申请/专利权人：中国科学院武汉物理与数学研究所

申请日：2018-01-11

公开（公告）日：2019-07-19

公开（公告）号：CN110029127A

主分类号：C12N15/85(20060101)

分类号：C12N15/85(20060101);C12N15/66(20060101);C12N15/12(20060101);C12N7/01(20060101);G01N21/64(20060101);G01N1/28(20060101);G01N1/42(20060101);C12R1/93(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.10.31#发明专利申请公布后的驳回;2019.08.13#实质审查的生效;2019.07.19#公开

摘要：本发明公开了一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒及制备方法和应用，本发明制备的重组单纯疱疹病毒在HSV跨多突触环路示踪中荧光Timer随时间延长由绿色变为红色，为实时研究病毒跨突触示踪提供了时间维度上的重要考量，使得在不同时间感染病毒的神经元可通过其荧光色彩差异而得以区分，从而间接获得所标记神经网络与起始感染区域神经元的连接级数。本发明成功获得的携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒在时空维度上的神经环路标记、病毒感染细胞过程、动物感染模型建立、病毒复制与致病机理的分析、抗病毒药物筛选等方面具有广泛的应用价值。

主权项：1.一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的重组靶向载体，所述的靶向载体的序列为SEQIDNO.3所示。

全文数据：一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒及制备方法和应用技术领域本发明属于生物技术领域，一般涉及神经生物学及病毒学，更具体涉及一种携带荧光Timer基因可变色重组单纯疱疹病毒的构建、制备，以及该重组单纯疱疹病毒在时空维度上的神经环路标记、动物感染模型建立、病毒复制与致病机理的分析、抗病毒药物筛选等方面的应用。背景技术大脑是人体最复杂的器官，研究神经环路的结构是理解大脑工作机制以及治疗脑疾病的重要基础，相应就需要建立高效示踪神经环路结构的示踪工具及方法。传统的化合物示踪剂如FluoroGold、PHAL等只能标记局部神经元的形态，不能跨突触。近年来病毒示踪工具逐渐广泛的应用于神经环路示踪研究，此技术主要运用嗜神经病毒能感染神经元且复制的子代病毒能够跨突触感染相连神经元的特性，另外病毒在每一个神经元中能自我复制、信号不会衰减。目前常用的嗜神经病毒主要有来源于α疱疹病毒科的伪狂犬病毒Pseudorabiesvirus,PRV和单纯疱疹病毒Herpessimplexvirus,HSV以及棒状病毒科的狂犬病毒Rabiesvirus,RV，其它还有水疱性口炎病毒vesicularstomatitisvirus,VSV等，其中PRVBartha株和RV是逆向跨突触感染，VSV两个方向都可以传播。相对能特异顺行跨突触示踪的是HSV-1H129株，H129是从一个脑炎患者脑部分离的毒株，在啮齿类动物研究中H129是严格按顺向跨突触传播的，和神经冲动传递的方向一致，非常适合于标记输出神经网络。不过目前所有的跨多突触工具病毒标记并不能区分病毒每跨一级突触所需要的时间，为增加时间维度上的考量参数，我们设计将时间依赖可变色的荧光timer基因引入HSV工具病毒的构建，建立可随时间变色的单纯疱疹病毒应用于神经网络示踪。自1962年在水母中发现绿色荧光蛋白GFP，和其它类似的荧光蛋白迅速发展成为高效的分子marker得到广泛应用。GFP是一种酸性蛋白，呈球柱状结构，形似圆桶的外壳保护中心区域的发光基团。GFP或其变体都有一个由三氨基酸组成的内在发光基团。结构上11条β桶状结构绕成一个圆柱体，一条α螺旋缠绕在圆柱体轴位置，生色团附在α螺旋上包埋于中心。生色团的光谱特性与它的包埋方式相关。2013年俄罗斯科学家PletnevVZ等报道从脊索动物类文昌鱼分离到一种新型红色荧光蛋白lanceletredfluorescentprotein，laRFP具有一个新型的GYG发色团，并和临近的酪氨酸残基共价结合。lanRFP的激发光和发射光谱参数为λexλem＝521592nm，他们发现其更稳定的突变体laRFP-ΔS83是一种很独特的新型荧光Timer。文昌鱼来源荧光蛋白和传统的从刺胞动物如水母分离到的荧光蛋白在进化上相隔很远，序列同源度仅20％左右。我们设计将该新型荧光TimerlaRFP-ΔS83基因经密码子优化后构建到顺行跨突触示踪工具病毒HSV基因组，重组获得时间依赖、可变色的新型HSV工具病毒，将在神经环路解析、病毒感染细胞过程、动物感染模型建立、病毒复制动态分析、抗病毒药物筛选等方面具有广泛的应用价值和前景。发明内容本发明的目的在于提供了一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒，所述的重组单纯疱疹病毒利用靶向载体重组制备得到，所述的靶向载体的序列为SEQIDNO.3所示。本发明的目的在于提供了一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的构建方法。本发明的目的在于提供了携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的应用，该重组单纯疱疹病毒在时空维度上的神经环路标记、病毒感染细胞过程、动物感染模型建立、病毒复制动态分析、抗病毒药物筛选等方面具有广泛的应用价值。为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：本发明的设计思路为：HSV-1H129毒株为脑炎病人临床分离株，具有严格顺向跨突触传播的特性。不过目前HSV工具病毒的跨突触传播动态、每跨一级突触所需的时间都无法检测分析，因此我们设计构建可随时间变色的跨突触工具病毒，为实时研究病毒跨突触示踪提供了时间维度上的重要考量，使得在不同时间感染病毒的神经元可通过其荧光色彩差异而得以区分，从而间接获得所标记神经网络与起始感染区域神经元的连接级数。申请人设计将时间依赖可变色的文昌鱼来源的新型荧光Timer基因cmLaRFP-ΔS83经密码子优化、全长基因合成后构建到顺行跨突触工具病毒HSV基因组，重组获得时间依赖、可变色的新型HSV应用于神经网络示踪或其它相关研究。一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒，其制备过程包括下述步骤：1文昌鱼来源新型荧光Timer基因laRFP的密码子优化与基因合成文昌鱼来源的新型红色荧光蛋白laRFP的突变体laRFP-ΔS83是一种独特的新型荧光Timer基因，其序列见SEQIDNO.1。首先我们对laRFP基因序列进行了全长密码子优化codon-modifiedlaRFP,cmlaRFP，保证在哺乳动物细胞特别是神经元能得到高丰度表达及翻译后修饰成熟，优化后的cmlaRFP基因序列见SEQIDNO.2。cmLaRFP基因通过全长基因合成获得。2设计将Timer基因表达框重组插入HSV基因组UL37和UL38间隔序列中间，以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，克隆UL37及UL38基因同源臂序列；克隆的UL37及UL38基因同源臂片段分别通过HindIII、BamHI及BamHI、EcoRI酶切后连入pcDNA3.1+载体，命名为pH129UL37-38；UL37基因同源臂序列的扩增引物为：UL37-F：5'CCCAAGCTTGTCGGGATCAAACACGGCCACGTCC3'；UL37-R：5'GGCGGATCCACCGGTTAACAAGGACACTCACGCAAGGCGGAACC3'；UL38基因同源臂序列的扩增引物为：UL38-F：5'GGCGGATCCTGCAGGCGGGTCTTGCTAGGTCGCGATCTGG3'；UL38-R：5'GGCGAATTCCGGGTCAACGAACAACGAGTGACAG3'；3以FUGW质粒为模板，分别克隆hUbC启动子、WPRE片段；将克隆带有NheI、HindIII酶切位点的泛素启动子片段和带有XbaI、ApaI酶切位点的转录增强元件WPRE，经酶切连入pcDNA3.1+载体获得pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体；然后将cmLaRFP基因通过HindIII、EcoRI酶切位点连到hUbC和WPRE中间，构建获得pcDNA3.1-hUbC-cmLaRFP-WPRE表达框载体，所述的cmLaRFP基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；4将cmLaRFP表达框克隆入靶向载体设计引物从表达框载体pcDNA3.1-hUbC-cmLaRFP-WPRE中克隆整个cmLaRFP表达框片段，引物序列为ULaRFPWPA-F：5'CTGGTTAACGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGG3'；ULaRFPWPA-R：5'GTTCCTGCAGGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATG3'，PCR克隆获得hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA表达框大片段，通过HpaI和SbfI酶切位点连入载体pH129UL37-38，经酶切、测序证明靶向载体构建成功，命名为pH129UL37-38-hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA。5抽提靶向载体pH129UL37-38-hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA转染293T细胞并感染单纯疱疹病毒H129株，待细胞全部病变后收集细胞培养上清经过多轮挑斑纯化后获得重组病毒H129-hUbC-cmLaRFP-WPRE。一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的应用，包括利用该病毒在时空维度上的神经环路标记、研究病毒感染细胞过程、动物感染模型建立、病毒复制与致病机理的分析、抗病毒药物筛选等。以上所述的应用中，优选的，当用本发明提供的重组单纯疱疹病毒感染细胞时，细胞的固定液使用4％VV多聚甲醛；以上所述的应用中，优选的，利用其他荧光timer基因DsRed1-E5来替换SEQIDNO.3中的cmLaRFP基因从而获得携带其他荧光timer基因的可变色的重组单纯疱疹病毒，该病毒同样具备具有感染可视化、时间依赖可变色的特性。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：1.建立了灵活、高效的HSV重组病毒构建系统，通过克隆同源臂并引入多克隆位点接头，便于后续分子遗传操作插入大基因或多个转基因；2.本发明制备了一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒，其具有感染可视化、时间依赖可变色的特性，在神经网络结构示踪的同时引入时间维度上的考量；3.构建的新型重组病毒携带外源基因表达丰度高，用于神经环路示踪不用像先前病毒版本需做免疫组化放大信号，可直接镜检观察；4.本发明所用基因合成的cmLaRFP基因只是作为一个范式，因此还可用其它荧光timer基因例如从热带珊瑚中分离的荧光蛋白drFP583突变体E5，Clontech公司的DsRed1-E5基因等替代本发明的文昌鱼来源LaRFP基因构建时间依赖可变色的工具病毒。5.本发明获得的HSV工具病毒感染宿主范围广，所述的应用对象不仅限于啮齿类动物大、小鼠，还适用于斑马鱼、雪貂、树鼩、非人灵长类猴等动物的脑科学研究。附图说明图1为文昌鱼来源荧光Timer基因laRFP经密码子优化后cmlaRFP序列比对示意图；其中：laRFP：文昌鱼来源的荧光Timer基因lanceletredfluorescentprotein,laRFP；cmlaRFP：密码子优化condon-modified后的laRFP基因。图2为携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的制备及感染细胞变色情况示意图；图2中A：重组单纯疱疹病毒分子遗传改造示意图；图2中B和C：携带cmlaRFP基因表达框的靶向载体转染细胞基因表达及变色情况；B，转染后24小时观察；C，转染后48小时镜检观察；图2中D：重组单纯疱疹病毒的筛选、挑斑纯化；图2中E：携带荧光Timer基因可变色的HSV重组病毒感染BHK细胞荧光表达及变色情况感染后3天。图3为新型可变色重组单纯疱疹病毒rH129-hUbC-cmLaRFP-WPRE感染BHK细胞后固定的方法选择示意图；图3中A：可变色重组单纯疱疹病毒按MOI＝0.1感染BHK细胞，2天后分别选择用4％VV多聚甲醛或甲醇丙酮1：1固定液固定感染后细胞，在固定后不同时间点荧光显微镜100ms曝光成像；A为加完固定液后立即镜检，发现甲醇丙酮固定细胞后Timer荧光立即完全消失；图3中B：为感染细胞固定5min后100ms曝光成像；图3中C：为感染细胞固定30min后100ms曝光成像，发现4％VV多聚甲醛固定HSV-cmLaRFP感染的细胞荧光强度虽有一定下降，不过能一直较好的保持变色的荧光。图4为携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒示踪解析小鼠丘脑网状核RT的输出神经网络示意图；图4中A为重组单纯疱疹病毒立体定位注射位点示意图；取300nl表达荧光Timer的重组单纯疱疹病毒病毒滴度是2×109PFUml立体定位注射小鼠丘脑网状核RT脑区，感染3天后灌流切片成像；图4中B为重组单纯疱疹病毒标记的注射部位神经元及变色情况；图4中C为重组单纯疱疹病毒标记的对侧海马DG区神经元及变色情况；图4中D为重组单纯疱疹病毒标记的基底脑区神经元及变色情况。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：文昌鱼来源新型荧光Timer基因laRFP的密码子优化与基因合成2013年俄罗斯科学家从文昌鱼分离到一种新型红色荧光蛋白laRFP，其突变体laRFP-ΔS83是一种独特的新型荧光Timer基因，其序列见SEQIDNO.1。我们设计将该新型荧光Timer基因构建到顺行跨突触示踪工具病毒单纯疱疹病毒基因组，重组获得时间依赖、可变色的新型HSV工具病毒。构建靶向载体前，首先分析lanRFP-ΔS83原始基因序列，由于文昌鱼属于脊索动物，和高等哺乳动物在进化上遗传距离较远，我们对laRFP基因序列进行了全长密码子优化codon-modifiedlaRFP,cmlaRFP，保证在哺乳动物细胞特别是神经元能得到高丰度表达及翻译后修饰成熟，优化后的cmlaRFP基因序列见SEQIDNO.2。本发明所用cmLaRFP基因由生工生物工程上海股份有限公司合成。文昌鱼来源荧光Timer基因密码子优化前lanRFP与优化后CodonmodifiedlanRFP,cmlaRFP碱基序列比对见图1。实施例2：同源臂克隆及含cmlanRFP的靶向载体构建①同源臂克隆：抽提纯化HSV-1H129病毒基因组DNA，以其为模板，克隆UL37基因同源臂序列1460bp，所用引物为UL37-F：5'CCCAAGCTTGTCGGGATCAAACACGGCCACGTCC3'；UL37-R：5'GGCGGATCCACCGGTTAACAAGGACACTCACGCAAGGCGGAACC3'引入BamHI、AgeI、HpaI内切酶位点；克隆UL38基因同源臂序列1506bp，所用引物为UL38-F：5'GGCGGATCCTGCAGGCGGGTCTTGCTAGGTCGCGATCTGG3'引入BamHI、SbfI、NruI内切酶位点；UL38-R：5'GGCGAATTCCGGGTCAACGAACAACGAGTGACAG3'；克隆的UL37及UL38基因同源臂片段分别通过HindIII、BamHI及BamHI、EcoRI酶切后连入pcDNA3.1+载体，命名为pH129UL37-38，其中同源臂中间引入一个多克隆位点，即HpaI、AgeI、BamHI、SbfI、NruI多个酶切位点，便于后续的分子克隆实验，经测序验证该分子构建完全正确。②Timer基因cmLaRFP表达框构建：Timer基因cmLaRFP表达框选择由强的人泛素启动子hUbC驱动，后面引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE增强基因表达；以FUGW质粒为模板，分别克隆hUbC启动子所用引物为hUbC-FNheI：CTAGCTAGCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCG；hUbC-RHindIII：CGCAAGCTTGTCTAACAAAAAAGCCAAAAACGGC；克隆WPRE片段设计引物为WPRE-FXbaI：TGCTCTAGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTG；WPRE-RApaI：AAAGGGCCCTGCGGGGAGGCGGCCCAAAGGGAGATC；将克隆带有NheI、HindIII酶切位点的泛素启动子hUbC片段和带有XbaI、ApaI酶切位点的转录增强元件WPRE，经酶切连入pcDNA3.1+载体获得pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体；然后将Timer基因cmLaRFP通过HindIII、EcoRI酶切位点连到hUbC和WPRE中间，所用引物为cmLaRFP-FHindIII：CCCAAGCTTACCGGTGCCACCATGCCCCTGCCCGCCACCCACGACC；反向引物cmLaRFP-REcoRI：CCGGAATTCTCAGGCGATGTCCTGGAAGGCCTTC；构建获得pcDNA3.1-hUbC-cmLaRFP-WPRE表达框载体，经测序验证完全正确。③将cmLaRFP表达框克隆入靶向载体：设计引物从表达框载体pcDNA3.1-hUbC-cmLaRFP-WPRE中克隆整个cmLaRFP表达框片段，引物序列为ULaRFPWPA-FHpaI：5'CTGGTTAACGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGG3'；ULaRFPWPA-RSbfI：5'GTTCCTGCAGGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATG3'。PCR克隆获得hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA表达框大片段，通过HpaI和SbfI酶切位点连入前期构建好的靶向载体pH129UL37-38，经酶切、测序证明靶向载体构建成功，命名为pH129UL37-38-hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA。靶向载体分子构建示意图见图2中A，载体全长11145bp，其全序列见SEQIDNO.3。实施例3：携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的重组及纯化①病毒的重组：抽提靶向载体pH129UL37-38-hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA采用脂质体转染的方法转染293T细胞，6小时更换含2％FBS的维持培养基并加入单纯疱疹病毒H129株进行感染；在不同时间观察荧光的表达和细胞病变情况，待细胞全部病变后收集细胞培养基上清置于-80℃冰箱。②病毒的纯化：将收集的病毒上清经三次反复冻融、6500g离心10分钟去净细胞碎片，吸取10μl病毒上清感染Vero细胞，1天后观察感染细胞有无荧光表达来确定新型病毒是否重组成功；后期取重组成功的病毒上清连续10倍梯度稀释后感染Vero细胞，吸附1小时后铺琼脂含5％胎牛血清的DMEM培养基和2％琼脂1：1混合。48-72hr后待病毒斑形成后，在倒置荧光显微镜下进行挑斑；新型重组病毒经过6轮的挑斑纯化将野生型病毒去除，获得纯化的新型重组病毒H129-hUbC-cmLaRFP-WPRE。实施例4：携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的扩大培养和浓缩非洲绿猴肾上皮Vero细胞系用于增殖HSV病毒。培养传代比例为1：3。细胞培养条件：含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基，病毒重组制备及扩增用含2％FBS的维持培养基；37℃、5％CO2的培养条件下进行培养。HSV重组病毒H129-hUbC-cmLaRFP-WPRE以MOI＝0.01接种感染Vero细胞，观察感染细胞全部表达荧光、约24-48小时后待细胞变圆后收集细胞上清，置于-80℃冰箱暂存；浓缩前6500g离心10分钟去除细胞碎片，经0.45μm滤膜过滤后50000g离心3hr，病毒沉淀重悬后再经20％蔗糖溶液50000g离心3hr，去上清、小心重悬病毒后少量多管分装、置于-80℃冰箱保存，避免反复冻融。实施例5：携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒感染细胞能高效表达timer荧光并变色携带荧光Timer基因可变色的重组HSV中cmLaRFP基因由广谱强效的泛素启动子hUbC驱动表达，并引入转录后调控元件WPRE来促进荧光Timer基因的高效表达。实验发现将靶向载体pH129UL37-38-hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA采用脂质体转染的方法转染293T细胞，1天后cmLaRFP基因首先表达强的绿色荧光，并开始有少量细胞变色显示红色荧光；第二天观察到强的红色荧光、并和绿色荧光共标；后面随时间延长红色荧光继续加强、而绿色逐渐消减见图2中B，C；相类似，挑斑纯化后的携带表达cmlaRFP的重组HSV感染细胞后首先表达绿色荧光，随着时间延长由绿色逐渐转变为红色荧光，到感染后第三天反转为主要显示红色荧光，而绿色荧光逐渐变弱见图2中E。以上结果说明携带荧光Timer基因的重组HSV感染细胞能高效表达timer荧光并实现随时间变色。实施例6：携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒感染细胞后的固定方法选择为摸索选择何种固定液能更好保持携带荧光Timer基因的重组单纯疱疹病毒感染细胞表达的可变荧光，将重组单纯疱疹病毒H129-hUbC-cmLaRFP-WPRE按MOI＝0.1感染BHK细胞，2天后分别选择用4％VV多聚甲醛或甲醇丙酮1：1固定液固定感染后细胞，4℃放置；在固定后不同时间点荧光显微镜100ms曝光成像。结果见图3，A为加完固定液后立即镜检，发现甲醇丙酮固定细胞Timer荧光立即完全消失，而多聚甲醛固定虽荧光有所减弱，相对能更好的保持绿色及红色荧光；B为感染细胞固定5min后100ms曝光成像；C为感染细胞固定30min后100ms曝光成像，整体看4％VV多聚甲醛固定H129-hUbC-cmLaRFP-WPRE感染的细胞荧光强度虽有一定下降，不过能一直较好的保持变色的荧光，而甲醇丙酮1：1固定液不能用于表达可变色荧光细胞的固定实验。实施例7：携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒在时空维度上解析脑神经环路中的应用，其步骤如下：精确量取300nl实施例4制备的表达荧光Timer的重组单纯疱疹病毒病毒滴度是2×109PFUml立体定位注射小鼠丘脑网状核RT脑区；感染3天后麻醉动物，分别用0.9％VV生理盐水灌流，然后用4％VV多聚甲醛灌流；取出脑组织浸泡于4％VV多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％VV蔗糖溶液中1天，接着置于30％VV蔗糖溶液中2天；切片前将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。结果如图4所示，丘脑网状核注射部位附近可见有很多神经元被绿色荧光标记、这些神经元同时能检测到红色荧光，说明动物活体标记后HSV携带的荧光Timer基因能够有效表达、并随时间变色，检测时共标显示黄色图4中B。图4中C显示对侧海马DG区神经元被timer荧光蛋白标记并有效变色，共标后显示黄色；而基底核团标记到的神经元只观察到绿色荧光，没有红色荧光，初步说明这些神经元受丘脑网状核核团神经元调控、不过连接层级相对离得较远。可见通过H129-hUbC-cmLaRFP-WPRE顺行跨多突触示踪可以实现分析全脑所标记核团神经元与注射部位Starter细胞间的投射连接远近。序列表中国科学院武汉物理与数学研究所一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒及制备方法和应用一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒及制备方法和应用13SIPOSequenceListing1.01660DNA人工序列ArtificialSequence1atgcctctcccagcaacccacgatttacacatctccggctcaatcaatggacatgagttt60gacttggaaggcagtggcaagggcaatgcaaaagaaggttatcaggagctccacctaaag120tccaacaagggtgacctgtcattctccccctggatcctggtcccaaacatcggctacggc180ttctaccagtacctgcccttccccgacggagcgatgtcgccttaccaggccgccatgcac240gatggcggatacgtgatgcatcgttcaatgcagtttgaggatggtgccatgctgcattca300gaccaccgctacatctataagggaaaccatatcaaaggagagtttcggctgaccggaagc360ggtttccctgctgacggccctgtgatgaccaactcgctgaccgctgcggactggtgcgtc420gacaagctgctgtacccaaacgacaacaccataatcggcaaattcgactggacctacacc480actaccagtggcaagcgctaccaaagtgatgtgcagaccaacgtcacatttggcaagcca540atagcggccgacattttgaagaagcagccaatgttcgtgttccgcaaggtggaactcaag600cacaccaagactgagctcaacttcaagcagtggcagaaggcattccaggacatcgcctga6602660DNA人工序列ArtificialSequence2atgcccctgcccgccacccacgacctgcacatcagcggcagcatcaacggccacgagttc60gacctggagggcagcggcaagggcaacgccaaggagggctaccaggagctgcacctgaag120agcaacaagggcgacctgagcttcagcccctggatcctggtgcccaacatcggctacggc180ttc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权利要求：1.一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的重组靶向载体，所述的靶向载体的序列为SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述的靶向载体的制备方法，包括：（1）以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，克隆UL37及UL38基因同源臂序列；克隆的UL37及UL38基因同源臂片段分别通过HindIII、BamHI及BamHI、EcoRI酶切后连入pcDNA3.1+载体，命名为pH129UL37-38；UL37基因同源臂序列的扩增引物为：UL37-F：5'CCCAAGCTTGTCGGGATCAAACACGGCCACGTCC3'；UL37-R：5'GGCGGATCCACCGGTTAACAAGGACACTCACGCAAGGCGGAACC3'；UL38基因同源臂序列的扩增引物为：UL38-F：5'GGCGGATCCTGCAGGCGGGTCTTGCTAGGTCGCGATCTGG3'；UL38-R：5'GGCGAATTCCGGGTCAACGAACAACGAGTGACAG3'；（2）以FUGW质粒为模板，分别克隆hUbC启动子、WPRE片段；将克隆带有NheI、HindIII酶切位点的泛素启动子片段和带有XbaI、ApaI酶切位点的转录增强元件WPRE，经酶切连入pcDNA3.1+载体获得pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体；然后将cmLaRFP基因通过HindIII、EcoRI酶切位点连到hUbC和WPRE中间，构建获得pcDNA3.1-hUbC-cmLaRFP-WPRE表达框载体，所述的cmLaRFP基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；（3）将cmLaRFP表达框克隆入靶向载体设计引物从表达框载体pcDNA3.1-hUbC-cmLaRFP-WPRE中克隆整个cmLaRFP表达框片段，引物序列为ULaRFPWPA-F：5'CTGGTTAACGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGG3'；ULaRFPWPA-R：5'GTTCCTGCAGGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATG3'，PCR克隆获得hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA表达框大片段，通过HpaI和SbfI酶切位点连入载体pH129UL37-38，经酶切、测序证明靶向载体构建成功，命名为pH129UL37-38-hUbC-cmLaRFP-WPRE-PA。3.利用权利要求1所述的靶向载体制备的重组单纯疱疹病毒。4.权利要求1所述的重组靶向载体或权利要求3所述的重组单纯疱疹病毒的应用；所述的应用包括：制备时空维度上的神经环路示踪病毒、研究病毒感染细胞过程、建立重组病毒感染动物模型、病毒复制动态分析或制备筛选抗病毒的药物制剂。5.一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒的靶向载体，所述的靶向载体通过将荧光timer基因DsRed1-E5或其变体，或其它来源的荧光timer基因替换SEQIDNO.3中的cmLaRFP基因得到，所述的cmLaRFP基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。6.利用权利要求5所述的靶向载体制备的重组单纯疱疹病毒。

百度查询： 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种携带荧光Timer基因可变色的重组单纯疱疹病毒及制备方法和应用

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