申请/专利权人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

申请日：2017-11-07

公开（公告）日：2020-04-24

公开（公告）号：CN108014105B

主分类号：A61K31/357(20060101)

分类号：A61K31/357(20060101);A61P35/00(20060101);A61P35/04(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.04.24#授权;2018.06.05#实质审查的生效;2018.05.11#公开

摘要：本发明涉及一种YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用，研究发现YD1701可以作为ALDH1A3抑制剂，能够逆转ALDH1A3高表达肿瘤细胞发生间质‑上皮转化MET，减少肿瘤侵袭转移，抑制肿瘤进展，延长荷瘤动物的带瘤生存时间；并且YD1701细胞毒性小，有望成为治疗ALDH1A3高表达肿瘤的新药物，具有很好的应用前景。

主权项：1.YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用，其特征在于：所述ALDH1A3高表达肿瘤为结直肠癌、髓母细胞瘤、胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌或胰腺癌中的一种；所述YD1701结构式为： 。

全文数据：YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用技术领域[0001]本发明属于生物医药领域，涉及YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用。背景技术[0002]癌是起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类，极大的危害人类健康，并成为新世纪人类的第一杀手。侵袭转移是癌患者最主要的死亡原因，而上皮-间质转化EMT则是癌侵袭转移过程中的核心细胞生物学事件之一。因此，筛选开发逆转EMT的小分子是抗癌侵袭转移治疗领域的重要方向，具有很好的应用前景。[0003]人类乙醛脱氢酶Aldehydedehydrogenases，ALDH家族包含19个亚型，不同ALDH亚型亚细胞定位各不相同（包括细胞核、线粒体和细胞浆且功能各异。该家族能够通过将内生性醛催化形成酸，进而参与众多重要病理生理过程的调控，包括视觉、神经递质传递以及胚胎发育等等。随着研究的深入，ALDH家族成员的功能以一种令人惊讶的速度不断扩展，越来越多的结果表明，该家族成员在恶性肿瘤的发生、进展、治疗抵抗和复发过程中扮演举足轻重的角色。公开号为CN105734121A的中国专利报道了乙醛脱氢酶1A3ALDH1A3的高表达与结直肠癌CRC细胞发生EMT密切相关，ALDH1A3过表达能够促进直肠癌的侵袭转移;而下调ALDH1A3的表达、抑制ALDH1A3的活性、或给予ALDH1A3过表达效应抑制剂可以完全或部分逆转结直肠癌细胞的侵袭转移能力。ALDH1A3的高表达还见于胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃、髓母细胞瘤等，并与上述肿瘤的侵袭、转移和预后不良密切相关。因此筛选ALDH1A3抑制剂对ALDH1A3高表达肿瘤细胞的治疗具有重要意义。发明内容[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用，该药物具有细胞毒性小，为ALDH1A3高表达肿瘤提供一种新的治疗药物。[0005]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：[0006]YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用。[0007]本发明中，所述ALDH1A3高表达肿瘤为结直肠癌、髓母细胞瘤、胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌或胰腺癌中的一种。[0008]本发明中，所述ALDH1A3高表达肿瘤为结直肠癌。[0009]本发明中，所述药物包括YD1701和药学上可接受的载体。[0010]优选的，所述药物为注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂中的任一种。[0011]本发明中，所述YD1701在制备抑制ALDH1A3高表达肿瘤侵袭转移的药物中的应用。[0012]本发明中，所述YD1701在制备抑制ALDH1A3高表达肿瘤进程的药物中的应用。[0013]本发明中，所述YD1701在制备延长ALDH1A3高表达肿瘤生存时间的药物中的应用。[00M]本发明的有益效果在于:本发明提供了治疗ALDH1A3高表达肿瘤的新药物，该药物细胞毒性小，X寸ALDH1A3具有很好的抑制作用，降低肿瘤细胞的侵袭能力，抑制肿瘤进展，延长荷瘤动物带瘤生存时间，能够作为治疗结直肠癌、髓母细胞瘤、胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等的候选药物，对ALDH1A3高表达肿瘤具有重要意义。附图说明[0015]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：、[0016]图1为分子对接筛选ALDH1A3的特异性抑制剂结果图。[0017]图2为通过基于指纹的聚类分为结构簇鉴定的化合物。[0018]图3为YD1701结构式。[0019]图4为YD1701的LC-MS的鉴定结果。[0020]图5为YD1701与DEAB、双硫仑和西咪替丁比较结果。[0021]图6为YD1701对正常结肠粘膜上皮NCM460细胞毒性结果。[0022]图7为体外模拟YD1701化合物与ALDH1A3的结合图A:3-D模式;B:2-D模式）。[0023]图8为体外YD1701处理CRC细胞后细胞形态。[0024]图9为E-钙粘蛋白、CDffiN-钙粘蛋白，波形蛋白表达结果图。[0025]图10为EMT转录因子SNAI2Slug，ZEBl的表达结果图。[0026]图11为YD1701处理后不同CRC细胞系和原代CRC细胞的自发侵袭能力结果图。[0027]图12为YD1701处理后不同CRC细胞系和原代CRC细胞的细胞毒性结果图。[0028]图13为YDl7〇l处理后不同CRC细胞系和原代CRC细胞的抗增殖结果图。[0029]图14为YD1701治疗小鼠CRC皮下移植瘤的过程示意图。[0030]图15为YD1701小鼠生存时间结果图。[0031]图16为YD1701治疗小鼠皮下移植瘤的效果图，包括皮下肿瘤、肝脏和肺转移情况。[0032]图17为YD1701和5-FU治疗小鼠原位CRC移植瘤的过程示意图。[0033]图18为通过活体成像系统观察小鼠结肠原位植入肿瘤微组织块20天后小动物活体成像观察结果图。[0034]图19为YD1701治疗后原位CRC荷瘤小鼠的总生存时间结果图。[0035]图20为YD1701治疗小鼠原位移植瘤的效果图，包括原位肿瘤，肝脏和肺转移情况。[0036]图21为YD1701对髓母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌侵袭表型的抑制结果图。具体实施方式[0037]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。[0038]实施例1、ALDH1A3抑制剂筛选[0039]采用分子对接筛选ALDH1A3的特异性抑制剂图1。在进行分子对接之前，首先，去除盐离子，仅保留最大的分子片段，列举互变异构体和质子化来制备目标文库2〇万个化合物）。然后，通过能量最小化产生3-D结构。接下来，以高通量对接，将前20000种化合物进一步进行柔性对接，并且用力场精炼对接的姿态。此后，计算前1000种化合物的ADMET描述符，并过滤ADMET性质差的化合物。在ADMET过滤过程中，对logP6或警报数3的所有化合物进行过滤。对挑选出来的494种化合物，通过基于指纹的聚类分为结构簇，最终鉴定出30个化合物，具体流程见图2所示。在这30化合物中，基于对正常结肠粘膜上皮细胞的毒性效应，挑选出毒性反应最小的化合物¥017013〇1701分子式分子量=536.63，结构式如图3所示。然后将YD1701，化合物进行LC-MS鉴定，结果如图4所示。将鉴定后的YD1701化合物与已知的ALDH抑制剂进行比对，结果显示筛选的YD1701化合物与已知的ALDH抑制剂，如DEAB、双硫仑和西咪替丁不同（图5，表明YD1701化合物为一种新的ALDH抑制剂，预测YD1701化合物可能对ALDH高表达肿瘤有疗效。[0040]实施例2、YD1701细胞毒性实验[0041]为明确YD1701化合物能否用于ALDH1A3高表达肿瘤治疗，需要研宄YD1701化合物对正常细胞的细胞毒性。将正常结肠粘膜上皮NCM460细胞株购买自美国典型培养物保藏中心，ATCC扩大培养至细胞状态良好，用胰酶消化各细胞，并用中和胰酶消化后，用无菌的PBS洗细胞一次后细胞计数，采用完全培养基调整各细胞浓度为5X104ml，然后将调整好浓度的细胞悬液置于无菌的l〇cm的细胞培养皿中，前后左右轻摇混匀细胞，采用排枪将细胞悬液均匀的加入96孔板中，每孔100yL，37°C培养过夜，待细胞贴壁后再加入浓度分别为0ygmL、0•04ygmL、0•2ygmL、lygmL、5iigmL、25ygmL、125ygmL、250tigmL的YD1701化合物，96孔板的外圈孔不加细胞悬液，加无菌PBS以防培养基蒸发;然后用排枪换液，各孔加入含相应YD1701化合物浓度的完全培养基，并在无细胞孔中亦加入相应不同浓度的含药培养基，作为无细胞空白对照，每孔加入1〇〇此含药完全培养基，每个浓度至少做5个复孔，37°C培养，药物处理结束后，每孔加入lOuLCCK-8溶液，在细胞培养箱中继续培养1小时，450nm测定吸光度，实验结果以细胞存活率表示:细胞存活率（％=药物处理组-相应药物浓度空白对照A未药物处理组-空白对照）X100%，结果如图6所示。结果显示，YD1701化合物对正常结肠粘膜上皮NCM460细胞毒性很低，IC5Q100ugmL。[0042]实施例3、YD1701化合物抑制结直肠癌CRC细胞[0043]由于乙醛脱氢酶1A3ALDH1A3的高表达与结直肠癌CRC细胞发生EMT密切相关，为了研宄YD1701化合物是否促进CRC细胞发生间质-上皮转化MET，先体外模拟YD1701化合物与ALDH1A3的结合程度，结果如图7所示。结果显示YD1701化合物与ALDH1A3为口袋结合模式，预测YD1701化合物对ALDH1A3可能具有较好的抑制作用。[0044]为评估YD1701是否能够抑制ALDH1A3功能并促进CRC细胞发生间质-上皮转化MET，体外使用（OugmL，0.04ugmL，0•2ugmL，lugmL，5ugmL，25ugmLYD1701处理CRC细胞呢1'116、肌29、8¥480、3化620、结肠癌原代细胞〇?：1，然后观察细胞形态，结果如图8所示。结果显示，CRC细胞发生了明显的MET相关形态学变化，细胞由梭形变成了椭圆形或多角形。[0045]检测上皮标志物E-钙粘蛋白，间质标志物CDH2N-钙粘蛋白，波形蛋白和EMT转录因子8祖1231叫，2£81，结果如图9和图10所示。结果显示，上皮标志物伍-钙粘蛋白）上调，间质标志物CDH2N-钙粘蛋白，波形蛋白）和EMT转录因子SNAI2Slug，ZEBl的表达显著下调。[0046]之后考察了YD1701化合物处理对不同CRC细胞系（HCT116、HT29、SW480和原代CRC细胞CRC1的自发侵袭能力，Matrigeltranswell测定结果如图11所示。结果显示，在给予YD17010.04ugmL后，不同CRC细胞系和原代CRC细胞的自发侵袭能力显著降低。接着考察YD1701化合物处理对不同CRC细胞系HCT116、HT29、SW480、SW620和原代CRC细胞CRC1的细胞毒性和抗增殖效能，CCK-8测定结果如图12和13所示。结果显示，YD1701化合物对不同CRC细胞系和原代CRC细胞的细胞毒性和抗增殖效能并不显著。[0047]实施例4、YD1701对直肠癌治疗效能评估[0048]为了评估YD1701的治疗效能，进行小鼠CRC皮下移植瘤实验，实验过程如图14所示。接种后当肿瘤体积达到〜100mm3时，将小鼠分为5组。分别通过腹腔注射给予YD1701高剂量，25mg•kg_1;中剂量，10mg•kg_1;低剂量，lmg•kg_1、生理盐水+DMSO阴性对照）、5_FU阳性对照，1Omg•kg_1治疗两周，观察小鼠CRC皮下移植瘤的进展，并统计小鼠生存时间，如图15所示。结果显示，肿瘤体积并无明显差别，但YD1701的治疗显著延长了荷瘤小鼠的总生存时间。对植瘤小鼠的肝和肺转移检测，如图16所示。结果显示，在部分阴性对照组小鼠中检测到了肝和肺转移。[0049]为了进一步评估YD1701的治疗潜力，比较YD1701和5-FU5_氟尿嘧啶）对小鼠原位CRC移植瘤的抑制效果，实验过程如图17所示。YD1701小鼠结肠原位植入肿瘤微组织块后20天，通过活体成像系统确定原位移植瘤形成情况，结果如图18所示。结果显示，所有受试小鼠均在结肠形成大小一致的肿瘤。然后将确定原位移植瘤小鼠分为三组，接受腹腔注射YD1701lmg•kg—1、生理盐水+DMSO和5-FU10mg•kg—1治疗两周。比较三组原位移植瘤小鼠总生存时间，结果如图19所示。结果显示，同生理盐水+DMS0和5-FU10mg•kg4治疗组小鼠相比较，YD1701治疗组显著延长了原位CRC荷瘤小鼠的总生存时间，并且YD1701治疗组小鼠中也没有出现转移。然而，在部分对照组小鼠中，可以观察到明显的肝转移（图20，三组小鼠结肠原位肿瘤的体积大小并无明显差别（图20。[0050]上述结果表明，ALDH1A3特异性抑制剂YD1701可以促进CRC细胞的MET表型，抑制人CRC的进展，减少CRC的转移。[0051]实施例5、YD1701的对其他癌治疗效能评估[0052]除结直肠癌之外，ALDH1A3的高表达还见于高级别胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、髓母细胞瘤等，并与上述肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关。因此，按照实施例3的方法分别评估YD1701对髓母细胞瘤Daoy、前列腺癌DU145、肺癌A549、卵巢癌SK0-V3、A2780、肝癌Hu-7、胃癌SGC-7901的自发侵袭能力，结果图21所示。结果显示，YD1701处理后上述肿瘤细胞的侵袭能力显著降低。上述结果表明，YD1701对肺癌、冑癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、髓母细胞瘤等的治疗具有应用前景。[0053]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.YD1701在制备治疗ALDH1A3高表达肿瘤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述ALDH1A3高表达肿瘤为结直肠癌、髓胃：细胞瘤、胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌或胰腺癌中的一种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述ALDH1A3高表达肿瘤为结直肠癌。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述药物包括YDl7〇l和药学上可接受的载体。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述药物为注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒齐1J中的任一种。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述YD1701在制备抑制ALDH1A3高表达肿瘤侵袭转移的药物中的应用。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述YD1701在制备抑制ALDH1A3高表达肿瘤进展的药物中的应用。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述YD1701在制备延长ALDH1A3高表达肿瘤生存时间的药物中的应用。

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