。相反，本发明包括本领域已知的用于产生负载抗原的APC的其它方法。优选地，用编码限定的抗原的mRNA转染APC。可以使用合适的引物和与转录反应偶联的逆转录酶-聚合酶链反应RT-PCR在体外快速产生对应于其序列已知的基因产物的mRNA。用mRNA转染APC提供了优于用于产生脉冲APC的其它抗原负载技术的优点。例如，从微量组织（S卩肿瘤组织扩增RNA的能力将APC的使用扩展到大量患者的疫苗接种中。[0200]对于可用作疫苗的抗原组合物，抗原组合物必须在细胞、组织或哺乳动物（例如人）中诱导针对抗原的免疫应答。如本发明所用，“免疫组合物”可包含抗原（例如肽或多肽）、编码抗原例如抗原表达载体的核酸或表达或呈递抗原或细胞组分的细胞。在具体实施方案中，抗原组合物包含或编码本发明所述的任何抗原的全部或部分或其免疫功能等价物。在其它实施方案中，抗原组合物处于包含另外的免疫刺激剂或编码此类试剂的核酸的混合物中。免疫刺激剂包括但不限于额外的抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其它实施方案中，一种或多种另外的试剂以任何组合与抗原或免疫刺激剂共价键合。在某些实施方案中，抗原组合物缀合至或包含HLA锚定基序氨基酸。[0201]如本发明所预期的，疫苗可以在其核酸和或细胞组分的组成方面不同。在非限制性实例中，编码抗原的核酸也可以与佐剂一起配制。当然，应当理解，本发明所述的各种组合物可以进一步包含另外的组分。例如，一种或多种疫苗组分可以包含在脂质或脂质体中。在另一个非限制性实例中，疫苗可包含一种或多种佐剂。根据本发明公开的内容，本发明的疫苗及其各种组分可以通过本文公开的或本领域普通技术人员已知的任何方法制备和或施用。[0202]应当理解，本发明的抗原组合物可以通过本领域公知的方法制备，包括但不限于通过固相合成和通过HPLC从化学反应的其它产物中纯化的化学合成，或通过在体外翻译系统或活细胞中表达编码包含本发明抗原的肽或多肽的核酸序列（例如DNA序列）而产生。另夕卜，抗原组合物可以包含从生物样品中分离的细胞组分。将抗原组合物分离并广泛透析以除去一种或多种不希望的小分子量分子和或冻干以更容易地配制成所需载体。还应当理解，在疫苗组分中制备的其它氨基酸、突变、化学修饰等如果有的话优选基本上不干扰抗原识别表位序列。[0203]抗原呈递细胞治疗[0204]本发明包括产生在其表面上呈递本发明肽的APC群体例如树突状细胞;DC的方法，其可随后用于治疗。这种方法可以在已经从患者获得的细胞样品上离体进行。因此，以这种方式产生的APC可制备用于治疗或预防癌症的药剂。细胞应该被个体的免疫系统接受，因为它们来自该个体。将以这种方式产生的细胞递送至它们最初从其获得的个体，从而形成本发明的治疗实施方案。[0205]DCs源自用作抗原呈递细胞APC的多能性单核细胞。DCs在外周组织中是普遍存在的，其中它们被制备以捕获抗原。在抗原捕获后，DCs将抗原加工成小肽并移向次级淋巴器官。在淋巴器官内，DCs向天然T细胞呈递抗原肽，从而引发极化T细胞分化的信号级联。暴露后，DCs存在与MHCI类或11类结合肽结合的抗原分子，并激活CD8+或CD4+T细胞Steinman，1991，Annu·Rev·Immunol·9:271-296;Banchereau等，1998，Nature392，245-252;Steinman，等，2007,Nature449:419-426;Ginhoux等，2007，J·Exp.Med·204:3133-3146;Banerjee等，2006，Blood108:2655-2661;Sallusto等，1999，J.Exp.Med·189:611-614;Reid等，2000,Curr.Opin.Immunol·12:114-121;Bykovskaia等，1999，J.Leukoc.Biol·66:659-666;Clark等，2000，MicrobesInfect·2:257-272。[0206]DCs负责适应性免疫应答的诱导、协调和调节，并且还用于协调先天方式的效应器和免疫系统的适应方式之间的通信。这些特征使得DCs成为免疫治疗的强有力的候选者。DCs具有通过巨噬细胞增多和受体介导的胞吞作用对环境进行取样的独特能力Gerner等，2008,J.Tmmunol.181:155-164;Stoitzner等，2008,CancerTmmunol.Immunother57:1665-1673；LanzevecchiaA.,1996,Curr.Opin.Tmmunol·8:348-354;DeIamarre等，2005,Science，3075715:1630-1634。[0207]DCs还需要成熟信号以增强其抗原呈递能力。DCs通过提供额外的成熟信号例如TNF-a、CD40L或钙信号传导剂来上调表面分子例如⑶80和⑶86也称为第二信号分子）的表达（Czerniecki等，1997，.J.Immuno1·159:3823-3837;Bedrosian等，2000，J.Immunother.23:311-320;MaiIliard等，2004,CancerRes·64，5934-5937;Brossart等，1998，Blood92:4238-4247;Jin等，2004，Hum·Immunol·65:93-103。已经确定包括TNF-α、IL-li3、IL-6和前列腺素E2PGE2的细胞因子的混合物具有使DCs成熟的能力Jonuleit等，2000,Arch.Derm.Res.292:325-332JC还可以在用抗原脉冲前用钙离子载体成熟。[0208]除了病原体识别受体，如I3KR和MDA-5Kalali等，2008，J.Immunol·181:2694-2704;Nallagatla等，2008，RNABiol.53:140-144，DCs还含有一系列受体，称为Toll样受体TLR，其也能够感测来自病原体的危险。当这些TLR被触发时，在DCs中诱导一系列激活变化，这导致T细胞的成熟和信号传导（（Boullart等，2008,CancerImmunol.Immunother·57II:1589-1597;Kaisho等，2003,Curr.Mol.Med.3⑷：373-385;Pulendran等，2001，Science2935528:253-256;Napolitani等，2005，Nat·Tmmunol·6⑶：769-776AC可以激活和延长细胞介导的应答的各种臂，例如自然杀伤γ-δΤ细胞和α-βΤ细胞，并且一旦激活，DCs保持其免疫能力（Steinman，1991,Annu·Rev·Tmmunol.9:271-296;Banchereau等，1998,Nature392:245-252;Reid等，2000，Curr·Opin·Tmmunol.12:114-121;Bykovskaia等，1999,J.Leukoc.Biol.66:659_666;Clark等，2000,MicrobesInfect.2:257-272〇[0209]本发明还提供了使用本发明的一种或多种肽诱导抗原呈递细胞APC的方法。APC可以通过诱导来自外周血单核细胞的树突状细胞，然后在体外离体或体内与本发明的一种或多种肽接触刺激来诱导。当将本发明的肽施用于有需要的哺乳动物时，在哺乳动物体内诱导具有本发明的肽的APC，此肽固定于APC上。或者，在将本发明的肽固定到APC后，可以将细胞作为疫苗施用给受试者。例如，离体施用可以包括以下步骤:从哺乳动物收集APC，并使APC与本发明的肽接触。[0210]本发明还提供APC，其呈递HLA抗原与本发明的一种或多种肽之间形成的复合物。通过与本发明的肽或编码此类肽的核苷酸接触获得的APC优选来源于作为治疗和或预防的目标的受试者，并且可以作为疫苗单独或与其他药物组合施用，其他药物包括本发明的肽、外来体或T细胞。[0211]本发明提供了在上下文中的免疫治疗下刺激APC优选DCs以刺激哺乳动物中的免疫应答的组合物和方法。DCs可以通过用本发明的肽或肽的组合刺激它们被操纵，并使DCs成熟，以便它们在有需要的哺乳动物中刺激抗肿瘤免疫。[0212]在一个实施方案中，本发明包括在哺乳动物中诱导T细胞应答的方法。所述方法包括施用APC，例如DC，其中所述APC通过使APC与本发明的肽或肽组合接触被激活，从而产生负载肽的APC。[0213]在一个实施方案中，本发明涉及所产生的新的APC及其用于尤其扩增所需T细胞、激活T细胞、扩增特异性T细胞以及涉及与使用本发明的肽负载APC和肽的T细胞的扩增和刺激相关的许多治疗用途。在一些情况下，0CT4刺激的DCs可以用于扩展肽特异性T细胞。[0214]本发明涉及一种发现，其为与本发明的肽或肽组合接触的DC可用于诱导肽特异性T细胞的扩增。本领域技术人员将认识到与本发明的肽接触的DCs被认为是引发或负载肽的。本发明负载肽的DCs可用于引发针对所需抗原例如HER-3的免疫应答。因此，本发明负载肽的DCs可用于治疗与HER-3的失调表达相关的疾病。[0215]治疗疾病的方法[0216]本发明还包括治疗和或预防由病原微生物、自身免疫失调和或过度增殖性疾病引起的疾病的方法。[0217]可以通过使用本发明治疗或预防的疾病包括由病毒、细菌、酵母、寄生虫、原生动物、癌细胞等引起的疾病。