申请/专利权人：贵州大学

申请日：2017-04-25

公开（公告）日：2020-05-22

公开（公告）号：CN107129944B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);A23L11/00(20160101);C12R1/07(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.22#授权;2017.09.29#实质审查的生效;2017.09.05#公开

摘要：本发明公开一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN‑14。与现有技术相比，本发明具有以下优点：1本发明的贝莱斯芽孢杆菌SN‑14来源于贵州本土豆豉，菌株的安全性高；2本发明的贝莱斯芽孢杆菌SN‑14，获得的纳豆产品口感优良；3本发明贝莱斯芽孢杆菌SN‑14产纳豆激酶的活力较高，是研究和开发纳豆激酶产品的首要条件。因此该枯草芽孢杆菌在改善食品口感，提高发酵活性，并丰富纳豆保健品的功效上有很好的应用前景。

主权项：1.一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN-14；所述的贝莱斯芽孢杆菌SN-14，保藏编号：CCTCCM2017135，地址：中国武汉市武汉大学，所述的贝莱斯芽孢杆菌SN-14，其细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。

全文数据：一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用技术领域[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新的纳豆激酶生产菌株，还涉及一种纳豆激酶生产菌株菌株在制备纳豆中的应用，本发明所述的莱斯芽孢杆菌具备高产纳豆激酶的能力，可用于纳豆的生产。背景技术[0002]血栓疾病重影响着人类的健康，据统计，全世界每年至少有1200万患者因血栓性疾病而死亡，中国约有260万。因此溶栓抗栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点。目前临床上常用的溶栓抗栓药物有链激酶Streptokinase，SK、尿激酶Urokinase，UK和组织型纤溶酶原激活剂typeplasminogenactivator，t-PA，但这些药物存在给药痛苦、副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点，相比之下，纳豆激酶Nattokinase，NK已被证明具有高效的溶栓作用，不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。并且纳豆激酶具有可口服、安全、廉价和纤溶性强等优势，成为近年来溶栓类产品的研究热点。[0003]纳豆食品虽具有很好的营养和保健功能，但因纳豆其特有的风味并不易被我国人民所接受，这不利于人们通过饮食去摄入纳豆激酶来降低血栓疾病发病率。由于毛霉发酵的豆豉不仅味美醇香、营养丰富，而且具有多种保健功能，是我国人民喜爱的佐餐调味佳品。目前生产中采用纯毛霉接种制曲制备的发酵豆豉因培养时间过短，产品中氨基酸态氮的含量较低，易导致货架期产品出现老化变硬，影响产品的风味。因此，纳豆食品的开发必须同时从产品感官和发酵活性上进行，才能达到最佳的效果。筛选高活性的纳豆激酶生产菌株，改善纳豆口感以及制备富含多种功能成分的纳豆食品，是今后纳豆激酶产品发展的关键。[0004]目前，已研究报道的产纳豆激酶芽孢杆菌较多，主要有枯草芽孢杆菌Bacillussubtilies、和解淀粉芽抱杆菌BaciIIusamyloliquefaciens等，而芽抱杆菌BaciIIusvelezensis是2005年发现的芽孢杆菌新种，随后被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体，其中文名为贝莱斯芽孢杆菌。作为一种新型细菌，有关它的研究也日益增多，但更多的是将该菌的研究重心放在了植物病害生物防治中。直到现在国内外的研究中，还均未发现将贝莱斯芽孢杆菌用于纳豆激酶的生产上。发明内容[0005]本发明的目的是提供了一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14,该菌株具备高产纳豆激酶的特点，可用于纳豆激酶保健品的生产。[0006]本发明还有一个目的在于提供了一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在制备纳豆中的应用，利用该菌株发酵黄豆，提高了纳豆产品中纳豆激酶的含量，并改善了纳豆的口感。[0007]本发明的技术方案为:一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN-14。[0008]该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisSN-14,保藏编号：CCTCCM2017135,保藏日期：2017年3月20日，地址：中国武汉市武汉大学。[0009]所述的贝莱斯芽孢杆菌SN-14,其细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。[0010]—种贝莱斯芽孢杆菌SN-14,其筛选过程如下：[0011]1利用初筛培养基分离豆豉里面的芽孢杆菌，经形态学鉴定，初步确定为芽孢杆菌。[0012]初筛培养基：3-10gL酪素，l-5gL葡萄糖，l-5gL酵母膏，1-58112冊04，0.5-2.5gLKH2P04,0J-0.5gLMgS04，pH7.0〜7.2。[0013]2再次利用固体发酵复筛，进行感官鉴评和测定纤溶活力，选择感官鉴评优和纤溶活力高的菌株。[0014]复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m:V=1:3-5常温下浸泡10-12h，沥干于121°C灭菌20min。[0015]3最后应用纳豆激酶的PCR扩增，高效快速筛选到一株纳豆激酶生产菌株SN-14，并对该菌株进行了生理生化鉴定和16SrRNA的分子鉴定。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisSN-14,保藏编号：CCTCCM2017135〇[0016]4—种贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备纳豆中的应用，其应用步骤为:将筛选得到的芽孢菌菌株转接到LB斜面培养基上37°C活化18-28h，用接种环挑选2-5环的菌苔接种到液体种子培养基中，于37°：，18^1^11的条件下培养16-1811处于对数生长期，然后以4%的接种量接种到灭菌的黄豆培养基上，在37°C培养36-48h，后熟24h即可。测得纳豆激酶的活力达到6583·2-8215·7IUg湿黄豆）。[0017]所述的液体种子培养基：10-15gL葡糖糖，5-10gL酵母提取物，10-15gL牛肉膏，5-1^1^1：1，？!17.4〜7.6。[0018]本发明的有益效果：[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点：[0020]1本发明的贝莱斯芽孢杆菌SN-14来源于贵州本土豆豉，菌株的安全性高；[0021]2本发明的贝莱斯芽孢杆菌SN-14，获得的纳豆产品口感优良；[0022]3本发明贝莱斯芽孢杆菌SN-14产纳豆激酶的活力较高，是研究和开发纳豆激酶产品的首要条件。因此该枯草芽孢杆菌在改善食品口感，提高发酵活性，并丰富纳豆保健品的功效上有很好的应用前景。附图说明[0023]图1为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在初筛培养基上的菌落形态示意图；[0024]图2为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在LB培养基上的菌落形态示意图；[0025]图3为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在琼脂糖-纤维蛋白原上的活力示意图；[0026]图4为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在固体发酵上的产物示意图；[0027]图5为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在油镜下观察的菌种形态图；[0028]图6为MEGA5.05用邻近法基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树；[0029]显不分离株属于Bacillusvelezensis属。Bootstrap为1000，表不经过1000次数值分析；[0030]图下标尺表示每100个碱基序列中有一个碱基替换；[0031]图7为尿激酶活力的对数值与溶解圈面积呈线性关系示意图。具体实施方式[0032]实施例1:[0033]一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14，其筛选过程如下：[0034]⑴初筛[0035]从贵州省的遵义豆豉、贵阳豆豉、大方臭豆腐、铜仁豆豉、毕节臭豆腐、安顺豆豉和青岩豆腐等地的9种样品各取2g置于IOOmL的已灭菌的具塞三角瓶中，加无菌生理盐水稀释10倍，振荡30s后，于37°C，180rmin的条件下培养24h。将菌悬液置于80〜85°C的水浴锅中加热lOmin，冷却后的菌悬液分别做梯度稀释，各取0.ImL涂布于酪蛋白平板上，37°C倒置培养24h，挑取水解圈与菌落直径比值CH的值较大的菌落进行革兰氏染色及镜检，参照常见细菌系统手册中关于芽孢杆菌属的形态描述进行镜检初筛，并接种到LB平板上进行划线分离纯化，将获得的单一菌株接种到LB斜面培养上，37°C培养24h，于4°C冰箱保存备用。经初筛培养基初筛，筛选出70株疑是产纳豆激酶高活性的菌株。[0036]初筛培养基为5gL酪素，lgΙ葡萄糖，lgΙ酵母膏，lgLK2HP04，0·5gLKH2P04，0.1gLMgS04，pH7.0〜7.2。[0037]⑵复筛[0038]通过黄豆固体发酵复筛和纤溶活性的分析，筛选出15株活性较高的菌株。[0039]复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m:V=1:3常温下浸泡10_12h，沥干于121°C灭菌20min。[0040]3纳豆激酶的PCR扩增法[0041]将菌株SN-14活化，转接于LB液体培养基中，180rmin、37°C震荡培养18h后，用细菌DNA试剂盒（中国北京天根生化科技有限公司）提取菌株的基因组。扩增使用的上游引物为27FAGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT，下游弓I物为1492TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC。[0042]25yL反应体系：模板2μLGC-338F2.5PL[0043]518R2JμLGoTaqGreenMasterΜϊχ2X12.5WL双蒸水5.5μL[0044]反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性Imin，退火温度从65°C降至55°C，每个循环降低0.5°C，退火时间为3s，72°C延伸lmin，35个循环；恒定退火温度下进行94°C变性lmin，55°C退火30s，72°C延伸lmin。[0045]克隆测序及序列分析[0046]扩增所得的基因片段经过分离纯化后，连接pUC19载体，转化EscherichiaC〇liDH5a进行克隆测序，测序引物为通用测序引物M13F和M13R。对测序结果进行Blast相似性分析http:blast·nebi·nlm.nih·govBlast·cgi并提交至Genebank数据库。通过Bioedit软件进行基因序列的翻译，并进行氨基酸序列同源性比对。[0047]整合纳豆激酶基因扩增筛选法，筛选出一株产纳豆激酶的高活性菌株SN-14,见图5〇[0048]⑷16SrRNA分子鉴定[0049]通过MEGA5.05软件进行系统进化树的构建，结果得到了如图5所示的系统发育树状图。系统发育学分析结果表明，该系统树以VibriocortegadensisHF955037作为一个单独的外群种，其中SN-14菌株与BaciIlusvelezensis属菌株在同一分支，结合前面的形态学和生理生化鉴定结果，鉴定SN-14为贝莱斯芽孢杆菌属。该菌株已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCM2017134,地址：中国武汉武汉大学。[0050]贝莱斯芽孢杆菌SN-14的形态特征：SN-14在LB平板培养基上的菌落特征如表1所示。挑取单菌落革兰氏染色后镜检，镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。[0051]表1SN-14的菌落特征[0052][0053]SN-14的生理生化特征:见表2、表3[0054]表2SN-14的生理生化试验一酶活、碳源氧化[0057]+:阳性反应;阴性反应[0058]表3菌株SN-14生理生化特性一利用碳源产酸[0061]+:阳性反应;-:阴性反应;w:弱阳性反应[0062]实施例2:[0063]纤溶活力（纳豆激酶活力）的测定:采用琼脂糖一纤维蛋白原平板法，琼脂糖平板的制作步骤如下：[0064]首先将1%的琼脂糖溶于0.05moVL的Tris-HClpH7.8缓冲溶液中，加热至完全溶解后，取出IOmL置于大试管中，待其冷却至50°C左右，迅速倒入10mL1.5mgL牛血纤维蛋白原溶液，不断震荡，使其完全混合均匀，注入直径9cm的培养皿中，再迅速加入300μL20IUmL的凝血酶溶液，不断晃动平皿使三者混合均匀，防止气泡的产生，静置Ih后，用直径为2mm的无菌胶头吸管在平板上打孔。[0065]尿激酶标准曲线的制作：将本尿激酶标准品（1240IU瓶配制为508、635、794、992和1240IUmL按照80%的梯度稀释量进行），各取IOyL点样于新配制的纤维蛋白原平板上，放置IOmin，37°C培养16h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积。以溶解圈的面积为横坐标，以尿激酶单位酶活的对数值为纵坐标作标准曲线。计算各溶解圈面积，[0066]样品的测定：[0067]粗酶液的制备:称取2g纳豆溶于4mL无菌的生理盐水中，4°C下浸提24h后过滤，取滤液12000rmin，离心IOmin，取上清液IOyL分别点样在纤维蛋白原平板上，培养16h，测定溶圈的直径，计算出溶圈的面积，通过尿激酶标准曲线，计算出酶活。通过此方法测定纳豆激酶的简便易行，可行度高，可同时测定多个样品，节约实验成本。[0068]实施例3:[0069]—种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在制备纳豆的中的应用，其步骤如下：[0070]将贝莱斯芽孢杆菌SN-14菌株转接到LB斜面培养基上37°C活化24h，用接种环挑选2-3环的菌苔接种到液体种子培养基中（装液量50mL250mL，于37°C，180rmin的条件下培养16h至对数生长期，然后按4%vw的接种量接种到灭菌的黄显培养上，在37°C培养36h，每12h搅拌一次。发酵的纳豆颜色为土黄色，豆粒酥软，拨动黄豆有长长拉丝的现象，带有淡淡的香味物质，纳豆激酶激酶的活力为6583.2IUg湿黄豆）。[007Ί]所述的液体种子培养基：10gL葡糖糖，5gL酵母提取物，10gL牛肉膏，5gLNaCl，pH7.4〜7·6〇

权利要求：1.一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN-14〇2.根据权利要求1所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于:所述的贝莱斯芽孢杆菌SN-14,其细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。3.如权利要求1或2所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于:包含以下步骤：1利用初筛培养基分离豆豉里面的芽孢杆菌，经形态学鉴定，初步确定为芽孢杆菌；2再次利用固体发酵复筛，进行感官鉴评和测定纤溶活力，选择感官鉴评优和纤溶活力高的菌株；3最后应用纳豆激酶的PCR扩增，筛选到一株纳豆激酶生产菌株SN-14,并对该菌株进行了生理生化鉴定和16SrRNA的分子鉴定。4.根据权利要求3所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于:初筛培养基:3-10gL酪素，l-5gL葡萄糖，l-5gL酵母膏，l_5gLK2HP04，0.5-2.5gLKH2P04,0J-0.5gLMgS04，pH7.0〜7.2。5.根据权利要求3所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于:复筛使用的培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m:v=l:3-5常温下浸泡10-12h，沥干于121°C灭菌20min。6.如权利要求1所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备纳豆中的应用，其特征在于:将筛选得到的芽孢菌菌株转接到LB斜面培养基上37°C活化18-28h，用接种环挑选2-5环的菌苔接种到液体种子培养基中，于37°C，180rmin的条件下培养16-18h处于对数生长期，然后以4%的接种量接种到灭菌的黄豆培养基上，在37°C培养36-48h，后熟24h即可。7.根据权利要求6所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备纳豆中的应用，其特征在于:所述的液体种子培养基：l〇-15gL葡糖糖，5-10gL酵母提取物，10-15gL牛肉膏，5-1^1恥：1印!17.4〜7.6。

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