申请/专利权人：浙江海洋大学

申请日：2016-11-28

公开（公告）日：2020-03-20

公开（公告）号：CN106632602B

主分类号：C07K7/06(20060101)

分类号：C07K7/06(20060101);C12P21/06(20060101);C07K1/34(20060101);C07K1/20(20060101);C07K1/18(20060101);C07K1/16(20060101);A61K38/08(20190101);A61P7/02(20060101);A23L33/18(20160101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.03.20#授权;2017.06.06#实质审查的生效;2017.05.10#公开

摘要：本发明公开了一种双齿围沙蚕抗凝血肽及其用途，其氨基酸序列为：Pro‑Val‑Glu‑Arg‑Lys。本发明抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。

主权项：1.一种双齿围沙蚕抗凝血肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Pro-Val-Glu-Arg-Lys。

全文数据：一种双齿围沙蚕抗凝血肽及其用途技术领域[0001]本发明涉及一种活性肽，特别涉及一种双齿围沙蚕抗凝血肽及其用途。背景技术[0002]血栓形成是缺血性心脏病、缺血性中风及静脉栓塞常见的病理学基础，严重危害人类健康且近年来还有渐增之势。抑制血小板的聚集与释放、抑制凝血酶系统、激活抗凝血酶及纤溶酶系统均可抑制血栓的形成。血栓的形成是缺血性心脑血管疾病及血栓栓塞性疾病的主要病理过程，与疾病的发生、发展密切相关。因此，抑制血小板聚集、抑制血栓的形成对心脑血管系统疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治均有重要意义。[0003]双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis隶属于动物界，环节动物门，多毛纲，游行多毛目，沙蚕科，俗称海蜈蚣，与陆地生物蚯蚓具有很近的亲缘关系。从蚯蚓体内获得的蚯激酶已被证明能够有效溶解血栓，改善微循环，加强心、脑血管侧支循环，蚯激酶的成功开发使科研工作者将目光转向沙蚕。通过酶解的方法从沙蚕体内提取抗凝血成分以抑制体内血栓，未见报道。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种双齿围沙蚕抗凝血肽，抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。[0005]本发明还提供了双齿围沙蚕抗凝血肽的用途，双齿围沙蚕抗凝血肽作为制备抗血栓药物的应用、双齿围沙蚕抗凝血肽作为制备抗血栓保健食品的应用。[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：[0007]一种双齿围沙蚕抗凝血肽，其氨基酸序列为:Pro-Val-Glu-Arg-Lys。本发明从双齿围沙蚕中提取获得活性肽，并进行了分离纯化，首次报道了所提取的寡肽具有抗凝血活性，具有抗血栓作用。[0008]作为优选，双齿围沙蚕抗凝血肽的分子结构式为：[0010]-种双齿围沙蚕抗凝血肽的用途，所述双齿围沙蚕抗凝血肽作为制备抗血栓药物的应用。[0011]-种双齿围沙蚕抗凝血肽的用途，所述双齿围沙蚕抗凝血肽作为制备抗血栓保健食品的应用。[0012]上述双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法，步骤如下：[0013]1样品预处理:新鲜双齿围沙蚕经预处理后得组织匀浆；[0014]2酶解:按照每克组织匀浆加3mL纯净水的配比，将组织匀浆与纯净水混匀，调节pH=10，加入碱性蛋白酶酶解后得酶解液；[0015]3超滤:酶解液灭活，离心，取上清液，经超滤获得分子量小于3kd的活性组分；[0016]⑷阴离子交换层析:分子量小于3kd的活性组分经DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析，梯度洗脱，于280nm波长下检测，收集所得洗脱峰，冷冻干燥，筛选抗凝血活性最高的洗脱峰作为阴离子交换层析产物用于下一步分离纯化；[0017]5葡聚糖凝胶G25层析:将抗凝血活性最高的阴离子交换层析产物采用葡聚糖凝胶G25层析继续分离纯化，蒸馏水洗脱，于280nm波长下检测，收集所得洗脱峰，冷冻干燥后作为葡聚糖凝胶G25层析产物；[0018]6反相高效液相色谱分离纯化:对葡聚糖凝胶G25层析产物采用反相高效液相色谱法分离纯化，最终获得双齿围沙蚕抗凝血肽。