本发明的药物组合物可以用作广义免疫增强剂DC激活组合物或系统），因此可用于治疗疾病。可以使用本发明的药物组合物治疗和或预防的示例性疾病包括但不限于病毒病原学的感染，例如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、EB病毒、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、乳头瘤病毒等;或细菌病原学感染，如肺炎、结核病、梅毒等;或寄生虫病原学的感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。[0218]可以使用本发明的药物组合物转导的DC、表达载体、表达构建体等治疗或预防的癌前或增生状态，包括但不限于例如结肠息肉、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳腺病变等癌前或增生状态。[0219]可以使用本发明的组合物治疗的本发明的癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞状细胞癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、胃肠癌、脑癌、膀胱癌、子宫颈癌等。[0220]可以使用本发明的DC激活系统治疗的其它过度增殖性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、癌前病变例如腺瘤性增生和前列腺上皮内瘤变）、原位癌、口腔毛状白斑或牛皮癣。[0221]可以使用本发明的组合物治疗的自身免疫性失调包括但不限于AIDS、阿狄森氏病、成人呼吸窘迫综合征、过敏、贫血、哮喘、动脉粥样硬化、支气管炎、胆囊炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、特应性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺气肿、结节性红斑、萎缩性胃炎、肾小球性肾炎、痛风、格雷夫斯病、嗜酸性粒细胞增多症、肠易激综合征、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、心肌或心包炎、骨关节炎、骨质疏松、胰腺炎、多发性肌炎、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征和自身免疫性甲状腺炎；癌症的并发症、血液透析和体外循环；病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物和蠕虫感染;和创伤。[0222]在治疗方法中，本发明组合物的给药可以是“预防性”或“治疗性”目的。当预防性地提供时，本发明的组合物在任何症状之前提供，但是在具体实施方案中，在一种或多种症状发作后提供疫苗以防止进一步症状发展或防止现有症状变得更差。组合物的预防性给药用于预防或改善任何随后的感染或疾病。当以治疗性提供时，在感染或疾病的症状发作时或之后提供药物组合物。因此，本发明可以在预期暴露于致病剂或疾病状态之前或在感染或疾病开始之后提供。[0223]组合物的有效量将是实现增强免疫应答的所选择的结果的剂量，并且这样的剂量可以由本领域技术人员作为常规事项来确定。例如，用于治疗针对癌症或病原体的免疫系统缺陷的有效量可以是引起免疫系统活化所需的剂量，导致在暴露于抗原时发生抗原特异性免疫应答。该术语也与“足够量”同义。[0224]对于任何具体应用的有效量可以根据诸如所治疗的疾病或失调、所施用的特定组合物、受试者的大小和或疾病或失调的严重性等因素而变化。本领域普通技术人员可以凭经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要过度的实验。[0225]疫苗制剂[0226]本发明还包括适用于免疫治疗的疫苗制剂。在某些实施方案中，疫苗制剂用于预防和或治疗疾病，例如癌症和感染性疾病。在一个实施方案中，根据本发明对患者施用的用于预防和或治疗癌症的疫苗可以在去除癌症的外科手术之前或之后进行，在用于治疗癌症的化学治疗方法之前或之后进行，以及在用于治疗癌症的放射治疗之前或之后及其任何组合进行。在其它实施方案中，疫苗制剂可以与另一种组合物或药物产品联合或组合施用于患者。应当理解，本发明还可以用于预防个体中的癌症，此个体没有癌症但可能处于患癌症风险。[0227]根据本发明制备的癌症疫苗的施用广泛适用于预防或治疗癌症，该癌症一定程度上取决于对癌症疫苗的抗原形成部分的选择。可以根据本发明的实践适当治疗的癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、肝癌、食道瘤、脑瘤、睾丸瘤、子宫瘤和各种白血病和淋巴瘤。[0228]在一个实施方案中，根据本发明的疫苗可以源自待治疗的肿瘤或癌细胞。例如，在肺癌的治疗中，肺癌细胞将如上文所述进行治疗以产生肺癌疫苗。类似地，乳腺癌疫苗、结肠癌疫苗、胰腺癌疫苗、胃癌疫苗、膀胱癌疫苗、肾癌疫苗等，按照实践，将作为免疫治疗剂被生产和应用，以预防和或治疗产生疫苗的肿瘤或癌细胞。[0229]在另一个实施方案中，如所述的，根据本发明的疫苗还可以通过收集由病原体流入培养基中的相关抗原被制备以治疗影响哺乳动物的各种感染性疾病。由于通过引起相同疾病的不同种类的生物体表达的免疫原性和保护性抗原的类型中存在异质性，可以通过从表达不同的重要抗原的生物体库制备疫苗来制备多价疫苗。[0230]在本发明的另一个实施方案中，疫苗可以通过结节内注射施用到腹股沟淋巴结中。或者，根据疫苗靶标，疫苗可以经皮内或皮下施用于被治疗患者的四肢、手臂和腿。尽管该方法通常对于黑色素瘤和其它癌症包括预防或治疗感染性疾病是令人满意的，但是也可以使用其它给药途径，例如肌肉内或进入血流。[0231]另外，疫苗可以与佐剂和或免疫调节剂一起给予以增强疫苗的活性和患者的反应。此类佐剂和或免疫调节剂是本领域技术人员应当理解，并且在可获得的公开文献中容易描述。[0232]如本发明所预期的，并且取决于所产生的疫苗类型，如果需要，可以通过在生物反应器或发酵罐或其它适于大量生长细胞的容器或装置中培养细胞来扩大疫苗的产量。在这样的装置中，定期、频繁或连续地收集培养基，以在这些材料或抗原降解之前，从培养基中回收任何材料或抗原。[0233]如果需要，根据本发明产生和回收的包含疫苗或抗原的装置或组合物，此装置或组合物适于持续或间歇释放，实际上，植入体内或局部施用于体内，以使这种材料相对缓慢或定时释放到体内。[0234]疫苗制备中的其它步骤可以个体化以满足特定疫苗的要求。这样的附加步骤本领域技术人员应该理解。例如，某些收集的抗原材料可以被浓缩并且在一些情况下用洗涤剂处理并超速离心以除去移植同种异体抗原。[0235]HER3表达作为疾病的诊断和治疗的生物标志物[0236]在另一个实施方案中，HER3表达可以用作具有Barrett食管的和高度异常结构HGD的患者中的隐匿性侵入性疾病的生物标志物。本发明另外考虑的是以HER3或CMET为标靶的治疗剂，其可以在一些患者中提供胃食管癌的二级预防。[0237]本发明所述的这些方法绝不是全部包括的，并且适合于具体应用的其它方法对于普通技术人员是显而易见的。此外，组合物的有效量可以通过类似于已知发挥所需效果的化合物进一步估计。具体实施方式[0238]通过参考以下实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且不旨在是限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被理解为限于以下实施例，而是应当理解为涵盖由于本发明提供的传授内容而变得明显的任何以及所有变化形式。[0239]无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例来制造和利用本发明，并实践要求保护的方法。因此，以下实施例具体指出了本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。[0240]实施例1:创建针对引起乳腺癌和其他实体癌症的其他受体酪氨酸激酶的肽疫苗[0241]设计实验以开发针对那些被认定为BRCA突变携带者的患者的替代疗法。也就是说，对遗传上具有乳腺癌风险的、正在寻求二尖乳房切除术的替代品的年轻患者来说存在未满足的需求。[0242]具有乳腺癌基因突变BRCA1BRCA2的女性具有70%的发展成乳腺癌的终生风险，并且BRCAl突变携带者经常发展三阴性乳腺癌。设计实验以开发用于该组的疫苗并评价其在免疫诱导试验中的安全性这是疫苗接种用于初始预防乳腺癌的第一次尝试。还将包括BRCA2突变携带者以观察是否可使用本发明的多价疫苗预防雌激素受体阳性乳腺癌。[0243]设计实验以研究乳腺癌中的受体酪氨酸激酶表达和来自BRCA突变携带者的DCIS。观察到来自BRCA突变携带者的肿瘤早期常常过表达c-MET致癌基因和HER-3，而来自非突变或散发性病人的肿瘤表达HER-2和HER-3。这是重要的，因为根据本发明所公开的内容，现在已知肿瘤免疫治疗的靶标可用于开发用于散发性和BRCA突变携带者的疫苗。这是使用免疫应答预防有针对性的第一个区别特征。因此，本发明包括用于开发疫苗的组合物和方法及其用于预防作为双侧乳房切除术的替代物的用途。[0244]创建肽疫苗[0245]HER家族由参与多种癌症的四种相关信号分子-HER-1、HER-2、HER_3和HER-4组成。已知在20%至30%的乳腺癌中发现HER-2的过表达。本文提供的结果证明其他HER家族成员参与早期和浸润性乳腺癌以及其他癌症。例如，HER-I在少数乳腺癌上表达，通常是三阴性乳腺癌。c-MET是参与激活HER-3的许多癌症的复发的生长因子受体。HER-3在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中过表达。HER-3在大量的DCIS损伤和乳腺癌中表达。在接受HER-2疫苗的一些患者中，在手术时可以在残留DCIS中检测到HER-3。作为这些发现的结果，除乳腺癌中的HER-2，以这些分子为标靶的可能性被认为是有益的。[0246]已鉴定的来自HER-3的免疫原性肽（图1和图2如下：[0254]本文提供的结果证明这些肽可以激活许多患者的⑶4T细胞。所述肽可用于脉冲树突状细胞并训练T细胞识别HER-3。HER-3在三阴性乳腺癌中表达，并且可以在ER阳性乳腺癌中赋予针对抗-雌激素的抗性。HER-3也在其他癌症中表达，该癌症包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、前列腺癌和转移性脑肿瘤。不希望受任何特定理论的束缚，来自分子的细胞内部分的肽也可能是有利的。[0255]基于本发明提供的公开内容，基于鉴定HER-3的免疫原性肽的方法可以筛选和鉴定出HER-I和c-MET受体酪氨酸激酶分子的免疫原性肽。本发明的免疫原性肽可用于制备用于乳腺癌以及其它癌症的多价预防性疫苗。[0256]本发明提供的结果显示了HER-2的姐妹蛋白在乳腺癌中作用的鉴定。这些姐妹蛋白可以有效靶向，并可以开发其他实体瘤的疫苗。可用于靶向HER-I和HER-3的肽已经开发了。在DCIS中，特别地，已经鉴定了在疫苗接种之前和之后患者中的特异性抗HER-I、HER-2和HER-3应答，其为可用于预防早期癌症或治疗有DCIS的女性的多价疫苗的开发提供支持。本发明的组合物可用于治疗其它癌症，包括但不限于结肠癌、黑色素瘤、脑肿瘤、肺癌、卵巢癌和其他肿瘤。[0257]黑色素瘤[0258]黑色素瘤是一种侵略性皮肤癌，如果不及早被发现，可能是致命的。使用标准树突状细胞疫苗在小鼠中进行实验，其中树突状细胞被工程化以显示导致约70%的黑色素瘤的突变蛋白（BRAF。用这些树突状细胞接种保护小鼠免受黑色素瘤细胞攻击，证明可以开发用于黑素瘤的疫苗。不希望受任何特定理论的束缚，BRAF和HER-3靶向的组合可用于治疗黑素瘤以及其它癌症，包括但不限于实体癌症，例如结肠癌、胰腺癌和肺癌以及其它胃肠道肿瘤。[0259]此外，已经表明黑素瘤肿瘤使用B细胞逃避免疫监视，因此认为消除某些B细胞可以改善治疗。可以设计实验来评估是否将肿瘤微环境改变为Thl型应答可以帮助防止逃逸。[0260]在一些情况下，本发明的疫苗可用于治疗已经扩散的黑素瘤。在一些情况下，本发明提供了用于消除剩余细胞的治疗，该剩余细胞通常对药物治疗具有抗性。[0261]实施例2:来自于用于疫苗接种中的肿瘤抗原的MHCII类-混杂的CD4+肽的鉴定新策略[0262]尽管在历史上细胞毒性CD8+T淋巴细胞CTL被认为是抗肿瘤免疫的主要效应物，但是在各种肿瘤类型中单独用CD8+疫苗加强CTL应答产生了不可预测的临床结果，可能是因为没有足够的⑶4+T淋巴细胞帮助下CTL功能次优。CD4+T辅助1型Thl细胞分泌INF-γTNF-α，诱导肿瘤衰老和凋亡。因此，将CD4+表位成功掺入癌症疫苗构建和产生持久的抗原特异性CD4+免疫仍然是一个挑战。使用HER3的细胞外结构域（ECD作为候选“癌驱动oncodriver”肿瘤抗原，进行实验以鉴定免疫原性HER3CD4+肽，其展示II类混杂性并产生用于包含在疫苗构建体中的抗HER3⑶4+免疫。[0263]现在描述这些实验中使用的材料和方法。[0264]材料和方法[0265]设计实验使用HER3的ECD作为肿瘤抗原来鉴定免疫原性II类混杂的HER3CD4+肽，以产生抗HER3Thl细胞免疫。[0266]实验方案概述[0267]从HER3E⑶创建15-mer长肽的文库，肽中5个氨基酸重叠。将这些肽脉冲到来自供体的单核细胞衍生的DC上，并成熟为1型极化DC1;IL-12分泌表型。收获DCl并与纯化⑶4+T细胞共培养，该CD4+T细胞来自我们DCIS疫苗研究中具有已知抗HER-3Thl应答的受试者。使用具有10个肽的大库，并且通过对CD4+T细胞的干扰素γIFN-γ分泌进行测量，将鉴定过程逐渐缩小至单个反应性表位如。在筛选5-6个受试者时，鉴定到4肽似乎在大多数供体反应，这4个肽为HER356-7〇SEQIDNO:4、HER34〇i-4i5SEQIDN0:5、HER34i6-43〇SEQIDN0:6和HER3451-465SEQIDN0:7。鉴定了对HER3细胞外结构域的CD4+T细胞识别没有反应性的受试者，并用4种HER3肽对其DCl进行脉冲，并将脉冲的DCl与CD4T细胞一起培养一周，然后测试脉冲的DCl对HER2肽的反应性和对细胞外HER3蛋白的反应。在所有情况下，至少1个肽引起对脉冲到单核细胞上的肽和整个HER3蛋白的识别，由此表明初次敏化离体发生。还显示，健康供体可以对这些肽发生反应并且在存在抗HER3Thl应答丧失的三阴性乳腺癌患者中起反应。参见Gala,K·等，Clin·CancerRes2014;20:1410-1416和Datta，J.等，“ProgressiveLossofAnti_HER2CD4+T~heIperTypeIResponseinBreastTumorigenesisandthePotentialforImmuneRestoration”·OncoImmunology卿将出版。[0268]实验方案要点如图19所示:[0269]•包含123个重叠的15个氨基酸长度的肽片段的文库从HER3细胞外结构域E⑶）产生，该肽片段被5个氨基酸重叠。[0270]•来自供体的自体单核细胞衍生的树突状细胞DC通过GM-CSF、IFN-γ和LPS迅速成熟为1型极化DC1—IL-12分泌表型，并用相关肽如HER3E⑶或HER3⑶4+肽，如图所示脉冲。通过制备E-12，DC1极化Thl应答。[0271]•收获的DCls与纯化的⑶4+T细胞在8-10天的共培养中一起敏化。[0272]•再用未成熟DCiDC刺激敏化的CD4+T细胞其大部分预期成为抗原特异性），该未成熟DCiDC用感兴趣的特异性CD4+肽例如HER3文库肽簇或不相关的II类肽对照进行脉冲。[0273]•然后收获来自这些共培养物的上清液。通过IFN-γELISA测量，如果IFN-γ产生量是无关对照的至少两倍，则Thl应答被认为是抗原特异性的。[0274]•宾夕法尼亚大学医院的临床免疫实验室对捐赠者进行HLA_DR、DP、DQ分型，以评估⑶4+Thl应答的MHCII型混杂性。[0275]从HER3-E⑶产生包含123个重叠的15个氨基酸长度的肽片段的文库。来自供体的自体单核细胞衍生的DCs成熟为DCl，并用HER3-E⑶脉冲。收获的DCl与纯化的⑶4T细胞共培养。10天后，再刺激将敏化的CD4T细胞对抗未成熟DCiDC，该未成熟DCiDC用HER3文库肽簇或不相关的⑶4对照肽进行脉冲。通过IFN-γELISA测量，如果IFN-γ产生量是无关对照的至少两倍，则Thl应答被认为是抗原特异性的。[0276]实验分3个步骤进行：1针对接种HER2脉冲的DCl疫苗后具有已知的抗HER3E⑶反应性的乳腺癌患者，鉴定其免疫原性CD4+肽;2通过“反向”敏化方法，在相同的患者中证实这些肽的免疫原性；3接种疫苗后具有已知的抗-HER3E⑶无反应性的患者，鉴定其⑶4+肽，以观察细胞是否对天然HER3ECD致敏，从而克服消除自身抗原如HER3耐受性。[0277]对试验结果进行说明[0278]HER3E⑶肽文库的连续筛选以鉴定可由HER3E⑶致敏的⑶4+Thl细胞识别的免疫原性表位[0279]最初在具有已知抗HER3E⑶反应性的5名乳腺癌患者中进行Thl敏化，以鉴定单个免疫原性HER3⑶4+表位。为了实现这一点，HER3E⑶敏化的⑶4+Thl依次再被10肽簇（1-10、11-20等刺激，再变窄为3-肽簇（1-3、6-6、7-10等），并最终获得单一免疫原性HER3肽。代表性筛选在图2、13和14中显示。四种免疫原性肽-HER356-70SEQIDN0:4、HER3401-415SEQIDN0:5、HER3416-430SEQIDN0:6和HER3451-465SEQIDN0:7被可重复地鉴定并且跨HLA-DR、DP和DQ亚型混杂。当使用被四种鉴定过的HER3肽脉冲过的DCl使来自4个非HER3反应性供体的Thl细胞致敏，并且随后挑战识别HER3ECD脉冲的iDC时，所有供体不仅对个体免疫原性HER3肽显示了成功的敏化，而且也能识别天然HER3-ECD。[0280]本发明提供的结果证明用重叠的肿瘤抗原衍生的肽文库脉冲的DCl可以鉴定用于⑶4T细胞疫苗开发中的混杂II类肽。