申请/专利权人：华中农业大学

申请日：2015-02-09

公开（公告）日：2019-04-02

公开（公告）号：CN105441456B

主分类号：C12N15/29(2006.01)I

分类号：C12N15/29(2006.01)I;C07K14/415(2006.01)I;C12N15/84(2006.01)I;A01H5/00(2018.01)I;A01H6/20(2018.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2021.01.15#未缴年费专利权终止;2016.04.27#实质审查的生效;2016.03.30#公开

摘要：本发明公开了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用，其步骤：A、利用该基因的CDS核苷酸序列，或启动子核苷酸序列，或者编码的氨基酸序列设计开发出能扩增出该基因的引物，合成。B、利用合成的引物，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因或任何感兴趣的一段核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。方法易行，操作简便，利用引物扩增该基因，将其克隆到各种载体中，转化到甘蓝型油菜可导致稳定彻底的雄性不育并进行育种利用，利用该基因本身的序列设计特异引物，用于分子标记辅助选择，具有快速，经济，有效和准确的特点。

主权项：1.一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，其CDS序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

全文数据：一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用技术领域本发明属于油菜分子育种技术领域。更具体涉及一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，同时还涉及一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的制备方法，还涉及一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的应用。本发明涉及的一个和雄性不育相关的复等位位点：Bnms4a为恢复基因，Bnms4b为不育基因，Bnms4c为空等位基因，其显隐性关系为：Bnms4aBnms4bBnms4c。不育基因Bnms4b的克隆、验证和应用不仅可以加快甘蓝型油菜的隐性细胞核雄性不育系和临保系的选育，而且以此为基础可以创建其他十字花科植物的核不育系统，例如，将不育基因Bnms4b转化到拟南芥中可以获得稳定的不育材料，并且这种不育材料可以被BnMs3稳定的恢复。背景技术油菜杂种优势利用关键在于优良的授粉控制系统和双亲之间是否可以获得具有一定生产潜力的杂交种。优良的授粉控制系统主要有雄性不育，自交不亲和，化学杀雄等。在甘蓝型油菜中以雄性不育应用得最为广泛。油菜雄性不育主要有细胞质雄性不育CMS和细胞核雄性不育GMS。目前，世界上用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统傅廷栋，杂交油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000，虽然波里马在目前的油菜育种应用中占有重要的地位，但是细胞质雄性不育的自身缺点并没有被完全克服，主要表型为育性受温度影响较大，不稳定，恢复系来源较为狭窄，容易产生不良的胞质负效应，制种风险较大，其应用受到了一定程度的限制。相对于油菜细胞质雄性不育系统，隐性细胞核雄性不育系统有诸多天生的优点，主要表现为败育彻底，育性稳定，恢复源广，无不良胞质负效应，且有的核不育类型能获得全不育制种群体而具有良好的应用前景。S45A潘涛等，1988和117A侯国佐等，1990是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有“蜀杂6号”、“蜀杂7号”、“油研7号”、“油研8号”和“油研9号”等，该系统主要缺点是不育系中存在50％的可育株，在制种时需要在初花期拔掉50％的可育株，由此不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。本课题组克隆了S45AB系统的恢复基因BnCYP704B1，并将该基因及其育种应用申请了专利保护涂金星等，2009，提出了利用花粉发育特异时期的启动子与致死基因Bax相连，再连恢复基因BnCYP704B1的智能核不育系统的创建思路：花药发育的时期，致死基因表达，将含有恢复基因BnCYP704B1的花粉粒杀死，存活的只有隐性不育的花粉粒，用来大面积繁殖不育系，获得100％的不育群体，为隐性核不育的育种应用提供了新的思路。另外，美国和加拿大利用烟草的TA29基因的启动子和核糖核酸水解酶barnase基因构建成融合基因转化甘蓝型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械化作业。但是该系统的不足之处是必须对不育系和恢复系都进行转基因，该系统目前也受到专利的保护。这些创新性的育种系统的构建，说明了隐性核不育在油菜育种中具有广阔的前景，也说明了隐性核不育是未来油菜育种的主导系统。另一种类型的隐性核不育系统主要有9012A陈凤祥等，1998和7365AHuangetal.,2007，它们均属于隐性上位互作核不育类型，Zu等2010通过定性的遗传分析和基因定位将它们的遗传模式修正为两个位点控制的复等位遗传模式，一个位点是BnMs3Bnms3，另一个位点是复等位位点Bnms4aBnms4bBnms4cXiaetal.,2012。本课题组克隆了BnMs3基因Dunetal.,2011,根据其拟南芥的同源基因将其命名为BnaC.Tic40，并申请了该基因以及其育种应用专利保护涂金星等，2011。由于该系统特殊的遗传模式，育种家可以直接将临保系与不育系杂交获得100％的全不育系群体，而不需要拔出50％可育株，大大节省了制种成本。用该系统选育的品种中，已审定的杂交种有“皖油14号”、“皖油18号”陈凤祥等，2002；2003和“沪油杂1号”孙超才等，2004等等，临保系的成功选育是油菜隐性核不育系统在育种研究领域取得的重大进展。但是这个系统遗传基础复杂、临保系选育困难，不利于选育强优势组合。克服这些缺点的可行性策略是建立不育恢复基因和上位基因的分子标记体系，进一步克隆Bnms4aBnms4bBnms4c这三个复等位基因，利用分子标记实现不育系和临保系的定向选择。同时，对这三个复等位基因的克隆，有助于更清楚地了解隐性核不育的机理，为更好地应用这一极具潜力的育种系统提供帮助。发明内容本发明的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，该基因来自于甘蓝型油菜，为一个细胞雄性核不育基因，可以使多种植物产生雄性不育的表型，该雄性不育具有败育彻底，无不良胞质负效应的特定，可以用于植物的杂种优势利用，利用Bnms4b基因使临保系基因型为Bnms3ms3ms4cms4c变为不育，或作为核不育系，恢复系和临保系选育的分子标记，以加快甘蓝型油菜核不育系和临保系的选育，或使用这两个基因构建其他十字花科植物的核不育系统，用于杂交育种。本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的制备方法，方法易行，操作简便，利用本发明保护的基因的序列可以直接设计克隆该基因的引物，实现快速制备克隆该基因的目的，具有经济，有效的特点。本发明再一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b在甘蓝型油菜的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，将该基因克隆到各种载体中，并加以利用，同时还可以利用该基因本身的序列设计特异引物，用于分子标记辅助选择，具有快速，经济，有效和准确的特点。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的制备方法，其步骤是：A、利用该基因的CDS核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，启动子核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，或者编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO.3设计开发出能扩增出该基因的引物，并送引物合成公司合成，或者合成探针。B、利用合成的引物，采用PCRpolymerasechainreaction技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。也可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。通过以上技术克隆了该基因，将该基因克隆到表达载体中，转化甘蓝型油菜7365C以及野生型Col-0型中均可以导致稳定彻底的雄性不育图7，图8，这种雄性不育可以被BnMs3恢复。这样的一个育性转换系统可以用于植物的杂种优势利用中。申请人通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到一种分离甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，其CDS序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。该基因的启动子序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。该基因编码的蛋白质，其序列为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCRpolymerasechainreaction技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。通过上述技术方案获得了二个核苷酸序列和一个氨基酸序列，将基因克隆到载体中获得含有该基因的遗传转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化将其转化到野生型Col-0型拟南芥和油菜7365C中，都可以获得雄性不育的表型图7和图8。该基因编码的蛋白质可能是通过引起绒毡层质体的功能异常，导致的雄性不育图9。一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b在甘蓝型油菜以及其他十字花科植物的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，其步骤是：A、本发明为甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良提供了新用途，利用该基因的CDS核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，启动子核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，或者编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO.3设计开发出能扩增出该基因的特异引物；B、进行分子标记辅助选择，其中包括作为恢复甘蓝型油菜核不育系的育性；C、导致临保系的不育，或作为新核不育系，恢复系与临保系选育的分子标记，或者设计引物扩增出该基因，将该基因克隆到表达载体中，进行不同植物的遗传转化，得到雄性不育的植株，构建核不育系统，用于杂交育种。其他作物包括利用Bnms4b可以导致雄性不育的其他十字花科植物：白菜，甘蓝，拟南芥，利用方式和甘蓝型油菜相同，都是利用其可以导致雄性不育的特点。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：根据本发明中报道的序列开发的引物，具有非常特异，以及准确的特点，由于不育基因即为Bnms4b，再利用该基因的序列进行的所有分子标记辅助选择，或者克隆该基因进行不育系统的创建都具有经济，快速，有效的特点。利用该发明保护的基因可以快速地使植物导致雄性不育，并且可以应用到杂交育种中去，免去了再杂交育种中要大面积大范围地寻找稳定彻底的雄性不育系的困难，可以随意创建植物的雄性不育系，对于那些还没有在自然界发现天然的雄性不育的植物来说，无疑是一项革命性的成果。由于其为细胞核雄性不育基因，且已经在拟南芥和油菜中可以导致完全彻底的雄性不育，因此利用它在其他十字花科植物的不育系统的创建将可以推动其他十字花科植物的杂交育种技术发展，为培育具有杂种优势的农作物产品提供很好的前提条件。附图说明图1为一种覆盖甘蓝型油菜核不育基因Bnms4区段的物理图谱。图示Bnms4b定位于7365A的N07染色体上，利用5050个单株将Bnms4b定位于左右最近的分子标记CL14和DD42锁定的82kb的范围内，括号里的数字代表着该标记的交换单株，数字越大，说明标记离基因越远，0表示没有交换，标记为共分离标记。下面一排为不同标记之间的物理距离。图2为一种用标记筛选BAC池中的单克隆菌落。模板为阳性克隆BAC池稀释一定倍数后长出的单克隆菌落，引物为共分离引物KZJ301。图3为一种将测序出来的B107和已知的同源BAC序列B80进行序列共线性比对。横纵坐标分别为B107和B80的98kb序列和93kb序列。图4为一种利用RACE技术得到候选基因CC2的基因结构图。图5为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b的构建图。图6为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b转化拟南芥后，阳性苗的筛选。红色圆圈里面为含有整合基因的阳性苗。图7为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b转化Col野生型拟南芥的雄性不育表型。a图为野生型拟南芥的开放的花；b图为转Bnms4b基因的拟南芥的开放的花；c图左边为可育的花蕾，右边为转Bnms4b的不育的花蕾；d图为去掉花被后的花蕾，左边为可育，右边为转Bnms4b的不育花蕾；e图为野生型拟南芥的成熟角果；f图为转Bnms4b的不育的角果；g为醋酸洋红染野生型花粉粒，h图为醋酸洋红染转Bnms4b的不育花粉粒。图8为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b转化甘蓝型油菜7365C的表型图。a为7365C可育植株的花序；b图为同一生长条件下的转基因油菜植株不育花序；c图左为正常的7365C的单株，叶片浓绿，c图右为转基因的油菜单株，叶片有不同程度的白化发生；d和e也说明了这一结果；f图左为正常的7365C植株，f图右为转基因植株的花蕾，表面有白色斑块；g图和h图为绿色叶片和白化叶片体视显微镜照相的结果；i图和j图为剥掉花被的7365C和转基因植株的花蕾。图9为一种利用拟南芥原生质体的Bnms4b编码蛋白质定位在质体中的示意图。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,1989中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。实施例1：不育基因Bnms4的精细定位和染色体着陆一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的制备方法，其步骤是：1.实验材料：用于Bnms4b基因图位克隆的近等基因系群体为7365AC，由7365AHuangetal.,TheorApplGenet.,2007,115:113-118与7365CXiaoetal.,2008，Euphytica,1642:377-384，然后与7365C回交，其后代出现了不育与可育的分离，高世代回交后兄妹交保存，该群体的可育和不育分离比为1：1，其中不育单株含有Bnms4b基因。2009年春天在武汉提取的近等基因系7365AC中的5050个可育与不育单株的DNA提取DNA的方法参见：StewartandVia,1993,145:748-749，用于基因的精细定位。2.不育基因Bnms4的精细定位：根据前面定位的结果，Bnms4b位于油菜N7连锁群的SCARSequencecharacterizedamplifiedregion标记P4和P7之间Xiaetal.,TheorApplGenet.,2012,1247:1193-1200。即Bnms4b位点位于P4和P7之间。设计的P4和P7引物的核苷酸序列如下所示：P4F正向引物AACTTCTCTCCTCTGCGTCG，P4R反向引物CCAGCTTCCAATCCGTAGAC；P7F正向引物TTGAAGGCGTGCTTGGAG，P7R反向引物TGACTTGGCAGCTTCTACGG。为了进一步缩小目标基因区域的范围，对Bnms4b进行精细定位，申请人根据目标区域的序列以公布的白菜的基因组序列为参考设计并鉴定出了Bnms4b的多态性的标记如图1。分子标记P4和P7在7365AC近等基因系群体的5050个单株中分别检测到15个和31个交换单株，这些单株在两个标记和Bnms4b基因间发生了重组图1。然后用其余的标记对交换单株进行分析，发现两侧最近的分子标记是标记CL14和DD42，两个标记分别有1个和3个单株在标记与Bnms4b间表现交换。通过以上精细定位，将Bnms4基因定位在以甘蓝型油菜的基因组序列为参考的82kb范围内，即分子标记CL14和DD42之间，将所有标记整合成Bnms4b的遗传连锁图谱如图1所示。用于精细定位Bnms4b的引物的核苷酸序列见表1所示。表1精细定位Bnms4b的引物的核苷酸序列P4FAACTTTCTCCTCTGCGCGP4RCCAGCTTCCATCCGTAGACDD35FCCATTGGAGATGACATGCTGDD35RTGTCGATTGGTCTAAGGCCDD24FCTTCGTTGTGCTTCCTGTCDD24RCACCGTCCGTCACAGATCTCL14FTAATGTGTTGACGGCTGAACCL14RTCGTGTCCATGCATATCZUHEFCGAGCGATCACTCATAATCAZUHE5RTAGTGGAGTTTCATGGCTAGDD28FAGCCGCTTGTTCGTACAGAGDD28RTCGTCGTCTGAATCGCTGTCSSR103FCATCCCCATGACGAATCCTTSSR103RAATCTTGTGCCAAAGCCTCG4F3DFCCGACAACCACTTAGGCTGT4F3DRGAGCTTCATGGACCAGGTTCDD20FACACGGAACTCAGACGCTATDD20RTGGCCTCTTAGACTCTCACADD42FGCAAATGTCGTCTCCTCATADD42RAGGGTTTCTAGGTTACGAAGSSR110FGATTACTTGAAAAGAGTCCCSSR110RAGCCATAGTAGCTTTGAGATS25FCATCCGAGAGAAGAGTAGAGS25RTACACAGGAGGTGATCTGAC引物名称中最后一个英文字母含义分别为：F为正向引物；R为反向引物。3.BAC文库的构建以及含Bnms4b的BAC克隆的筛选与测序：精细定位的结果显示Bnms4b基因定位在标记CL14和DD42之间，下一步即可将两个目标基因进行染色体着陆，即筛选含有目标基因的BAC克隆。将含有Bnms4b基因的油菜材料7365A，提取其暗光培养12-15天的幼嫩叶片的核DNA，超声波打断后连到特定载体上，构建出7365A的全基因组BAC细菌人工染色体，bacterialartificalchromosome,BAC文库构建方法，步骤和试剂见Luoetal.,2003，PlantFunctionalGenomics，236:3–19，本发明筛选到了1个含Bnms4b基因的BAC克隆B107图2。利用第二代测序技术将其测通，发现B107为98kb图3。从甘蓝型油菜中分离得到一种分离甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，其CDS序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，序列表SEQIDNO.1.分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的CDS核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不育株7365A。该基因的启动子其序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。序列表SEQIDNO.2.为分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b的启动子核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不育株7365A。该基因编码的蛋白质，其序列为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。序列表SEQIDNO.3.为分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不育株7365A。实施例2：不育基因Bnms4b的分离和功能验证一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b在甘蓝型油菜以及其他十字花科植物以拟南芥为例的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，其步骤是：1.Bnms4b候选基因的确定与拟南芥油菜转化实验本实施例中采用的序列比对的程序来自白菜Chiifu-401的基因组网站提供的Blasthttp:brassicadb.orgbradblastPage.php软件，对包含Bnms4b的BAC克隆B107的序列进行分析，从中预测了1个候选基因CC2。通过BAC序列比对分析其他同源基因的CDS序列初步确定候选基因CC2的ORF起始终止位点，开发引物扩增出目标基因的CDS序列，利用RACErapidamplificationofcDNAends技术得到CC2基因的5’UTR区域和3’UTR区域图4GeneRacerTMkit,Forfull-length,RNAligase-mediatedrapidamplificationof5’and3’cDNAendsRLM-RACE,Catalognos.L1500-01；L1500-02；L1502-01；L1502-02，来自Invitrogen公司。对CC2基因序列进行酶切位点分析，发现其可以不被KpnI和SalI酶切。设计扩增基因全长的引物CC2FR，左右引物分别加上SalI和KpnI的酶切位点，利用高保真PCR聚合酶PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerse,来自NewEnglandBiolads公司分离基因全长8164bp的序列，将扩增片段克隆到pCAMBIA2300华中农业大学作物遗传改良国家实验室林拥军教授赠送载体上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的融合质粒，并转化大肠杆菌DH5α购自北京全式金公司，在含有50μgml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是包含正确CC2全长的融合载体pC2300-CC2pCAMBIA2300+Bnms4b图5。将载体质粒通过电转化的方法转导GV3101农杆菌菌株中本实验室长期保存的菌株，在含有50μgml卡那霉素和50μgml庆大霉素的固体培养基上挑取单克隆，并进行PCR检测确认阳性克隆后，将该单克隆于-80℃保存起来，用于Col野生型拟南芥的遗传转化。构建的Bnms4b候选基因CC2全长载体用农杆菌花序蘸染法转化Col拟南芥野生型植株Zhangetal.,2006,NatureProtocols,1:641-646。在含25mgL卡那霉素的12MS培养基上筛选转化拟南芥植株的种子，抗性植株根长，子叶和真叶长势较大；非抗性植株根很短，植株矮小，子叶黄化图6。植株长到2-4片真叶后移植到土中培养，得到30多株抗性植株。提取阳性植株提取叶片总DNA制备方法见Stewartetal.,1993,145:748-749，用pCAMBIA2300载体上存在的NPT-II基因的CDS序列设计的引物NPT-F和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。这30多株经鉴定全部为阳性苗，并且全部表现为雄性不育图7，说明候选基因CC2就是Bnms4b基因，为不育基因。NPT-F正向引物:GCCACAGTCGATGAATCCAG，NPT-R反向引物:ATGGTGGAGCACGACACTCT；CC2F正向引物:GCGGTACCAACCGAACTTTCATATAATCCGAATGGGGC，CC2R反向引物:GCGTCGACATATCACCAGCACCAACAGTTTTCTTTTGC；为了验证CC2在油菜中的功能，将同样的载体pC2300-CC2转化到甘蓝型油菜7365C中。油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法陈苇等，2006；CardozaandStewart，2003。种子灭菌用70％浓度的酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，20％～30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于Medium0培养基配方见表2，于25℃暗培养5d。在超净工作台内将获得的试管幼苗下胚轴切成0.5cm-0.8cm的小段，接种至含有农杆菌悬浮过夜至对数生长期的Medium1上配方见表2浸染25min-30min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养2d。将外植体转到Medium2上的愈伤组织诱导培养基配方见表2上，于25℃光照培养21d。在将外植体转入Medium3上分化培养基培养，每15-18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长出生长点时，将幼苗生长点下端切断插入到Medium4生根培养基上培养。转化植株生根后，种植于混有腐殖土的细土纸杯中，保持70％相对湿度，待根发育稳定后移栽到大田。提取阳性植株提取叶片总DNA制备方法见：Stewartetal.,1993,145:748-749，用引物NPT-F和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T0代观察育性的表现，验证导入的候选基因的功能。结果显示在9株转基因T0代植株中，有6株表现为雄性不育图8。这6个植株同时伴随有叶片不同程度发黄的表型，该结果再次证实CC2基因就是Bnms4b基因。表2在遗传转化步骤中所用的各种培养基的配方实施例3：利用恢复基因BnMs3和不育基因Bnms4b构建十字花科植物以Col-0的野生型拟南芥为例的不育材料和对应的保持材料利用Bnms4b可以创建其他十字花科植物的细胞核雄性不育系统：白菜，甘蓝，拟南芥，利用方式和甘蓝型油菜相同，都是利用该基因可以导致稳定彻底的雄性不育的特点。BnMs3基因被本小组成员申请了专利保护涂金星等，2011，为7365A的恢复基因。结合此专利的成果，将含BnMs3基因的拟南芥转基因植株可育，父本和含Bnms4b基因的转基因植株不育，母本进行杂交，获得同时含有恢复基因BnMs3和不育基因Bnms4b的Col拟南芥材料，将这样的单株自交后，发现有育性分离的情况。将分离群体中的不育株和含有BnMs3的可育株杂交后继续出现育性分离，说明含有Bnms4b的拟南芥植株的不育性可以被含有BnMs3的拟南芥植株保持下来。在本发明所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本申请所附的权利要求书所限定的范围。SEQUENCELISTING华中农业大学一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用3PatentInversion3.114161DNA甘蓝型油菜1atgctcgctccccttaaggtcacagaaccgcagatggtcctattcaatatccatggaaca60cactcctcttcaccatttcctttctcccaccgctgcattcaaaatcgcaacttgagctcg120cgcaagccaagtttctacaattcaatggagctttgttcttcatcctcatcttctctcctc180cgcgtctcacacgaaaaactctccttctcttcctcaatctctcaatgccaactaaagccc240tcgactttcgccaaacccagactccgaatccacgcctccctcgcatccgagaagactcaa300ggcctcccacgagacagcccacaacgcctcctcaaggagctagctcagcgcaaacaatcc360accactccctccaagaagaaactccctcccaaacgcttcatcctaaggccgccactagac420gacaaaaaattagcagagaggttcctcaccagcccgcagctatctctaaagtccttccct480ttactcagctcgtgtctccctccttcaaacctcaactcctccgacaagacatggatcgac540gagtacctcctcgaagccaaacatgctttaggctactccctcgaaccttcctcgacctta600agcgacgagaatcctgctaagcattttgacacgcttctctatccttctccaactggtgtt660atgattgggcttgatctggcattcaatttgcattctgcctttggcaattggttcccaggt720tctaagcctcttcttgctcaagcgatgaacaagatcatgaagtctaatccagctctgtac780gtgttgagagagaggataaggaaagatttgcagttatactcgtctgtgcctgcagagccg840tatttgtcatctcaaaactatggtgaaatattcggcaatcaaatcatatggtttgtggat900gataccaatgtctatcgtgtcccaattcgcaagacttttgaaggcaatttgacaaccaag960ccaattaatggtgcgatcattattttcaatccaagaactgggcagctattcctaaaggtt1020atccatacaagcatcagtggtcagctagccaagtgcaaaacagctgaagaggtggctgca1080cttgtgcgctctctccctgttgaagaacagccaaacaagattattgctcataaaggaatg1140ctcgatccccttaaggtccacctgctggatttccccaacattgttatcaagggaagtgaa1200ctgcagcttctgttccaggcgtgctttaagattgagaaatttggtgatctgattttgaag1260gccacagaaccgcagatggtcctattcaatatctatgatgattggttaaagagcatctct1320tcgtacactgccttctcaagactcattctgatccttcgtgcgctttacgtgaataatgag1380aaggctaagatgttgttgaagcccgacaagtctgttgtcacggagccacatcacatctgg1440ccctctctcactgacgaccagtggatgaaggtggaggtagctcttagggatcttatccta1500tctgactatgcaaagaagaacaatgtgaatacctcagctctgacacaatcagagatcata1560gctgagattaccccaccctctcaacagctgcaacatatagctgggattgagaaacagcac1620gaaaaatcaaacaagaaccccattattgaccataaagaaggtgtactaccggtaatttgg1680gactatgaaaatacccctatacagcacggcatgaagactgcagtggccatagcgcacatc1740acatatgccttagagatgatcaactctgggccttacaaattctttgtttacctggcaagt1800ttcgcagtctctagaatcaatcgcgagcacgacatctttttcagaagaatgcatgaatct1860acagacgatgagtttcattaccatgcagtgtatgatagggaggaatatatttacttcaag1920agtgagtttgcagatttatctatcaagaattctatccaaaatcttattgaaagaatgatg1980gagggaagctatcaaggtaaaagtctgattttaatgtctggcgacggaggattcaggaaa2040ttagtggaccttctgagatcaaatgaaatggaagtgagcttcatcaagcctgcttcaaat2100gattgtgcttcactcacgagcgatgcgacgtctgtcagcttagacaccgttttcgctgga2160aatccaatctggcattgtgtattaaaaacaagatcacaaaggagaacagagagaagaaac2220gagaagaagaggattcgtgaactccaaaaggcgtccgtctctgagaagaagaggatccgt2280gaatccagctcgaggcctattgggaatgatgtgattggtattgatttgggaaccaccaat2340tcttgtgtagcagtgatggaaggaaagacccctagggttattgagaacgcagaaggaacg2400agaaccacaccatcagtgtttgctattaaccagaagggtgagtttctcgttggaacacca2460gctaaacgtcagggcgttaccaacccaacaggcacggtttccgggagcaagcgtttgatg2520gggagaggtttcgatgatccccagacgcagaaggagatgaaaatggttccttacaaaatt2580gttaaggcgccaaacggtgatgcttgggttgaagccaacgggcagaagttttctcccagc2640cagattagtgctaatatcctcaccaaaatgaaggagaccgctgaagcttacctcgggaaa2700accatcaccaaagctgttgttaccgttcctgcttacttcaatgatgcgcagaggcaagcc2760acaaaggatgctgggaaaatcgccggtcttgatgtccagagaatcatcaacgaaccaacg2820gctgctgccttgtcatatgggatgaacaataaggagggtgtgattgctgtcttcgatctt2880ggaggtggaaattttgatgtttctatcctggaaatctcaagtggtgtttttgaggtcaaa2940gcaacaaacggagatacgtttttgggaggagaagacttcgacaacactttgttggagtat3000ctggtttctgagttcaagagatcagacaacattgatctgaccaaggacaagctcgccctc3060cagaggctcagagaagctgctgagaaggcgaagatcgagctttcttccacatctcagacc3120gagatcaacctgcctttcatcaccacagatgattctggagagaagcacttgaacataacc3180ttaactaggtccaagtttgaagctttggtcagcaagttgattgagagaacaagaagcccg3240tgccaaaactgtctcaaggatgctggagtctcgattaaggaaatcgatgaggttcttctt3300gttggtggaatgacccgtgttcccaaagtgcaagatatagtctctgaaatctttggaaag3360agcccgtgcaaaggtgttaacccggatgaagcagttgccatgggagctgctattcaaggt3420ggtatcctccgtggtgatgtcaaagagttgctccttttggatgtgactcctctctcactc3480ggtattgagacacttggaggaatcttcactaggttgatcaaccgaaacaccaccatccca3540acaaagaagtctcatgttttctccacaactgcagacaaccaaatgcaagtgggaatcaaa3600gttcttcagggagagcgtgagatggcagctgacaacaaaagtctaggagaatttgatttc3660gttgggatcccacctgcgcctagaggaatgccccagatcgaagttacgttcgacattgat3720gcaaatggtgtcgtgactgtctcagccaaagacaaagcaacgggtaaagagaaacagatc3780acaatcagatcttcaggtgctctctcagacgatgagatcaacagaatggtgaaagaagct3840gagcttaactcgcacaaggatcaagagaagaagcaactgatcgaccttaggaacacagct3900gataccacgatctacagtgttgagaagagcttgcgtgagtacagagagaagattcctgct3960gagattgcctctgagattgaaactgcagtgtctgacctcaggactgcaatggctagtgaa4020gaaatcgaggacataaaggctaagattgaagctgcaaacaaggctgtgtcaaacattggt4080gaacacatgtccaatggatccagttcgtctggaaccactggtggtggtgaaggtgaaggt4140ccaagcggggcagacacctga416125000DNA甘蓝型油菜2tatgtttgcttattattcgcaggctgcttgtggtttaaagaagaaagaagagattgttga60tatcgactctgttgatgctaagaatgacctcgcagccgttgaatatgtggaagatatcta120cagcttctacaagtctgttgaggttagtacttaacttacttactcattcatgaatctttc180cttttgtgacattgtgttaatgaaacttgtataaacattggctgagtgaatggcgtccaa240ctgattacatgaggtcgcagcccgagattaacgaaaagatgagactgattctcgttgagt300ggttgatagatgtgtgcgtcagattcgagctaaacccggaaacgttttacctcaccgtta360acatcatggatcggtt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权利要求：1.一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，其CDS序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，其启动子序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。3.一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.权利要求1至3任一项所述的一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b在甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良中的应用。

百度查询： 华中农业大学 一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b及制备方法和应用

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