[0019]本发明首次通过酶解的方法从沙蚕体内提取抗凝血成分，获得具有抗凝血活性的沙蚕寡肽，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。[0020]步骤（1样品预处理具体为：将新鲜双齿围沙蚕用清水清洗干净，沥干后称重，组织捣碎机匀浆，加匀浆3倍体积的预冷的磷酸盐缓冲液，4°C静置2h以上，离心，收集上清，上清液用医用脱脂棉过滤。所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02molL，pH7.0。步骤2按照每克组织匀浆加1500U的加酶量加入碱性蛋白酶，45°C酶解5小时得酶解液。步骤⑷洗脱的流速为1.5mLmin，预先用pH7.4，0.02molLTris-HCl平衡缓冲液充分平衡DEAE柱3-5个柱体积，然后上样。步骤⑶的蒸馏水的洗脱速度为I.lmLmin。[0021]本发明的有益效果是：抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。附图说明[0022]图1不同酶解液的超滤截留组分抗凝活性的比较（注：与生理盐水相比，*P±8，*:与正常组相比，？〈〇.〇5么：与模型组相比，Ρ〈〇.〇5。[0033]图12PAAP对大鼠PLG的影响吐S，*:与正常组相比，ρ〈0·05Δ:与模型组相比，Ρ〇.05。表4结果表明PAAP可有效减轻小鼠尾部血栓的形成，不但可以抑制血栓发展，同时对已形成的血栓有一定的溶解作用，且有量效关系。[0125]表4实验小鼠造模24、48和72h黑尾长度_[0127]*与模型组比p〈0.05,有显著性差异。[0128]2.4.2PAAP对FeCl3诱导颈动脉血栓的影响[0129]阿司匹林组与PAAP组均可减轻血栓重量。与模型组相比，PAAP中、高剂量大鼠的血栓质量显著减轻P0.05，t-PAPAI-l比值降低P〈0.05，PLG活性升高Ρ〈0.05，提示模型组纤溶活性降低。与模型组比较，阿司匹林组t-PA活性、PAI-I活性、PLG活性及t-ΡΑΡΑΙ-Ι比值无变化P0.05，与模型组比较，不同剂量的双齿围沙蚕多肽组t-PA活性均升高P〈0.05，同时PAI-I和PLG活性降低P〈0.05;t-PAPAI-l比值升高P〈0.05。[0148]2.9各组大鼠血浆中八1'-111、？：含量[0149]如图13-14所示，与正常对照组比较，模型组的ATM、PC的含量均明显降低（P〈0.05，提示模型组抗凝系统活性降低。与模型组相比，阿司匹林组ATm、PC的含量无明显变化P0.05。与模型组比较，双齿围沙蚕多肽各组的ATm含量降低P0.05而PC含量升高P0·05[0150]3讨论[0151]本研究以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作为供选酶酶解双齿围沙蚕，以体外抗凝活性为检测指标，筛选出最优酶种碱性蛋白酶对沙蚕进行酶解，在此酶解基础上进行进一步分离纯化。首先，酶解液经超滤截留具有最高抗凝活性的分子段3kDa，接着利用DEAE-SepharoseFF离子交换层析筛选出活性最高组分峰3并利用凝胶过滤对峰3进行纯化获得单一峰，收集此峰并利用反相高效液相进行分离纯化。最后，将纯化后的样品进行氨基酸序列测定，其氨基酸序列为Pro-Val-Glu-Arg-Lys并将该寡肽命名为PAAP。[0152]角叉菜胶是从红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，是一种较强的致炎因子]可用于制备多种组织炎症模型。胡三觉等[1]发现可用其制作小鼠尾部血栓形成模型，此种静脉血栓形成是由局部炎症与内皮细胞的损坏所引起的混合型血栓，可依据皮肤颜色的显著变化，从体表直接测量血栓的形成范围与程度，观察其发展全过程具有简便、直观、无创伤等优点。实验中发现，注射角叉菜胶后期部分小鼠会出现断尾现象，为准确测量黑尾长度，在实验过程中选择测量未形成血栓的部份，再已尾部总长度减去这部分长度，即为小鼠的黑尾长度。PAAP能够显著降低小鼠尾部形成的血栓长度，对角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓具有一定的抑制作用。