申请/专利权人：浙江省农业科学院

申请日：2016-03-31

公开（公告）日：2019-07-26

公开（公告）号：CN105755039B

主分类号：C12N15/84(20060101)

分类号：C12N15/84(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/46(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.07.26#授权;2016.08.10#实质审查的生效;2016.07.13#公开

摘要：本发明公开了一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，从水稻基因组中克隆OsMADS7基因的特异性干扰片段，利用水稻谷蛋白基因的启动子构建胚乳特异性干扰载体，通过根癌农杆菌介导方法，将干扰载体转入水稻基因组中，并对转基因植株进行基因表达鉴定和表型分析。本发明的有益效果为：本发明成功获得了一个高温响应的转录因子OsMADS7，野生型水稻品种中该基因的表达可以受高温诱导，通过胚乳特异性干扰OsMADS7的表达，我们发现转基因水稻株系的直链淀粉含量对高温具有更强的耐受性，且不影响水稻的其它重要农艺性状，从而为人们有效维持高温下稻米的品质提供了一定的有效途径，填补相关领域的技术空白。

主权项：1.一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，其特征在于:从水稻基因组中克隆OsMADS7基因的特异性干扰片段，利用水稻谷蛋白基因的启动子构建胚乳特异性干扰载体，通过根癌农杆菌介导方法，将干扰载体转入水稻中，并对转基因植株进行基因表达鉴定和表型分析；具体包括以下步骤：1根据OsMADS7基因的序列设计引物，扩增该基因的特异性干扰片段；特异性干扰片段利用引物对MADS7C2-F6和MADS7C2-R6进行PCR扩增获得；MADS7C2-F6的序列为ACTACTAGTGTCGACATTCATCCCTGAAGCACGTC，MADS7C2-R6的序列为TCTGAGCTCCTGCAGGTGGATGGAAGAACCCATTG；2利用水稻谷蛋白基因GluC的启动子构建OsMADS7基因的胚乳特异性干扰载体GlucP-MADS7-RNAi；具体为：利用引物对GluCp-1F和GluCp-1R进行PCR扩增，获得GluC的启动子；利用HindIII和PstI酶切位点将GluC启动子连入pCAMBIA1301表达载体；利用SacI和PstI酶切位点将载体PTCK303的水稻内含子RiceIntron移入经前面步骤改造后的pCAMBIA1301表达载体获得胚乳特异性干扰载体GlucP-RNAi；GluCp-1F的序列为GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG，GluCp-1R的序列为ACGCCTGCAGAGTTATTCACTTAGTTTCCC；分别利用上游的SalI和PstI酶切位点，以及下游的SacI和SpeI酶切位点将上一步获得的OsMADS7特异性干扰片段分别正向和反向连入胚乳特异性干扰载体GlucP-RNAi获得OsMADS7胚乳特异性干扰载体GlucP-MADS7-RNAi；3通过根癌农杆菌介导遗传转化方法，将干扰载体转入水稻中；4通过分子标记和RT-PCR方法对水稻的基因型和基因表达进行鉴定；5利用蛋白酶消化和紫外分光光度测定方法对高温处理的稻米进行淀粉纯化和直链淀粉含量测定；通过表型分析选择获得直链淀粉含量对高温具有强耐受性，且结实率未受明显影响的转基因水稻株系。

全文数据：胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法技术领域本发明属于植物基因工程领域，具体的说是一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法。背景技术生产实践和研究结果表明水稻灌浆期遇到环境高温，稻米的产量和品质均会受到严重影响。高温敏感品种，尤其是一些品质优良的粳稻品种，在高温的影响下稻米直链淀粉含量会发生明显下降，同时还会伴随垩白率的明显上升，这不仅导致稻米品质明显变差，而且稻米的出精率也会出现显著下降，从而降低水稻产量。鉴定与高温影响稻米品质相关的功能基因，利用基因工程技术改变目标基因的表达模式，可以快速提高现有优质品种稻米品质对高温的耐受性。提高稻米品质对高温的耐受性不仅可以降低已有种植区域内高温对稻米品质的破坏作用，而且可以推动北方优质粳稻品种向南扩散，从而为扩大我国优质大米的生产提供可能。高温对稻米品质的影响机制尚不明确。α-amylase基因是一类淀粉水解酶，芯片和定量表达分析结果表明田间和试验环境下Amy1A、Amy3D和Amy3E等淀粉水解酶基因表达均明显受高温诱导Yamakawa等2007。利用转基因技术，人们发现下调α-amylase基因的表达可大大减少高温下稻米的垩白度Hakata等2012，由此表明利用转基因技术对个别重要基因的表达进行调控确实可以提高稻米垩白度对环境高温的耐受性。淀粉合成基因GBSSI是控制稻米直链淀粉含量的重要基因。研究结果表明水稻灌浆结实期受高温胁迫后，GBSSI基因的表达会出现明显的抑制Jiang等2003；Yamakawa等2007；钟连进等2012，因此高温下GBSSI基因的表达下调可能是稻米直链淀粉含量下降的主要原因。利用组成性强启动子过表达GBSSI基因后，稻米的直链淀粉含量会发生剧烈的升高30％，Itoh等2003；而GBSSI基因的表达缺失则造成稻米直链淀粉含量的急剧下降5％,Hori等2007。由于优质稻米要求适中的直链淀粉含量17～25％，因此到目前为止人们尚未找到有效降低高温影响稻米直链淀粉含量的基因或方法。发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，本发明涉及利用转基因技术对高温响应的转录因子基因OsMADS7LOC_Os08g41950进行胚乳特异性干扰后，灌浆期稻米直链淀粉含量对高温的耐受性明显增强。本发明要解决的问题是鉴定一个水稻中与高温影响稻米直链淀粉含量相关的功能基因OsMADS7，通过转基因技术特异性地抑制OsMADS7在水稻胚乳中的表达，从而有效降低高温对稻米直链淀粉含量的破坏作用。本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，从水稻基因组中克隆OsMADS7基因的特异性干扰片段，利用水稻谷蛋白基因的启动子构建胚乳特异性干扰载体，通过根癌农杆菌介导方法，将干扰载体转入水稻基因组中，并对转基因植株进行基因表达鉴定和表型分析。本发明包括以下步骤：1根据OsMADS7基因的序列设计引物，扩增该基因的特异性干扰片段；2利用水稻谷蛋白基因GluC的启动子构建OsMADS7基因的胚乳特异性干扰载体GlucP-MADS7-RNAi；3通过根癌农杆菌介导遗传转化方法，将干扰载体转入水稻基因组中；4通过分子标记和RT-PCR等方法对水稻的基因型和基因表达进行鉴定；5利用蛋白酶消化和紫外分光光度测定等方法对高温处理的稻米进行淀粉纯化和直链淀粉含量测定；通过表型分析选择获得直链淀粉含量对高温具有强耐受性，且结实率未受明显影响的转基因水稻株系。本发明的具体实施步骤如下：一水稻胚乳中的OsMADS7表达受高温诱导。水稻开花3天后，我们对野生型水稻品种进行高温白天35℃，12小时光照；晚上28℃，12小时黑暗处理，并设置常温对照白天28℃，12小时光照；晚上22℃，12小时黑暗。待开花6、9和15天时，取发育中的种子进行基因表达分析。提取胚乳RNA，并用RT-PCR的方法鉴定OsMADS7基因在不同处理温度下的表达差异。结果表明与常温环境相比，高温下胚乳中OsMADS7的表达明显升高图1，由此推测OsMADS7可能参与高温对稻米品质形成的调控。二水稻OsMADS7组成型干扰材料Ubi-OsMADS7-RNAi的获得及高温处理。本研究中OsMADS7组成型干扰水稻材料由中科院北京植物所赠与，并从未使用过该材料进行高温及稻米品质相关方面的研究。驱动干扰的组成型启动子为玉米的Ubi启动子，转基因受体水稻品种为粳稻品种中花11ZH11。基因表达鉴定结果表明该材料水稻胚乳中OsMADS7的表达被明显抑制。具体实验过程如下：水稻材料OsMADS7-RNAi和野生型对照ZH11抽穗前种植于实验田，待水稻抽穗后移栽到花盆里，并将开花后的水稻进行标记。待开花3天后将转基因水稻植株转入温室进行高温处理，同时设置常温对照。处理6天后，也即开花9天时进行取样，用于基因表达分析。结果表明高温和常温环境下干扰植株胚乳中OsMADS7的表达均非常低图2A，明显低于野生型。三组成型下调OsMADS7基因的表达可减小高温下稻米直链淀粉含量的下降幅度。上述OsMADS7组成型干扰材料及其对照野生型种子成熟后，我们对高温和常温条件下生长的稻米品质进行处理和分析。直链淀粉含量测定结果表明野生型水稻ZH11高温条件下直链淀粉含量明显下降，而转基因植株种子直链淀粉含量的下降幅度明显减小图2B，由此说明OsMADS7表达的下调可以抑制高温下稻米直链淀粉含量的下降。四组成型干扰OsMADS7的表达影响水稻在高温环境下的育性。对野生型粳稻ZH11进行穗期高温处理，结果表明ZH11对穗期高温极为敏感，高温下结实率明显下降图2C。对组成型干扰OsMADS7表达的转基因材料进行高温处理，发现高温条件下转基因株系的结实率比其对照ZH11更低，而且高温下直链淀粉的改善程度与其高温下结实率下降程度呈负相关。这一结果表明通过组成型干扰OsMADS7的表达，严重影响水稻结实率，不利于生产上的应用。五水稻OsMADS7胚乳特异性干扰材料Gluc-MADS7-RNAi的获得。本研究中OsMADS7胚乳特异性转基因干扰材料由本实验室完成。具体实验过程如下：1根据水稻OsMADS7的基因序列，通过比对选定特异性干扰序列cDNA,502-742。2以胚乳中谷蛋白GluC，LOC_Os02g25860启动子构建OsMADS7胚乳特异性转基因干扰载体。3采用农杆菌介导方法转化水稻，所用受体亲本为日本晴NIP。4转基因材料T1代进行高温处理和基因表达鉴定，获得胚乳中OsMADS7基因的表达明显下调的转基因植株图3A。六胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达水平同样可抑制高温下稻米直链淀粉含量的下降。胚乳特异性干扰材料及其对照野生型NIP种子成熟后，我们对高温和常温条件下生长的稻米品质进行处理和分析。直链淀粉含量测定结果表明野生型水稻品种NIP高温条件下直链淀粉含量也明显下降，与粳稻品种中花11类似图3B；同时OsMADS7胚乳特异性干扰材料与NIP相比，直链淀粉含量的下降幅度明显减小，而且大部分转基因株系的改善幅度优于组成型干扰材料图3C。由此表明胚乳特异性下调OsMADS7的表达同样可以抑制高温下稻米直链淀粉含量的下降，且效果比组成型干扰的更好。七OsMADS7胚乳特异性干扰转基因材料孕穗期的高温处理，结果表明尽管个别株系结实率较差，但是干扰植株稻米直链淀粉含量的改善程度和水稻结实率的改变之间无相关性。因此，通过筛选我们成功获得了高温下稻米直链淀粉含量相对稳定且结实率与野生型相近的转基因株系图3C和3D，为生产上利用该基因改善高温下稻米食用品质提供了可能。本发明的有益效果为：本发明成功获得了一个高温响应的转录因子OsMADS7，野生型水稻品种中该基因的表达可以受高温诱导，通过胚乳特异性干扰OsMADS7的表达，我们发现转基因水稻株系的直链淀粉含量对高温具有更强的耐受性，且不影响水稻的其它重要农艺性状，从而为人们有效维持高温下稻米的品质提供了一定的有效途径，填补相关领域的技术空白。附图说明图1.常温和高温条件下水稻胚乳中OsMADS7的表达。DAP6，9，15表示水稻开花后第6，9，15天，R和H分别代表常温和高温，结果表明日本晴胚乳中OsMADS7的表达明显受高温诱导。图2.Ubi启动子驱动的组成性干扰OsMADS7表达转基因材料的基因表达鉴定和高温处理后的表型分析。A为第3个转基因株系水稻胚乳中OsMADS7的表达鉴定结果，结果表明转基因株系中OsMADS7的表达明显被抑制；B为稻米直链淀粉含量对高温的耐受性比较结果，DD-value为将对照亲本日本晴的直链淀粉含量归零后，高温下转基因株系所得差值与常温下比较后所得到的双差值，双差值越大表明稻米直链淀粉含量对高温的耐受性越强，结果表明3个转基因株系稻米直链淀粉含量对高温的耐受性均强于野生型对照中花11ZH11；C为第3个转基因株系孕穗期高温处理后的2次重复所得结实率统计结果n＝5，结果表明高温下转基因株系的结实率明显低于野生型对照。图3.谷蛋白基因GluC启动子驱动的胚乳特异性转基因干扰材料的基因表达鉴定和表型分析。A为5个独立转基因株系和野生型对照日本晴NIP胚乳OsMADS7的表达鉴定结果，结果表明转基因株系中OsMADS7的表达均明显被抑制；B为转基因株系和亲本对照CK经过高温处理HT和常温环境RT下的稻米直链淀粉含量测定结果。C为稻米直链淀粉含量对高温的耐受性比较结果，结果表明5个转基因株系均在不同程度上提高了稻米直链淀粉含量对高温的耐受性。D为5个转基因株系孕穗期和野生型对照日本晴高温处理后结实率统计结果n＝5，结果表明高温下稻米直链淀粉含量对高温的耐受性最强的转基因株系M7142的结实率与野生型无显著性差异。具体实施方式下面将结合附图对本发明做详细的介绍：1.水稻材料水稻Oryzasativa野生型材料为粳稻品种中花11ZH11和日本晴NIP。高温温室设置为白天35℃，12小时光照；晚上28℃，12小时黑暗。常温对照设置为白天28℃，12小时光照；晚上22℃，12小时黑暗。开花后第9天，也即温度处理6天后进行取样，用液氮速冻，并放入-80℃超低温冰箱进行保存，待用时再取出。2.稻米的处理和品质测定成熟后的水稻种子进行彻底晾干，待去壳和除胚后进行直链淀粉测定和糊化温度分析。由于稻米中蛋白含量的变化可能会影响到稻米直链淀粉的测定，同时研究表明温度变化亦会影响稻米中蛋白含量的，因此本研究中为了去除掉储藏蛋白对测定结果的影响，在直链淀粉测定前进行了淀粉纯化。水稻淀粉的纯化主要参考Zhu等人2010使用的方法：称取一定量的精米，浸入3倍体积的超纯水pH值为8.0-8.5中过夜。去掉上层杂质包括水和漂浮物后加入3倍体积的0.001MNaOH。用植物组织匀浆器中速搅拌3min后加入3.5倍的0.001MNaOH或超纯水，用1MNaOH将pH值调到9.5后加入一定量的碱性蛋白酶5mgg消化18小时当反应液的pH值下降到8.5后，用200目筛过滤去掉杂质，下层匀浆4000g低速离心20min，弃上清。用纯水洗3次，每次清洗后4000g低速离心15min后，弃上清。用乙醇洗3次后，40晾干48小时。稻米直链淀粉测定采用的是纯化后的水稻淀粉，测定方法主要参考Juliano1971所采用的紫外分光光度测定方法。称取一定量～10±0.2mg的淀粉装入2ml微型离心管中，每个样品做3个重复。加入0.1ml无水乙醇，轻摇试管使样品湿润分散。加入0.9ml1N的NaOH溶液混匀，室温25℃消化16-20小时注意保证每一批样品的反应时间的一致性。待淀粉完全消化完毕后，吸取0.8ml消化液，加入到已盛有7.2ml左右蒸馏水的15ml的带刻度的试管中。剧烈摇晃，使消化液充分稀释。然后吸取0.75ml稀释液转入到新的并已加入4.8ml蒸馏水的15ml的带刻度的试管中，左右晃动摇匀后加入0.15mL1N的乙酸溶液使样品酸化后再加入0.3ml的0.02％的碘液，用蒸馏水定容至15ml，摇匀后放置15min。依据国标2008，波长选定720nm，用空白对照未加淀粉的处理液调零后测出各样品液的吸光度。用同时处理的标准品和已知的直链淀粉含量制作标准曲线，并据此计算出各样品的直链淀粉含量。相关试剂的配置：11NNaOH:40gNaOHL；21N乙酸溶液:57.2mlL用NaOH调pH到4.3，接近1L时调至4.0后再定容至1L，再微调；30.02％碘液:2gI2和20gKI到1L2gKI溶于少量水中，再加入0.2gI2到100ml。3.基因表达分析胚乳组织RNA的获得，具体方法是利用英俊公司的TRIzolreagent，并依据Zhang等人2005所描述的方法抽取。在1.5ml的RNase-FreeEP管中加入1mlTrizolInvitrogen，取8-10粒种子的胚乳放入EP管中，用电动研磨器充分研磨后室温静置5min。4℃，12000rpm离心10min，吸取上清至一新的1.5ml的RNase-FreeEP管中。加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min。4℃，12000rpm离心10min，吸取上清至新的RNase-FreeEP管中，加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀后冰上放置10min。4℃，13000rpm离心15min后弃去上清，用75％乙醇洗涤后，离心弃上清。待沉淀干燥后，加入适量的RNase-Free水溶解沉淀。对所获得的样品冻融数次后，4℃，13000rpm离心5min后吸取上清，即为提取的RNA粗样品。用琼脂糖凝胶电泳对RNA粗样品进行品质鉴定。抽提所获得的RNA粗样用英俊公司的TURBODNA-freeTM的试剂盒进行消化，以彻底消除残留基因组DNA。取50ulRNA粗样，加入5ul反应缓冲液10×，再加入1ulDNAase.混匀后放入37℃培养箱进行温浴，25min后取出样品待冷却中室温25℃后加入5ulreactive反应液，室温下反应5min，并进行间断性混匀.反应完后，4℃，12000rpm离心3min，吸取上清即为消化完成的RNA样品。消化后所获得RNA精样用Promega的GoScriptTM反转系统进行反转录，以获得第1链c-DNA。冰上配置如下反应液：RNA样品，upto1μg；OligodTPrimer，1μl；DEPCWater到最终体积；5μl。70℃变性5min后，直接置于冰上。配置反转录预混液：DEPCWater，6μl；ImProm-II5×ReactionBuffer，4μl；MgCl225mM，2.5μl；dNTPmix10mMeachdNTP，1μl；RNA抑制剂，0.5μl；ImProm-IIReverseTranscriptase，1μl。混匀预混液后，分装15μl到每个已变性过的样品中，再混匀。25℃温育5min后，42℃反应1h。70℃高温失活10min，将反转好的cDNA置于冰上或放入-20℃冰箱中长久保存。进行基因表达半定量分析时，所采用的参照基因为水稻的Actin基因表1。用于进行OsMADS7基因表达分析时，所采用的特异性引物分别为MADS7C2-F1&R1表1。反应方法如下：20ul的PCR反应体系中含有50-60ng模板DNA、10mMTris–HCl、50mMKCl、2.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、2uMprimers、1UTaqpolymerase。反应程序为：95℃变性5min；95℃，30s；54-56℃，30s；72℃，50s；20-28个循环；最后72℃延伸10min。PCR反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定。qRT-PCR定量表达分析主要是利用Bio-rad公司的C1000定量分析仪和GreenSupermix反应液完成，其中所采用的内参基因为UBQ10表1。OsMADS7基因定量分析引物为MADS7C2-F5&R5表1。4.载体构建和遗传转化以水稻品种日本晴基因组为模板，利用引物GluCp-1F&1R表1扩增水稻谷蛋白CGluC的启动子；利用HindIII和PstI双酶切将GluC的启动子连入pCAMBIA1301表达载体中，测序确定启动子无突变后利用SacI和PstI双酶切将载体PTCK303Wangetal.2004中的水稻内含子RiceIntron移入改造后的pCAMBIA1301表达载体中，完成胚乳特异性干扰载体的改造。利用设计好的MADS7特异性干扰引物MADS7C2-F6&R6表1扩增目的片段240bp，并将片段连入pTA2TOYOBOTA克隆载体上，测序确认无突变后，利用上游的SalI和PstI酶切位点，以及下游的SacI和SpeI酶切位点，将目标片段分别正向和反向连入改造过的胚乳特异性干扰载体中，获得OsMADS7胚乳特异性干扰载体GluC-MADS7-RNAi，把构建好的载体通过化学转化方法转入农杆菌菌株EHA105中。采用农杆菌介导的遗传转化方法，将含有GluC-MADS7-RNAi的农杆菌菌株侵染水稻愈伤，通过2轮潮霉素选择后获得抗性愈伤，愈伤分化后即得到抗性转基因植株。随后利用潮霉素引物HYG-F&R表1对各个植株进行分子鉴定，确认转基因阳性植株。表1相关引物序列信息转基因T1代挑选多个株系进行高温处理、基因表达鉴定和稻米直链淀粉含量测定，确认水稻胚乳中OsMADS7基因的表达抑制可以明显改善高温对灌浆期水稻直链淀粉含量的破环作用。综上所述，特异性干扰OsMADS7基因在水稻胚乳中的表达对培育能适应高温环境的优质水稻品种具有重要的利用价值。最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的单个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员从本发明公开的内容之间导出或联想的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

权利要求：1.一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，其特征在于:从水稻基因组中克隆OsMADS7基因的特异性干扰片段，利用水稻谷蛋白基因的启动子构建胚乳特异性干扰载体，通过根癌农杆菌介导方法，将干扰载体转入水稻中，并对转基因植株进行基因表达鉴定和表型分析；具体包括以下步骤：1根据OsMADS7基因的序列设计引物，扩增该基因的特异性干扰片段；特异性干扰片段利用引物对MADS7C2-F6和MADS7C2-R6进行PCR扩增获得；MADS7C2-F6的序列为ACTACTAGTGTCGACATTCATCCCTGAAGCACGTC，MADS7C2-R6的序列为TCTGAGCTCCTGCAGGTGGATGGAAGAACCCATTG；2利用水稻谷蛋白基因GluC的启动子构建OsMADS7基因的胚乳特异性干扰载体GlucP-MADS7-RNAi；具体为：利用引物对GluCp-1F和GluCp-1R进行PCR扩增，获得GluC的启动子；利用HindIII和PstI酶切位点将GluC启动子连入pCAMBIA1301表达载体；利用SacI和PstI酶切位点将载体PTCK303的水稻内含子RiceIntron移入经前面步骤改造后的pCAMBIA1301表达载体获得胚乳特异性干扰载体GlucP-RNAi；GluCp-1F的序列为GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG，GluCp-1R的序列为ACGCCTGCAGAGTTATTCACTTAGTTTCCC；分别利用上游的SalI和PstI酶切位点，以及下游的SacI和SpeI酶切位点将上一步获得的OsMADS7特异性干扰片段分别正向和反向连入胚乳特异性干扰载体GlucP-RNAi获得OsMADS7胚乳特异性干扰载体GlucP-MADS7-RNAi；3通过根癌农杆菌介导遗传转化方法，将干扰载体转入水稻中；4通过分子标记和RT-PCR方法对水稻的基因型和基因表达进行鉴定；5利用蛋白酶消化和紫外分光光度测定方法对高温处理的稻米进行淀粉纯化和直链淀粉含量测定；通过表型分析选择获得直链淀粉含量对高温具有强耐受性，且结实率未受明显影响的转基因水稻株系。

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