在这项研究中，免疫原性HER3CD4肽有效地克服了对自体肿瘤抗原的免疫耐受性。在疫苗构建中，这些HER3CD4肽可以被应用于携带HER3过表达的癌症患者中。此外，这些结果代表了一种新策略，其使用DCl-Thl平台，用于快速和可重复地鉴定来自任何肿瘤抗原的II类混杂免疫原性⑶4表位，用于癌症免疫治疗。下表1显示了具有已知抗HER3反应性的患者中免疫原性⑶4+HER3E⑶肽的初步鉴定结果。表2显示了通过连续筛选鉴定的四种免疫原性HER3CD4+表位的氨基酸序列。[0281]表1-四种免疫原性肽-HER356—7。（SEQIDN0:4、HER34〇i-415SEQIDN0:5、HER3416-43〇SEQIDN0:6、HER345i-465SEQIDN0:7_在先前对HER3ECD敏化的供体中可重复鉴定[0283]表2-免疫原性HER3CD4+表位的氨基酸序列[0285]通过“反向”敏化，对鉴定的⑶4+HER3E⑶表位的免疫原性的确认-如单个表位敏化的CD4+Thl识别天然HER3ECD的能力[0286]图15显示在具有已知HER3E⑶反应性的供体中，CD4+T细胞被各自的供体特异性的免疫原性HER3表位-脉冲的DCl敏化，并用各自的HER3表位和天然HER3E⑶脉冲的iDC再刺激。[0287]图20和21显示了“反向”敏化的其它结果[0288]用免疫原性HER3表位-脉冲的DC1敏化的CD4+Th1似乎消除了抗HER3免疫自身耐受逸[0289]如图16所示，当使用用四种鉴定的HER3肽脉冲的DCl使来自四个HER3E⑶非反应性供体的⑶4+Thl细胞敏化，并且随后挑战识别HER3E⑶脉冲的iDC时，证明了所有供体不仅对单个HER3表位显示了成功敏化，而且也证明了可识别天然HER3E⑶。[0290]CD4+HER3表位显示MHCII类混杂性[0291]使用HER3的细胞外结构域ECD作为候选的“致癌驱动”肿瘤抗原，进行实验，以鉴定免疫原性HER3⑶4+肽，该肽显示了II类混杂性并产生可用于疫苗构建体的抗HER3CD4+免疫，如图17所示。[0292]来自肿瘤抗原的肽[0293]本发发明提供的结果证明：[0294]•用重叠的肿瘤抗原衍生的肽文库脉冲的DCl可以鉴定用于CD4+T细胞疫苗开发的混杂性MHCII类肽。[0295]•免疫原性HER3CD4+肽有效克服了对自体肿瘤抗原的免疫耐受性。[0296]•这些结果代表了一种新策略，其使用DCl-Thl平台，用于快速和可重复地鉴定来自任何肿瘤抗原的II类混杂免疫原性CD4表位，用于癌症免疫治疗。[0297]•在疫苗构建中使用这些HER3⑶4+肽，需要对携带HER3过表达的癌症的患者进行研究。[0298]实施例3:HER3表达是胃食管结合部的癌前病变中肿瘤进展的标志物[0299]包括HER家族成员的RTK过表达在浸润性胃食管癌中具有预后和治疗意义。在癌变前胃食管损伤中的RTK表达尚未广泛研究。[0300]Barrett的食管，或在远端食管中存在化生性柱状上皮，易于发生食管腺癌Cameron，A.J.等，Gastroenterology1095:1541-61995。虽然从异常结构到浸润性恶性肿瘤的组织学转变被充分表征，但化生细胞中的癌发生涉及不完全了解的遗传改变。几个最近的报告已确定人类表皮生长因子受体2HER2表达在带有异常结构的Barrett食管病变的亚型中。（Almhanna，K.，等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.July162015八1111111111，等.）；卩8811，]\1.，等，]^81:〇卩1:11〇1〇区7615:769-762012史8811，等.）；和Rossi，E.，等，J.Cell.Mol.Med.l39B:3826-332009Rossi,等）。此夕卜，HER2表达的速率与发育异常的程度相关，暗示了肿瘤发生中的相关途径。[0301]在许多更常见的恶性肿瘤包括乳腺癌、肺癌和胃肠癌Yokata，J.等，Lancet1:765-7671986以及食管胃癌中已经证实了RTK分子的过表达，该RTK分子包括HER家族的成员（HER1、HER2和HER3和cMET、间充质-上皮转化因子。在乳腺癌亚组中HER2过表达的鉴定、HER2过表达与更具浸润性的生物学的关联性以及HER2与单克隆抗体的有效靶向性是用于治疗实体瘤的靶向治疗的进展中的关键事件（Joensuu，Η·，等，N.Eng.J.Med.3548:809-202006。这一经验为靶向RTK分子治疗其他恶性肿瘤的进一步努力提供了基础。[0302]HER2过表达已经在少数胃癌中得到证实，并已在转移性位置中用曲妥珠单抗对其进行靶向，其对结果的影响适中（Bang，Y.J.，等，Lancet3769742687-972010Bang,等.））。与更远端胃腺癌相比，HER2过表达在近端胃和胃食管结合处更频繁Rajagopal，I.，等，J.Clin.Diagn.Res.93:EC06-102015，并已在转移性位置中用曲妥珠单抗对其进行革巴向，其对结果的影响适中（1^11^，等和卩;[31^61'，].0.，等，1111:.]\〇311〇61'1357:1517-302014Fichter，等）。在大多数研究中，HERl和HER3在胃癌中的表达与不良预后相关Kandel，C.，等，J.Clin.Pathol.674:307-122014和Hayashi，Μ·，等，Clin·CancerRes.1423:7843-92008。cMET的过表达与食管腺癌中的不良预后相关，并且cMET依赖性的信号传导的抑制调节了HERl和HER3的活性（Liu,X.，等，Clin.CancerRes.1722:7127-382011。这些数据为进一步努力表征胃食管胃癌和前体病变中的RTK表达提供了理论依据。在食管胃癌和前体病变中鉴定RTK表达。下面描述的研究旨在表征在胃食管连接的异常病变中的RTK表达，以努力鉴定用于治疗和初级预防的潜在靶标。[0303]越[0304]在宾夕法尼亚大学的机构审查委员会批准后，对来自73例具有Barrett食管异常结构的患者低度异常结构LGD，n=32,或高度异常结构HGD，n=59的临床记录和组织学标本进行了回顾分析。将从2003年至2012年的来自存储的内镜活检的和粘膜切除的标本的福尔马林固定和石錯包埋的组织块在5μηι加载玻片FisherScientific，Waltham，MA上切片，随后脱蜡并再水合。所有活检材料对HERl克隆Hl1;1:50;DAKO、HER2HercepTest，DAKO，Carpinteria，CA和HER3克隆RTJ.2;1:30;SantaCruzBiotechnology，Dallas，TXLeicaBond-Ill仪器进行免疫染色，并由单个病理学家在显微镜LeicaBond-Ill下评价。膜3+HER染色被认为是阳性的，如在图22中所见的彡10%的肿瘤细胞中的膜2+HER2染色。当有足够的组织可用时，在42例中进行cMET免疫组织化学染色；彡50%的肿瘤细胞中的中度或强的膜染色是阳性的。RTK过表达与临床数据相关，用于评估配对的异常结构-腺癌活检标本与浸润性癌的关联性或对随后活检标本的腺癌的诊断与浸润性癌的关联性。[0305]统计分析[0306]对所有分析使用双尾测试。描述性统计被表示为分类变量的频率和连续变量的中值（四分位数间距（IQRJearson’sx2或Fisher精确检验和WiIcoxon秩和检验分别用于分析分类和连续变量。P值〇.05被认为具有统计学意义；所有测试都是双侧的。使用SPSS¥22.0进行分析（113]\1，41'1]1〇111:，附）。[0307]莖里[0308]通过免疫组织化学法鉴定和分析了总共73名具有低度Barrett食管异常结构η=32或高度Barrett食管异常结构η=59的患者的HER1、HER2、HER3和cMET表达。群组的中位年龄为65岁（IQR60-73岁）；81.9%为男性，87.5%为白种人。在群组中饮酒率为14.3%，主动吸烟率为6.3%，而55.6%为原吸烟者，26.4%有恶性家族史。在测量的临床和人口统计变量中L⑶和HGD群组之间没有显着差异，如下表3所示。[0309]表3具有Barrett食管异常结构群组的人口统计学和临床特征，以及低级和高级的单变量比较[0311]异常结构患者[0312]与低度异常结构（LGD相比，高度异常结构（HGD与HERl22.4%对3.1%，p=0.016、冊1?25.3%对0.0%，？=0.187和冊1?345.6%对9.4%〈0.001的过表达相关。[0313]有6例Foci浸润性食管腺癌患者与异常结构病变相关，所有这些的产生都与HGD〇^0:10.2%对比1^0:0.0%，？〈0.001相关联。另有9名患者在随后的活检标本（邪0:17.0%对比.LGD:0.0%，p=0.017上被诊断为浸润性食管腺癌。与没有侵润性癌病灶的患者（71.4%对38.6%印=0.032相比，冊1?3，而不是冊1?1或冊1?2〇^1?126.7%比20.5%，口=0.616和HER214.3%比2.3%，p=0.077的增加）的过表达与H⑶病变相关联，如图23A和23B所示。[03M]在42个42.9%评估样品中的18个中观察到cMET的过表达，并且与L⑶样品相比，在H⑶中观察到更多的cMET58.3%对36.7%，p=0.200，并且最常与HER362.5%的HER3阳性标本与38.2%的HER3阴性标本p=0.212共表达。在HERl阳性p=0.729或HER2阳性P=NA样品中没有观察到类似趋势。42例（5.6%患者中有一例确诊浸润性癌;cMET在该患者中过表达P=〇.243。[0315]讨论:[0316]对胃食管连接的异常结构病变中的RTK表达的分析证实：（IHER家族蛋白在Barrett食管异常结构中上调；（2HER家族和cMET过表达的频率与异常结构程度呈正相关；和⑶HER蛋白上调，特别是在异常结构病变中，与相关侵袭性癌症的发生率增加相关。[0317]因此，HER3可以用作具有Barrett食管和H⑶的患者的隐匿性侵入性疾病的生物标志物。此外，以HER3或CMET为靶向的治疗剂可以在患者亚组中提供胃食管癌的二级预防。[0318]先前对Barrett食管中HER表达的评估已经限于对少数病例中过表达的HER2的评估，参见Almhanna等人，Fassan等人和Rossi等人。本研究中HER2过表达存在于3.3%的活检标本中，低于HERl或HER3过表达的速率。这种模式与HER家族蛋白在侵入性胃食管连接癌中的表达一致，其中HER3比HER2过表达更为常见Fichter等）。随着从LGD进展到HGD，HER3蛋白的过表达增加，特别是HER3频繁的过度表达代表着新颖性，虽然并没有意料之外的发现。HER受体的同源和异源二聚化驱动信号激活;在其他肿瘤类型中观察到HER家族的多个成员的聚簇过表达。与之结合的，活化的c-MET正调节HERl和HER311的活性。实际上，这些受体之间的相互作用为以多种RTK为标靶的多价治疗方法提供了理论依据（Baselga，J.，等，N.Eng.J.Med.3662:109-192012;Waddell，T.，等，Lancet0ncol.l46:481-4892013〇[0319]本数据还暗示靶向二次预防胃食管癌的机会还没有被开发。以前在乳腺导管原位癌DCIS中靶向HER2的表达已经被作为目标并具有了有希望的结果参见U.S.PublishedApplicationUS20150323547A1；U.S.Ser.No.14985,303filedDecember30,201；,DattaJ.等，OncoImmunology4:8el0223012015DOI:10.10802162402X.2015.1022301;Datta，J.等,BreastCancerRes.17I:712015。这种方法对胃肠恶性肿瘤而言仍是距离遥远的目标。尽管如此，目前Barrett食管的治疗方法，包括内镜切除术和消融方式以及根治性手术都有明显的局限性。减少发病率和减少浸润性癌的风险的可选择性策略是需要的。这种在胃食管连接的异常结构病变中的RTK表达的分析证实：（IHER家族蛋白在具有异常结构的Barrett食管中上调；（2HER家族和cMET过表达的频率与异常结构程度呈正相关；和⑶HER蛋白上调，特别是在异常结构病变中，与相关侵袭性癌症的发生率增加相关。[0320]因此，HER3可以用作具有Barrett食管和H⑶患者的隐匿性侵入性疾病的生物标志物。此外，以HER3或CMET为标靶的治疗剂可以在患者亚组中提供胃食管癌的二级预防。[0321]总之，本数据表明了在胃食管结合部的高等级异常结构病变中，特别是具有隐匿性浸润性癌的胃食管结合部的高等级异常结构病变中HER3的频繁过表达和恶性转化之间的关系。这些发现可以证明对于表达HER3的异常结构病变有更积极的管理方法，并为HER3靶向的治疗剂在早期疾病环境中的未来应用提供理论依据，这是本领域技术人员容易理解的。[0322]我们以前展示了在HER-2P°S乳腺肿瘤发生过程中天然抗HER-2CD4Thl的进行性损失。这种应答的丧失与对新辅助治疗缺乏病理完全缓解（“PCR”）有关，并与乳腺癌复发的升高的风险相关，并且可以用疫苗接种恢复。下面的实施例4研究了在乳腺肿瘤发生期间抗HER3Thl应答是否存在类似的损失。[0323]实施例4:在乳腺肿瘤发生中出现了抗HER3CD4Thl的丧失并且与结果负相关[0324]实施例4总体摘要[0325]我们以前展示了在HER2P°S乳腺肿瘤发生过程中天然抗HER2CD4Thl的进行性损失。这种应答的丧失与对新辅助治疗缺乏病理完全缓解（“PCR”）有关，并与乳腺癌复发的升高的风险相关，并且可以用疫苗接种恢复。该实施例研究了在乳腺肿瘤发生期间是否存在类似的抗HER3Thl应答的损失。[0326]收集了来自131名受试者的外周血，包括健康供体（“HD”）、良性乳腺疾病（“BD”）患者、原位导管癌患者（“DCIS”）和浸润性乳腺癌（“IBC”）患者。通过酶联免疫吸附（ELISpot测定法测试对上文实施例1和2中鉴定的四种不同HER3免疫原性肽的免疫应答，并分析免疫应答的所有量度。[0327]从HDs到IBC的抗HER3应答有显着下降。三阴性（“TN”）IBC在所有三个免疫参数中具有最低的响应。三种免疫参数中，HDs具有比ERpcisIBC和TNIBC患者二者显著更高的免疫应答。有趣的是，HER2P°SIBC显示类似于HDs和BDs的免疫应答。与没有随后复发的患者或对新辅助治疗具有PCR的患者相比，患有复发性乳腺癌和对新辅助治疗缺乏pCR的患者具有显著更低的抗HER3⑶4Thl应答。[0328]因此，发现⑶4Thl抗HER3在乳腺肿瘤发生期间损失，最显著地是在TNIBC中，这组的治疗选择有限且对HER3过表达的预后显著更差。这些发现具有试图恢复这种应答以防止复发的意义。[0329]背景[0330]几乎八分之一的妇女将在其一生中会发展乳腺癌。其中，过度表达HER2的癌症与较高的远端转移率和总体较差的预后相关。曲妥珠单抗一种针对HER2的单克隆抗体的引入已显着延长了HER2阳性癌症患者的无进展生存期和总生存期，这些指出了HER2在调节乳腺癌进展中的关键作用GiordanoS.H.，等，J.Clin.Oncol·2014:JC0_2013[PublishedonlinebeforeprintMay5,2014,doi:10.1200JC0.2013.54.0948]〇[0331]免疫系统在调节HER2表达的肿瘤中起关键作用。之前已经显示，从健康受试者到HER2P°SDCIS到HER2P°SIBC，但不包括HER2negIBC的天然抗HER2CD4T细胞应答有逐步下降。此外，较低的抗HER2免疫应答与随后的乳腺癌复发相关，而较高的抗HER2免疫应答与对新辅助化疗的病理完全缓解相关，暗示免疫系统在HER2P°S肿瘤发生中的作用。参见Datta，J.，等，OncoImmunology410:el027474.D0I:10.10802162402X.2015.10223012015andU.S.PublishedApplicationUS20150323547A1collectivelyhereinafter,“Datta，等”）。我们小组已经开发了HER2脉冲树突状细胞疫苗，其在DCIS和IBC患者中恢复抗HER2CD4和CD8T细胞应答。Sharma,A·，等，Cancer11817:4354-43622012;Koski,G.K.,等，J.Immunother.35I:54-652102;andU.S.PublishedApplicationUS20150323547Al。[0332]HER2是EGFR家族的成员，EGFR家族是也包括HERl和HER3的一组RTK。虽然众所周知HER2自身二聚化，但是HER3在信号传导中的作用不太清楚，并且它可能与自身和HER2均发生二聚化。HER3与HER2的二聚化已被提出是用曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者中的逃避机制。Czopek，J.，等，Contemp.Oncol·175:446-92013“Czopek，等”）andBae，S.Y.，等，BreastCancerRes.Treat.l393:741-502013“Bae,等”）。帕妥珠单抗是市场上最近添加的一种肿瘤药物，作为第一个获得ΠΑ批准作为新辅助治疗的肿瘤药物的帕妥珠单抗抑制HER2HER3二聚化，并且当与曲妥珠单抗联合用于乳腺癌患者时，已证明对整体存活有益处。Jhaveri，Κ·，等，J.Natl·Compr·Canc.Netw.12⑷：591-82014andHarbeck，N.，等，BreastCare81:49-552013〇[0333]HER3的表达在乳腺癌亚型中不太清楚，尽管在一些ER阳性、HER2阳性和三阴性“TN”）亚型中观察到其的过表达。Moeder，C.，等，Cancer11511:2400-92009。感兴趣的是，虽然HER3过表达可能在HER2P°SIBC中更常见，但其预后价值在TNIBC中更显着。尽管HER3在ERP°SHER2P°SIBC中的表达不影响无病生存（“DFS”）或总生存（“0S”），但是TNIBC中的HER3表达与更差的5年DFS和10年OS相关。Bae等和Czopek等。值得注意的是，根据定义具有HER3过表达的TNIBC患者是没有任何经典治疗选择的，具有HER3过表达的TNIBC患者的相当多的部分可受益于可识别的新靶标。尚不清楚抗HER3CD4Thl应答是否存在于健康的供体中以及这种应答是否在乳腺肿瘤发生期间改变。本研究寻求这些问题的答案。[0334]越[0335]受试者记录[0336]共有131名受试者符合研究标准，并在知情同意的情况下连续登记在宾夕法尼亚大学。这项研究由宾夕法尼亚大学的机构审查委员会和Abramson癌症中心在受试者入组前批准。在这131名受试者中，其中9名患者的外周血单核细胞不足以进行测定，剩余122名受试者具有免疫应答数据以供复查。在健康供体HD，n=30、良性乳腺疾病BD，n=ll、DCISn=13、HER2PCISIBCn=21、ERPCIS浸润性乳腺癌（ERposIBC，n=20和三阴性IBCTNIBC，η=27之间对四种不同HER3免疫原性肽的⑶4T细胞应答进行了比较。[0337]外周血单核细胞收集[0338]通过静脉穿刺收集外周血。将血液以1:1的比例在Hank’s缓冲液或I3BS中稀释，并将淋巴细胞分离培养基在锥形管中在稀释的血液之下分层。然后通过在1200rpm下密度离心30分钟，分离血液。收集单核细胞层，并在Hank’s缓冲液或PBS中洗涤两次。计数细胞并以每毫升10百万个细胞重悬，并在_80°C冷冻24-48小时，然后转移至负200°C，其中细胞保持储存直到实验测定。[0339]测量抗HER3CD4Thl应答[0340]通过ELISpot测定，根据制造商的方案测量抗HER3⑶4Thl细胞应答。简言之，用70%乙醇活化96孔PVDF膜平板，用PBS洗涤，然后用抗-IFN-γ抗-IFN-γ抗体包被，并在4°C温育过夜。24小时后，再次用PBS洗涤平板，然后用含有10%人血清的Iscove’s培养基封闭1小时。将外周血单核细胞在37°C解冻，在PBS或Hank’s缓冲液中洗涤，计数并以1百万细胞毫升重悬，然后以每孔200，000个细胞用四种免疫原性HER3肽：[0341]pl2肽56-70:CEWMGNLEIVLTGHSEQIDN0:4;[0342]p81肽401-415:SWPPHMHNFSVFSNLSEQIDN0:5;[0343]p84肽416-430:TTIGGRSLYNRGFSLSEQIDN0:6;和[0344]p91肽451-465:AGRniSANRQLCYHSEQIDN0:7，抗-CD3CD28多克隆刺激物，阳性对照破伤风类毒素（SantaCruzBiotechnology，Dallas，TX或无无刺激对照）。一式三份进行测定。将平板在38°C下温育48小时。48小时后，用PBS洗涤平板，然后加入生物素化的抗-IFN-γ抗体，将平板在38°C温育2小时。再次用PBS洗涤板，加入链霉抗生物素-HRP，将板在38°C下培养1小时。最后，用PBS洗涤板，然后加入TMB底物溶液。5分钟后，用自来水充分洗涤，停止显色。将板在4°C下干燥过夜。[0345]免疫反应分析[0346]通过免疫斑点软件给斑点计数。对三个参数或度量进行定量以确定免疫应答：（1累积应答或在每百万细胞中对所有四种HER3免疫原性肽在斑点方面的总和的应答，（2响应库，或每个受试者中具有20个或更多个斑点的的肽数，和3响应率或响应至少一种肽的受试者的百分比（定义阈值为20个或更多个点）。每200,000个细胞斑点中的破伤风应答和每200,000个细胞的斑点中的抗CD3CD28应答也被定量为对照。所有免疫反应指标通过graphpadprism软件分析。[0347]莖里[0348]研究对象特征[0349]共有131名受试者符合研究标准，并在宾夕法尼亚大学医院获得知情同意书。9名受试者用于分析的细胞不足，剩下122名受试者。其中，平均年龄为50岁，从25岁到83岁，72.1%为白种人，18.0%为非裔美国人，9.8%为另一种族。受试者分为五组:HDsn=30、BDsn=ll、DCISn=13、HER2PCISIBCn=21、ERposIBCn=2027。在68名IBC受试者中，3551.5%是I阶段、2232.4%是II阶段、913.2%是III阶段、22.9%是IV阶段。52例（76.5%接受了化疗和或赫赛汀和或他莫昔芬治疗，16例（23.5%为初次治疗。三个DCIS患者和三个HER2P°SIBC患者接受HER2脉冲树突状细胞疫苗接种。其它特性报告在下表4中。[0350]表4研究对象的特征[0351][0353][0354]从健康捐赠者到浸润性乳腺癌亚型的CD4Th1细胞抗HER3免疫应答有降低[0355]比较邢8、8〇8、0：15、冊1?21。318：4妒。318：和了~18：，三种免疫参数都下降，在TNIBC中达到最低点：累积应答90对80对66对79对48对40，p=0.01，分别如图24A所示），响应库（I.0对0.6对0.8对0.8对0.5对0.3，p=0.003，分别如图24B所示和响应率76.7%对63.6%对53.8%对66.7%对45.0%对33.3%，p=0.02,分别如图24C所示）。值得注意的是，在HDs与TNIBC患者的所有三种免疫参数中：累积应答90对40，p=0.002、响应库（1.0对0.3，p=0.002和响应率76.7%对33.3%，p=0.001，这些差异不仅在统计学上显着更高，而且也超过一倍以上。与TNIBC患者相比，BDs具有显着更高的累积应答分别为40对80，？=0.007，0：13患者具有显着更高的响应库（分别为0.8对0.3，？=0.04，冊1?21°318〇具有显着更高的响应库分别为0.3对0.8，P=0.01和响应率分别为33.3%对66.7%，P=O-Mt3ERpcisIBC患者具有第二低的抗HER3⑶4T细胞应答，并且与HDs相比在所有三种免疫参数中显示出统计学上显著更低的应答:累积应答分别为48对90，p=0.03，响应库分比为0.5对1.0，p=0.008和响应率（分别为45.0%对76.7%，p=0.03。值得注意的是，HER2P°SIBC抗HER3应答与HDs、BDs或DCIS受试者没有显著差异。[0356]在浸润性乳腺癌患者中较低的CD4Th1细胞抗HER3免疫应答是HER3特异性的，并且不能归因于免疫应答的广泛缺陷[0357]分析破伤风应答和具有抗CD3CD28应答的多克隆刺激，以比较和控制总体免疫应答性。通过ELISpot测定每200，000个细胞的斑点可知，CD4Thl细胞抗破伤风应答在HDs、BDs、DCIS、HER2p°sIBC、ERP°SIBC或TNIBC患者之间没有差异（分别为37对30对19对34对24对29，p=0.65,如图25A所示）。重要的是，HDs和TNIBC患者之间的抗破伤风应答是相似的37对29，p=0.37，但这两组患者具有最不同的抗HER3⑶4Thl细胞应答。同样，在用抗CD3CD28的多克隆刺激中没有差异，每个组中的大多数受试者具有太多稳固的斑点发育以至于不能计数。在可计数的那些中，邢8、8〇8、0：13、冊1?21°318^妒°318：或了~18：患者（分别为688对549对804对699对629对675，p=0.68,见图25B之间没有统计学上显著差异。[0358]浸润性乳腺癌患者的抗HER3CD4Thl细胞应答与肿瘤侵袭的预后和特征相关[0359]为了确定抗HER3CD4T细胞应答是否与肿瘤侵袭的特征相关，通过初始手术中淋巴结状态淋巴结阳性（“LNP°S”）、淋巴结阴性（“LNneg”）），对于新辅助化疗的诊断和反应至少1年的患者的复发与非复发状态病理性完全应答（“PCR”）、残留疾病（“〈pCR”））来比较IBC患者的免疫应答。在所有三个参数中，虽然与LNneg患者n=31相比，LNpcisIBC患者η=28具有总体较低的免疫应答，但没有统计学显着性，三个参数为：累积应答分别为40对56，ρ=0.12、响应库（分别为0.4对0.6，ρ=0.08和响应率分别为35.7%对54.8%，口=0.19，如图26Α所示。值得注意的是，LNpcis受试者包括新辅助化疗后有淋巴结转移的受试者。新辅助化疗后IiTg的受试者从分析中排除了，因为不知道在治疗之前他们是否有结节。在诊断至少一年的患者中，与那些保持无疾病η=36的患者相比，那些患有复发性乳腺癌局部或远处转移，η=7的患者在三个免疫参数中显示出显著较低的抗HER3应答，三个免疫参数为：累积应答分别为17对66，分别为ρ=0.04、响应库分别为0.0对0.6，ρ〈0.05和响应率分别为0%对诊断后55.6%，ρ=0.01如图26Β所示。[0360]最后，在接受新辅助化疗η=16的患者中，pCR组η=5与〈pCR组η=11相比具有显著更高的累积应答分别为144对32，ρ=0.004和响应库分别为0.8对0.4，ρ=0.05，如图26C所示。pCR组和〈pCR组分别为80.0%与27.3%，ρ=0.10之间在响应率方面没有统计学显着差异。应注意，LNpcis和LNneg患者分别为22对29，p=0.35，复发患者与非复发患者分别为27对35，？=0.65和?0?与〈?0?分别为17、59，？=0.15在破伤风应答中没有差异。因此，具有更具侵袭性肿瘤特征的IBC患者中较低的CD4Thl细胞应答是HER3特异性的。[0361]抗HER3⑶4Thl细胞反应的健康捐助者特征[0362]在HD和BD中的抗HER3CD4Thl应答是根据年龄（〈50年（n=25或彡50年（η=16、种族高加索人η=29、非裔美国人η=12或其他η=5、妊娠状态0η=17或1个或多个妊娠η=24和绝经状态（绝经前η=30进行比较的。根据年龄（图27Α、种族图27Β或先前怀孕史（图27C、累积肽反应、响应库或响应率没有差异。然而，如图27D所示，与绝经前的妇女相比，绝经后的妇女有显著更高的累积应答每百万细胞136对70个点，P=O.005上图）和响应库分别为1.4对0.8肽，p=0.03第二图）。在响应率方面没有统计学显着差异分别为90.9%、66.7%，？=0.23第三图）。绝经前妇女和绝经后妇女的破伤风应答之间也没有统计学显着差异下图），表明绝经状态中免疫应答的差异是HER3特异性的。[0363]ELISpot分析是通过线性精度测定来证明是精确的[0364]在我们的实验室，ELISpot测定法之前已经验证。为了确认在进行本研究所有实验的操作者下该试验的精确度，用来自已知的高抗HER3CD4T细胞应答者的系列稀释液进行线性精密测定。将外周血单核细胞从1.0至0.1至0.01至0.001的浓度系列稀释到培养基中，并以每百万个细胞的斑点来测量累积的抗HER3免疫应答。图28显示，累积值分别从230、35、12至5的点?〈0.00014=0.88线性下降。[0365]过造[0366]免疫系统知识在癌症发展、进展和预后中的作用的正在迅速扩大。已经确定的是，免疫缺陷状态增加癌症发展的风险，不仅对来自病毒来源的肿瘤是这样，而且对来自非病毒来源的肿瘤也是这样。Boshoff，C·，等，NatureRev·Cancer2:373-822002;Sheil，A.G.,WorldJ.Surg.10:389-961986；Penn,I.,Transplantation61:274-781996；andPenn,I·,Transplantation60:1485-911995。还已知某些免疫表型与乳腺癌相关;循环炎症细胞因子TNF-α和IL-6在乳腺癌患者中较高，并且低⑶4+CD8+T细胞比率与更具侵袭性的乳腺癌表型相关，而肿瘤浸润淋巴细胞与一些乳腺癌中更好的预后相关。Alokail，M.S.，等，Med.0ncol.318:382014doi:10.1007sl2032-014-0038-0;Jai，Y.，等，Med·Oncol·31:9812014;andMatsumoto，Η·，等，J.Clin.Pathol.doi:10.1136jclinpath-2015-202944。然而，针对其他免疫活性宿主中特定分子癌驱动的免疫识别损失的证据相对较新。只有最近才显示，从健康捐助者到HER2P°SDCIS到HER2P°SIBC的天然抗HER2CD4Thl细胞应答下降，领先研究之一显示在乳腺肿瘤发生中针对这种特异性癌驱动的免疫应答受到了损失。本领域普通技术人员将容易地理解，对这种特定损失的鉴定和理解对于特异性免疫靶向治疗将具有很大的潜力。[0367]这项研究表明：（1从HDs到ERpcis和TNIBC，抗HER3CD4Thl细胞反应下降；（2抗HER3应答与预后相关，特别是较低的应答与复发相关，而较高的应答与新辅助化疗的pCR相关;和⑶绝经后HD具有显着更高的抗HER3免疫应答。所有这些发现将具有抗HER3CD4Thl细胞应答的诊断和临床用途。[0368]抗HER3CD4Thl细胞应答在HD中最高，在TNIBC中最低，其中TNIBC的预后比其他类型的IBC的预后受HER3过表达的影响更严重其。Bae等和Czopek，J.等。尽管HER3表达在目前研究的IBC患者的群体中是未知的，但与HER2P°SIBC群体相比，TNIBC和ERpcisIBC组可能具有更高水平的HER3表达，其显示与HDs相似的应答。事实上，我们以前的研究表明抗HER2CD4Thl细胞应答直接与HER2表达相关;抗HER2CD4Thl细胞在HER2P°SIBC中，而不是HER2negIBC中有显着下降。与表达受体的乳腺癌相比，HER3不仅对TNIBC的预后具有更大的影响，而且甚至在TNIBC中，与HER21+肿瘤相比，其可能对HER20的预后具有更大的影响。Schmidt，G·，等，Arch·Gynecol·Obstet·290:1221-292014。这可以部分解释HER2P°SIBC和HD之间的免疫应答的相似性。如果肿瘤已经由于HER2过表达而增殖，则对肿瘤进展而言就没有驱动使其逃避免疫监视。然而，如果免疫系统已经识别HER2并以HER2为靶向，肿瘤就可能适应HER3过表达，免疫逃避对肿瘤细胞的生存而言就成了进化有利的。[0369]有趣的是，ERpcisIBC显示类似于TNIBC的抗HER3⑶4T细胞应答，并且显着低于HDs或HER2P°SIBC的抗HER3CD4T细胞应答。尽管与TNIBC相比，HER3表达在ERpcisIBC中的预后显著性较小，但证据表明HER3mRNA表达与ER表达正相关。Fujiwara，S.，等，BreastCancer21:472-812014。这可以解释在该IBC亚组中观察到的较低的免疫应答。[0370]具有复发性疾病的乳腺癌患者与保持无疾病的患者相比具有较低的抗HER3CD4Thl应答，这表明免疫监视可能是长期治疗成功的重要机制。复发患者更可能具有高HER3表达的肿瘤，这点是可能的，高HER3表达的肿瘤本身与复发、转移和更差的总体存活的更高风险相关。Li,Q·，等，OncologyReports30:2563-702013;Smirnova，T·，等，Oncogene31:706-152012;andOcana,A.，等，J.N.C.I.IOS⑷：266-732013。此外，已经提出免疫编辑作为逃避机制，由此通过免疫系统选择性地消除肿瘤细胞，直到它们进化以表达逃避免疫识别的分子癌驱动，如HEI^Dunn,G.P·，等，NatureImmunology311:991-82008。因此，HER3表达可能是由于缺乏免疫监视，其之后增强复发的风险。有趣的是，最近的证据表明复发性肿瘤在病理学上可能与原发性肿瘤不相同。原发性和继发性肿瘤之间对于孕酮受体的不一致率特别高，并且任何类型的不一致都指示复发性肿瘤的预后较差。Idirisinghe，P.K.A.，等，Am.J.Clin.Patho1.133:416-292010;Broom,R.J.，等，AnticancerResearch29:1557-622009;andLiedtke，C·，等，AnnalsofOncology20:1953-582009。据信，目前还没有研究比较原发性和继发性肿瘤之间的HER3表达;HER3表达在原发性和复发性肿瘤之间是否不一致是未知的以及HER3表达是否可以代表复发发生的逃避机制也是未知的。如果答案是肯定的，靶向具有低抗HER3CD4T细胞应答的患者可以提高免疫监视并帮助防止长期复发。[0371]还暗示免疫系统在预后中的作用，对新辅助化疗pCR的患者具有比〈pCR的患者显著更高的抗HER3CD4T细胞应答。已经显示HER3信号传导介导了对靶向治疗的获得性耐药性。Sergina，N.V·，等，Nature445:437-412007;andFrogne，T·，等，BreastCancerRes.Treat.114:263-752009。在这里暗示不是获得性抗性，而是初始抗性，使抗HER3免疫反应成为最大受益于新辅助治疗的患者的潜在的预后标记物。进一步的研究应该阐明抗HER3免疫应答是否不仅是预测预后的，而且还可以干预以促进对治疗的应答。[0372]在本研究中，HD的一个部分，特别是绝经后妇女，表现出更高的抗HER3反应。然而，不同于以前对抗HER2反应的研究结果，基于怀孕史的结果是没有差异的。虽然在生物学上，更高的抗HER2反应可以归因于怀孕中乳房退化和随后的细胞蛋白质在免疫监视下的暴露，乳腺实质中的这种变化在更年期不太可能。Press,M.F.，等,Oncogene5:953-621990。在成像中已经观察到乳腺密度随着激素变化如在绝经期中）而变化，这可以模拟在怀孕中的乳房退化，还可以模拟将通常在乳腺组织中表达的细胞蛋白暴露于免疫系统。Clendenen,T.V.，等,MagneticResonanceImaging31:1-92013。另一种解释可以将绝经后妇女中较高的抗HER3免疫应答归因于风险差异。各种乳腺癌癌驱动的表达显然是具有年龄依赖性：HER2P°SIBC随年龄变得不太可能，而ERpcisIBC变得更可能。Clark,G.M.，等，J.Clin.Oncol.2:1102-091984;Eppenberger-Castori，S.，等，Int.J.Biochem.andCellBiol.34:1318-302002。此外，这两种受体彼此不是独立的，因为随着年龄的ERPR表达是HER2依赖性的，反之亦然。Neven，P.，等，BreastCancerRes.Treat.110:153-592008。TNIBC患者，具有最低抗HER3免疫应答和预后对HER3过表达最敏感的组，在绝经前妇女中更频繁地发生。Bae等.andHowlander，N.，等，J.N.C.I·106⑶：1-82014。因此，绝经前HD的亚组代表发生TNIBC的较高风险的组，而绝经后HD代表已经超过该较高风险期的组并且实际上代表患有HER2和HER3同时过表达的乳腺癌的风险较低的组。还值得注意的是，尽管TNIBC在年轻女性中更常见，但是其在老年人群中的发生预示着更好的预后，原因未知。Aapro,M.等，annalsofOncology236:vi52_552012。如果更高的抗HER3免疫应答确实是由于更年期组的生物学机制而不是风险规避组的生物学机制，就可能部分解释了绝经后妇女中TNIBC的更好的预后。[0373]结论[0374]该实施例证明了从HDs、BDs和DCIS到ERpos和TNIBC，抗-HER3CD4T细胞应答下降。此外，较低的抗HER3反应与复发和新辅助治疗〈pCR相关，表明这种免疫应答在浸润性乳腺癌中也可以发挥预后作用。最重要的是，这些结果反映了先前研究的结果，其显示从HDs到HER2P°SDCIS到HER2P°SIBC的天然抗HER2免疫应答的下降。这种类似的结果不仅有希望用于确认以前的发现，而且也有希望在寻找分子癌驱动中发挥更大的免疫系统作用。有趣的是，绝经后HDs比绝经前HD具有显著更高的免疫反应，绝经前HD组通常在发展HER3过度表达的乳腺癌中处于较高风险并且可能指向介导该风险的机制。确定HER3脉冲的DCl疫苗接种是否可以对HER3过表达的乳腺癌的发展具有治疗和或风险调节作用这点很重要。继续检查免疫系统在其它癌驱动特异性癌症中的作用也是同样重要的。[0375]结论之前:从健康供体组到侵入性乳腺癌组，CD4Thl细胞抗HER-3免疫应答损失，最显着的是在TNIBC组中，该组治疗选择有限且HER-3过表达的预后显着更差。抗HER3免疫应答还减轻对治疗和预后的应答，其指向潜在的免疫治疗靶标。向DCl疫苗中加入HER3免疫原性肽能够增加可从疫苗接种中获益的IBC患者群体。最重要的是，这些结果验证了以前的发现，并指向在寻找分子癌驱动中的更大的免疫系统作用。[0376]本实施例的结果，即为，在乳腺肿瘤发生中，从HDs组到IBC组抗HER3CD4+Thl显著损失，其可以由本领域普通技术人员理解为可用于诊断和治疗表达HER3的癌症，尤其是乳腺癌，特别是三阴性IBC。可以预期的是可开发血液测试以检测受试者中循环抗癌的CD4+Thl应答从而利用这些发现。优选地，这种血液测试将使用HER3免疫原性肽，例如本文使用的4种列举的HER3免疫原性肽或基于患者所患癌症类型的能够在患者中诱导免疫应答的任何其它MHCII类免疫原性肽。作为非限制性实例，可以用这种血液测试监测患有复发性乳腺癌和对新辅助治疗缺乏PCR的患者，以确定其抗HER3⑶4Thl应答并相应地治疗。[0377]通过患者血液测试或其他方法检测到的低抗HER3应答可以通过恢复方法来对抗，例如疫苗，并且优选基于用HER3免疫原性肽脉冲孵育的患者单核细胞衍生的树突状细胞的疫苗，其中HER3免疫原性肽例如本发明实施例中使用的4种HER3免疫原性肽。本领域普通技术人员将容易地理解，存在恢复患者免疫应答的其它方式。特别地，对于TNIBC患者，该组固有地具有有限的治疗选择，对其测量HER3应答的方法，以及如果需要，通过DCl疫苗恢复这种应答的方法可能证明是非常有价值的。抗HER3免疫应答也可以用作需要新辅助治疗的患者的潜在预后生物标志物。HER3脉冲的DCl疫苗或其它合适的疫苗可能对HER3过表达的乳腺癌以及其它表达HER3的癌症的发展具有治疗和或风险调节作用。本发明的发现可以被理解为可用于开发本发明所预期的用于诊断和或治疗的阵列血液测试和测定。[0378]本发明引用的每件专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本发明中。虽然已经参考具体实施例公开了本发明，但是显然本领域的其他技术人员可以在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计本发明的其它实施例和变化。

权利要求：1.一种分离肽，其选自由以下组成的组：pll-13肽51-75:KLYERCEVVMGNLEIVLTGHNADLSFLQWSEQIDNO.l，p81-83肽401-425：SffPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNSEQIDNO·2，p84_86肽4I6-440:TTIGGRSLYNRGFSLUMKNLNVTSSEQIDΝ0·3，ρ12肽56-70:CEVVMGNLEIVLTGHSEQIDN0.4，p8lGic401-415:SWPPHMHNFSVFSNLSEQIDN0.5，p84Gic416-430:TTIGGRSLYNRGFSLSEQIDN0.6*p91〇fe451-465:AGRIYISANRQLCYHSEQIDN0.7。2.—种免疫调节剂，其包含一种或多种权利要求I所述的肽。3.—种疫苗，其包含一种或多种权利要求1所述的肽和药学上可接受的盐。4.根据权利要求3所述的疫苗，其进一步包含佐剂。5.—种细胞，其中所述细胞已经与一种或多种权利要求1所述的肽接触。6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞是抗原呈递细胞。7.权利要求5的细胞，其中所述细胞是T细胞。8.—种在受试者中引发免疫应答的方法，包括向所述受试者施用权利要求1所述的组合物。9.一种治疗受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用一种或多种权利要求1所述的肽。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者是人并且患有癌症。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组:乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、胃肠癌、脑癌及其任何组合。12.—种激活细胞方法，包括使所述细胞与一种或多种权利要求1所述的肽接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞是抗原呈递细胞。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞是T细胞。15.—种用于免疫治疗的负载肽的、活化的树突状细胞DC的生产方法，包括：用一种或多种权利要求1所述的肽脉冲所述DC;用至少一种TLR激动剂激活所述DC。16.根据权利要求15所述的方法，包括使所述DC与可提高所述DC中的细胞内钙浓度的试剂接触。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述试剂包括钙离子载体。18.根据权利要求15所述的方法，进一步包括冷冻保存所述DC，其中当所述DC解冻时，所述DC产生有效量的至少一种细胞因子以产生T细胞应答。19.由权利要求15所述的方法生产的细胞。20.—种疫苗，其包含由权利要求15所述的方法生产的细胞。21.根据权利要求20所述的疫苗，其中所述疫苗为可注射多剂量疫苗的形式。22.—种在哺乳动物中引发免疫应答的方法，包括将由权利要求20所述的方法产生的细胞群施用于有需要的哺乳动物。23.—种治疗哺乳动物疾病或失调的方法，包括将由权利要求20所述的方法产生的细胞群施用于有此需要的哺乳动物。24.—种用于检测具有Barrett食管的受试者的胃食管接合部的癌前病变中的肿瘤进展的生物标记物，其包括检测所述受试者中HER3的过表达。25.—种治疗已经损失抗HER3⑶4+Th1的患者的方法，包括向所述患者施用至少一个剂量的源自所述患者的单核细胞树突状细胞DC前体的抗原脉冲的DCl疫苗，所述患者的单核细胞树突状细胞前体用HER3MHCII类免疫原性肽进行脉冲，其中肽选自以下组成的组：pl2肽56-70:CEWMGNLEIVLTGHSEQIDN0:4;p81肽401-415:SWPPHMHNFSVFSNLSEQIDNO:5;p84肽416-430:TTIGGRSLYNRGFSLSEQIDNO:6;和p91肽451-465:AGRIYISANRQLCYHSEQIDNO:7及其任何组合。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述患者具有三阴性浸润性乳腺癌。27.—种检测患者中抗HER3⑶4+Thl损失的方法，包括：用HER3MHCII类免疫原性肽脉冲来源于所述患者的外周血单核细胞，其中所述肽选自以下组成的组：pl2肽56-70:CEWMGNLEIVLTGHSEQIDN0:4;p81肽401-415:SWPPHMHNFSVFSNLSEQIDNO:5;p84肽416-430:TTIGGRSLYNRGFSLSEQIDNO:6;和p91肽451-465:AGRIYISANRQLCYHSEQIDNO:7及其任何组合；和检测由此产生的免疫应答。28.根据权利要求27所述的方法，其中通过IFN-γELISpot测定法测量所述抗HER3⑶4Thl应答的检测。

百度查询： 布莱恩·J·赫尔尼奇 用于基于免疫的治疗的免疫原性MHCII类肽的鉴定

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