[0153]Lockyer[2]等发现利用FeCh外敷可使血管内膜损伤，胶原暴露，引起血小板黏附、聚集和释放活化等，导致内源性凝血系统激活，在动脉损伤的区域形成复合性血栓，与人类血栓性疾病的发病机制相似且制作方法简单、容易控制、重复性好[3]，因而在国内外研究中被广泛使用[4〃]，本发明选用此模型来评价PAAP抑制血栓形成的作用。本研究结果显示，PAAP各剂量组均能延长FeCl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成时间，表明PAAP具有抑制动脉血栓形成的作用。[0154]血小板聚集诱导剂主要包括二磷酸腺苷ADP、凝血酶、胶原、血栓烷如TXA2、肾上腺素和血清素等。各种诱导剂诱导血小板活化的能力不尽相同，凝血酶、胶原和TXA2都是强诱导剂，ADP属中等强度的血小板聚集诱导剂，其诱导的血小板活化的信号通路是血小板聚集过程中最为重要的信号通路，因此本实验选择ADP诱导的血小板聚集进行研究。结果显示，PAAP能够有效的抑制由ADP诱导的大鼠血小板聚集。[0155]综上所述，本发明使用碱性蛋白酶酶解双齿围沙蚕，经分离纯化后，所获得的寡肽PAAP的抗凝活性达到1320±20.3Ug。急性毒性实验显示，PAAP的最大给药量为11.Ogkg.d，实验中未出现小鼠异常及死亡现象，提示该样品使用安全。PAAP可明显抑制角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓及Fecl3引起的大鼠颈动脉血栓，同时对ADP诱导的血小板聚集也具有抑制作用。PAAP的抗血栓机制可能与降低了乂82、？41-1、？1^、？18，升高6-1«^〇-?6?1€[、1'-?八、t-paΡΑΙ-Ι有关。[0156]参考文献：[0157][1]胡三觉，田巧莲，一种新的体内血栓形成动物模型[J].医学争鸣，199301:69-69.[0158][2]LockyerS,KambayashiJ.Demonstrationofflowandplateletdependencyinaferricchloride-inducedmodelofthrombosis[J].[0159]CardiovascPharmacol，1999，335:718-725.[0160][3]郭朝锋.三氯化铁动物血栓模型方法学及其应用研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志，2010,246:537-539.[0161][4]JustinD.Barr，AnilK.Chauhan,GilbertV-SchaefferjJessicaK.Hansen,DavidG.Motto.Redbloodcellsmediatetheonsetofthrombosisintheferricchloridemurinemodel[J].Blood,2013,12118:3733-41.[0162][5]EcklyAjHechlerBjFreundM，etal.MechanismsunderlyingFeCl3-inducedarterialthrombosis[J].JournalofThrombosisandHaemostasis，2011，94:779-789.[0163][6]XianX，YuD，LingZ，etal.EnhancedatherothromboticformationafteroxidativeinjurybyFeCl3，tothecommoncarotidarteryinseverecombinedhyperlipidemicmice[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2009,385⑷：563-569.[0164][7]聂牧，王云，郭守东，等.板栗多糖抗动脉血栓形成的作用[J].食品科学，2015，3611:187-190。[0165]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

权利要求：1.一种双齿围沙蚕抗凝血肽，其特征在于，其氨基酸序列为:Pro-Val-Glu-Arg-Lys。2.根据权利要求1所述的一种双齿围沙蚕抗凝血肽，其特征在于，双齿围沙蚕抗凝血肽的化学结构式为：3.如权利要求1所述的一种双齿围沙蚕抗凝血肽的用途，其特征在于，所述双齿围沙蚕抗凝血肽作为制备抗血栓药物的应用。4.如权利要求1所述的一种双齿围沙蚕抗凝血肽的用途，其特征在于，所述双齿围沙蚕抗凝血肽作为制备抗血栓保健食品的应用。

百度查询： 浙江海洋大学 一种双齿围沙蚕抗凝血肽及其用途

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD