申请/专利权人：中国食品发酵工业研究院有限公司;山东扳倒井股份有限公司

申请日：2018-11-30

公开（公告）日：2020-06-23

公开（公告）号：CN109679855B

主分类号：C12N1/14(20060101)

分类号：C12N1/14(20060101);C12G3/02(20190101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.23#授权;2019.05.21#实质审查的生效;2019.04.26#公开

摘要：本发明涉及一株产茶香型风味物质的谢瓦散囊菌及其在白酒大曲生产中的应用，属于生物技术领域。本发明的谢瓦散囊菌（Eurotiumchevalieri）分离自白酒大曲中，菌株原始编号为CICC41587M9，菌种保藏编号为CGMCCNo.14623。本发明的优点在于：提供了一株产茶香风味的谢瓦散囊菌，将该菌种以菌粉形式强化于白酒大曲生产中，大曲成熟后具有茶香型风味，为后续的白酒生产提供了一定的风味基础。

主权项：1.一株产茶香型风味的谢瓦散囊菌EurotiumchevalieriCICC41587，其特征在于，谢瓦散囊菌EurotiumchevalieriCICC41587的保藏编号为CGMCCNo.14623。

全文数据：一株产茶香型风味的谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用技术领域本发明涉及一株产茶香型风味的谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用，属于生物技术领域。背景技术谢瓦散囊菌（Eurotiumchevalieri）属于真菌界、子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、发菌科、散囊菌属，该菌种无性型名称为谢瓦曲霉（Aspergilluschevalieri），为嗜高渗透压菌种。已有大量文献报道谢瓦散囊菌存在于白酒发酵生产过程中（酱香型、浓香型、清香型大曲中均有分离到），表明其在白酒大曲中能够良好地生长，但目前未有谢瓦散囊菌在白酒大曲生产中的应用及功能方面的研究。白酒大曲为传统酿造用曲中的一种，又称块曲或砖曲，是白酒酿造中的重要元素，可谓之酒之骨，其是白酒后发酵过程中微生物和生物酶的重要提供者，白酒大曲的风味物质直接影响白酒酒体的风味呈现。茶香型风味是一种清新、怡人的气味，深受广大消费者的青睐，目前白酒中茶香型风味主要是通过茶叶泡酒和茶叶蒸酒方式生产的，本发明提供的产茶香型风味谢瓦散囊菌直接强化于白酒大曲后，强化大曲呈现出了茶香型风味，将为后续生产的白酒酒体提供重要的风味基础，目前未有该菌种在大曲方面的相关应用研究。发明内容本发明提供了一株产茶香型风味物质的谢瓦散囊菌；将该菌种的菌粉以拌料或喷洒的方式应用于白酒中高温大曲生产中，得到的强化大曲特征为：曲心具有明显的谢瓦散囊菌金黄色菌斑；具有清新的茶香风味。本发明是通过以下技术方案实现的。本发明的菌株是通过传统的平板分离培养方法，从白酒大曲中分离得到的，菌株原始编号为CICC41587M9，该菌株于2017年09月14日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（中国北京中国科院微生物研究所），保藏编号：CGMCCNo.14623，分类学名称：谢瓦散囊菌（Eurotiumchevalieri）。本发明的菌株CICC41587M9是通过形态学特征和核酸序列系统发育分析来准确确定其分类学地位的。菌株CICC41587M9的形态学特征为：CYA培养基上，25℃培养7天，菌落直径28～30mm，中央棕黄色，周围蛋黄色；中心凸起；质地丝绒状；反面浅橙黄色；无渗出液产生，无可溶性色素产生。菌丝黄色具饰，缠绕、较细；闭囊壳大量，黄褐色，存在于具饰菌丝网中，直径150～200μm，成熟后破裂释放出大量子囊；子囊近球形或椭圆形，长轴直径10～19μm，内含8个子囊孢子；子囊孢子双凸镜形，中部具鸡冠状凸起，长轴直径为5.0～7.5μm；未见分生孢子结构。菌株CICC41587M9的分子生物学特征为：ITSrDNA序列NCBI登录号为MF324889；β-tubulin基因序列NCBI登录号为MF324895。本发明菌株的风味物质特征是通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法对菌种发酵液挥发性物质进行分析的，并结合香气阈值和相对气味活度值（ROAV）对其进行主体香气成分评价。本发明的谢瓦散囊菌菌粉以拌料或喷洒方式进行强化。本发明谢瓦散囊菌的强化大曲特征为：曲心具有明显的谢瓦散囊菌黄色菌斑；谢瓦散囊菌活菌数应为1×105～1×108CFUg；强化大曲产生以1-辛烯-3-醇和芳樟醇为主导的茶香型风味。附图说明图1谢瓦散囊菌菌株CICC41587M9的形态学照片。图2谢瓦散囊菌菌株CICC41587M9与相关种的ITSrDNA基因序列系统发育树。图3谢瓦散囊菌菌株CICC41587M9与相关种的β-tubulin基因序列系统发育树。图4谢瓦散囊菌菌株CICC41587M9强化曲和对照曲曲心照片。具体实施方式结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。实施例1菌种鉴定（1）形态学鉴定将菌株CICC41587M9接种在察氏酵母膏培养基上（CYA培养基），25℃培养7d，进行菌落拍照，菌体显微观察以及扫描电镜观察，具体形态特征详见图1。（2）分子生物学鉴定菌株CICC41587M9通过ITSrDNA和β-tubulin基因序列系统发育分析，将其准确鉴定到种，系统发育树详见图2-图3。实施例2谢瓦散囊菌CICC41587M9发酵液风味物质的测定谢瓦散囊菌CICC41587M9用4%葡萄糖MEB培养基28℃培养30d，发酵液嗅觉感官为茶香、青草香。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法对菌种发酵液的挥发性物质进行分析，并结合香气阈值和相对气味活度值（ROAV）对其进行主体香气成分评价。共检测到42种挥发性物质（见下表1），其中香气物质33种。特征香气成分评价采用相对香气活度值法（Relativeodoractivityvalue，ROAV）评价各挥发性成分对样品总体香气的贡献，即：ROVAi≈100×CiCmax×TmaxTi（1）；式中：Ci、Ti——各挥发性物质的相对百分含量和相对应的感觉阈值；Cmax、Tmax——对样品总体风味贡献最大组分的相对百分含量和相对应的感觉阈值。ROAV值（≤100）越大的组分对样品总体风味的贡献也就越大，ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用。根据（1式）计算得到15种已有嗅觉阈值风味物质的ROAV值，其中1-辛烯-3-醇、里哪醇（芳樟醇）值均大于1，为关键的风味化合物，主导茶香型风味特征（详见表1），符合菌种发酵液的茶香嗅觉风味。表1菌种发酵液微量香味组分GC-MS分析结果注：阈值为水溶液中的嗅觉阈值；“-”表示因为未查到该化合物的感觉阈；“”表示该化合物为非风味物质。实施例3谢瓦散囊菌CICC41587M9菌粉制备（1）将麸皮与蒸馏水按1:1的比例润湿，称取20g于500mL三角瓶中，共15瓶（编号1-15），121℃灭菌40分钟，隔夜，按同样条件再灭菌一次。（2）待麸皮培养基冷却后，接种5mL在28℃培养7d的M9菌株发酵液，28℃培养14d，培养期间观察有无杂菌污染。（3）培养10d时，随机选取3号瓶、11号瓶麸皮培养物，分别称取2.5g，混合溶于50mL生理盐水中，混匀后，吸取1mL涂布于直径20cm的PDA平皿上（共两皿），28℃培养4天，未观察到有杂菌生长；（4）培养14d时，用无菌长柄勺将麸皮培养物扣取至无菌的2L烧杯中，晃匀，称取1g培养物溶解于2mL无菌蒸馏水中，显微镜检无杂菌孢子。（5）将麸皮培养物转入20L的旋转蒸发仪旋瓶中，40℃水浴真空干燥26h，水分测定为8.7%。（6）通过微型植物粉碎机粉碎30s，过20目筛，封装于无菌自封袋中，共141g。（7）称取上述菌粉产品按照GB4789（霉酵计数方法）进行计数，其谢瓦散囊菌菌落数为2.3×106CFUg。实施例4谢瓦散囊菌菌种CICC41587M9的中高温大曲强化试验（1）强化方式及取样方式取上述制备好的谢瓦散囊菌菌粉100g溶解于15L含2%NaCl的蒸馏水中，通过拌料方式强化于山东扳倒井股份有限公司的中高温大曲，每块大曲大约分配到8～9mL终浓度为1.2×105CFUmL的菌液，选取未强化谢瓦散囊菌的大曲作为对照。取样方式为在曲房的四角和中间5个位置各取1块长势良好的曲块，粉碎后混合均匀，四分法进行采样。（2）强化大曲的感官评价按照扳倒井股份有限公司的企业标准《大曲评分标准》（BDJJW-WSW-06）对强化曲和对照曲感官进行评价，评价结果见表2，根据表2和图4可知强化曲典型特征为曲心具有大量金黄色菌斑且具有茶香风味。表2谢瓦散囊菌强化曲及对照曲的感官特征及评价结果大曲编号感观特征风味评价结果强化曲穿衣均匀，上霉好，曲块表面有大片白色菌斑，且伴随有少量黄色菌斑，断面整齐，曲面灰白为主，较泡气，曲心有大量黄色菌斑，有水圈，曲皮较薄，曲香较浓郁。茶香、青香优级曲对照曲穿衣较均匀，上霉较好，曲块表面有少量白色菌斑，断面较整齐，曲面灰褐色，无杂菌斑，欠泡气，有水圈，曲皮较厚，曲香较浓郁。陈香、烘烤香二级曲（3）强化大曲的风味物质测定采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法检测谢瓦散囊菌CICC41587M9强化大曲与对照大曲的主要风味成分，检测结果见表3，根据香气阈值和相对气味活度值（ROAV）对其进行主体香气成分评价，判定规则为ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用，由表3可知强化大曲的关键风味物质为1-辛烯-3-醇、里哪醇（芳樟醇）、异戊醛、乙酸、4-乙基愈创木酚，分析结果与谢瓦散囊菌CICC41587M9纯菌种发酵液主导风味物质1-辛烯-3-醇和芳樟醇的结果一致，而对照大曲中未检测到该两种风味物质。表3大曲风味物质检测及相对香气活度值（ROAV）分析结果组分名称对照大曲（%）强化大曲（%）对照大曲ROAV强化大曲ROAV风味描述1-辛烯-3-醇－0.16－100.00茶香、青草香、水果香、尘土风味、油脂风味芳樟醇－0.14－19.86绿茶青香、木青气息、玫瑰的花香异戊醛0.250.09100.0019.35花香、水果香3-羟基-2-丁酮0.160.081.340.39甜香、奶制品香、脂肪油腻气息香叶基丙酮0.040.04－－淡的花香、青香、果香、蜡香、木香羟基丙酮－0.02－－正丁醇0.050.120.120.17水果香活性戊醇0.020.060.000.01甜味、似杂醇油的香气异戊醇0.100.160.000.00水果香、花香、臭1,2-丙二醇0.790.16－－乙二醇0.430.10－－α-苯乙醇0.020.090.000.01淡栀子花香、甜花香、面包香及玫瑰香1,4-丁二醇0.040.08－－丙三醇0.270.41－－喇叭茶醇－0.37－－叶绿醇－0.15－－清香4-甲基嘧啶0.040.05－－2,5-二甲基吡嗪0.040.030.080.04青草、炒豆香2,6-二甲基吡嗪0.140.151.150.71青椒香2,3-二甲基吡嗪0.260.220.150.08烤面包香、炒玉米香、烤馍香、烤花生香2-乙基-6-甲基吡嗪0.030.03－－三甲基吡嗪0.681.00－－浓厚的坚果香气3,5-二甲基-2-乙基吡嗪0.130.10－－炒坚果香气四甲基吡嗪1.371.960.110.09甜香、水果香、花香、水蜜桃香糠醛0.020.010.000.00焦糊臭、坚果香苯甲醛0.130.080.200.07杏仁香、坚果香糠醇0.43－28.26－甜香、焦糖香、面包香及咖啡香苯甲醇2.100.100.330.01花香、水果香、甜香、酯香β-苯乙醇9.640.262.170.03玫瑰花香、月季花香、花香、花粉香乙酸2.604.846.526.94酸味中带有刺激性臭味丙酸0.030.070.010.01闻有酸味、进口柔和微涩异戊酸1.321.118.243.97汗臭、酸臭、脂肪臭壬酸0.040.070.070.07脂肪臭肉豆蔻酸0.100.09－－异丁酸－0.52－0.24似丁酸样气味己酸－0.01－0.02汗臭、动物臭、酸臭、甜香、水果香葵酸－0.04－0.01山羊臭、酒稍子臭、胶皮臭、油漆臭棕榈酸甲酯0.080.05－0.07微弱蜡香、果爵和奶油香气棕榈酸乙酯0.180.270.080.36苹果香、味微甜、带涩油酸乙酯0.070.100.44－白色结晶、微有油味、脂肪气味不明显苯酚0.06－0.02－来苏水、似胶水、墨汁4-乙基愈创木酚0.320.3816.8911.51香瓜香、水果香、甜香、花香序列表中国食品发酵工业研究院有限公司山东扳倒井股份有限公司一株产茶香型风味的谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用2018-11-292SIPOSequenceListing1.03504DNA谢瓦散囊菌Eurotiumchevalieri3tgcgggccctctgggtccaacctcccatccgtgtctatctgtaccctgttgcttcggcgt60ggccacggcccgccggagactaacatttgaacgctgtctgaagtttgcagtctgagtttt120tagttaaacaatcgttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaaga180acgcagcgaaatgcgataattaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttg240aacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcc300ctcaagcacggcttgtgtgttgggcttccgtccctggcaacggggacgggcccaaaaggc360agtggcggcaccatgtctggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcccgtaggt420ccagctggcagctagcctcgcaaccaatctttttaaccaggttgacctcggatcaggtag480ggatacccgctgaacttaagcata5043382DNA谢瓦散囊菌Eurotiumchevalieri3cggtgctgctttctggtatgtccgcattataataagagtcagattgggtgatatactaac60agtatcacaggcagactatctccggcgagcacggtctcgacggctctggtgtgtaagtac120agtcgggtctccgagatggacgcgtatcggatatggatatctaaatggattgcagctaca180atggctcctccgacctccagttggagcgtatgaacgtctacttcaacgaggtttgcctaa240ttcattcgtgtctgtgtgggaaacagttctgacagtgacaggcctccaacaacaaatatg300tcccccgtgccgtcctcgtcgaccttgagcccggtaccatggacgccgtccgtgccggtc360ccttcggccagctcttccgtcc382

权利要求：1.一株产茶香型风味的谢瓦散囊菌CICC41587M9Eurotiumchevalieri，其特征在于所述菌种保藏编号为CGMCCNo.14623。2.如权利要求1所述的谢瓦散囊菌CICC41587M9Eurotiumchevalieri，其特征在于该菌株可产生茶香型风味物质。3.如权利要求2所述的谢瓦散囊菌CICC41587M9Eurotiumchevalieri，其特征在于所述的茶香型风味物质以1-辛烯-3-醇和芳樟醇为主导。4.如权利要求3所述的谢瓦散囊菌CICC41587M9Eurotiumchevalieri，其特征在于所述的1-辛烯-3-醇相对香气活度值ROAV为100；所述的芳樟醇相对香气活度值ROAV为17.98。5.如权利要求1所述的谢瓦散囊菌CICC41587M9Eurotiumchevalieri的应用，其特征在于该菌种强化生产的白酒大曲具有茶香型风味。6.如权利要求5所述的谢瓦散囊菌CICC41587M9Eurotiumchevalieri的应用，其特征在于所述的茶香型风味主要由1-辛烯-3-醇和芳樟醇为主导的风味物质带来。

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