申请/专利权人：浙江大学

申请日：2019-03-11

公开（公告）日：2020-06-23

公开（公告）号：CN109897828B

主分类号：C12N5/20(20060101)

分类号：C12N5/20(20060101);C07K16/10(20060101);G01N33/569(20060101);G01N33/577(20060101);C12R1/91(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.23#授权;2019.07.12#实质审查的生效;2019.06.18#公开

摘要：本发明公开了一种分泌抗李痘病毒Plumpoxvirus，PPV单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。利用原核表达的李痘病毒的外壳蛋白为抗原免疫BALBc小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗PPV单抗的杂交瘤细胞株4A8，其保藏号为CGMCCNo.17283。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10‑7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa轻链，该单抗与PPV的外壳蛋白亚基有特异反应。利用4A8单抗建立了检测梅树中PPV的TAS‑ELISA、dot‑ELISA检测方法，其中TAS‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:20480和1:5120倍稀释wv,gmL。抗PPV单抗的制备及其检测方法的建立为果园李痘病毒病的诊断和检测、进出口岸检验检疫及科学防控提供物质和技术支撑。

主权项：1.一种分泌抗李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A8，其特征在于能分泌抗李痘病毒单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞株4A8于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17283。

全文数据：分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用技术领域本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。背景技术李痘病毒病最先于1915年在保加利亚被发现，之后蔓延至整个欧美地区，给发病地区核果类果树造成严重危害。病原李痘病毒Plumpoxvirus,PPV由Atanasoff在李树上发现以来，现已分布于欧洲、在非洲、北美洲、南美洲、亚洲。自从2001年起，我国先后在湖南、南京、西安发现李痘病毒，我国农业农村部高度重视，将李痘病毒列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。PPV是马铃薯Y病毒科Potyviridae马铃薯Y病毒属Potyvirus病毒，能侵染多种木本科和草本科寄主。木本寄主主要包括具有经济重要性的桃、李、杏和樱桃等，草本寄主主要包括菊叶香藜、宝盖草、苋色藜等。寄主果树被侵染后各个部位均可表现明显症状：叶片出现褪绿环斑、叶脉黄化、扭曲畸形；花出现斑驳、畸形；果实出现斑驳、变形变小，大量果实提前脱落。PPV传播速度快，在短时间内即可给核果类果树带来毁灭性危害，引起灾难性的经济损失。PPV病毒粒子为弯曲杆状，长约660-770nm，宽约12-15nm。PPV基因组是一条大小9741–9795nt的正义单链RNA，基因组只有一个ORF，翻译产生一个360kDa大小的多聚蛋白，裂解成至少十个功能蛋白，分别是P1，HCPro，P3，6K1，CI，6K2，VPg，NIapro，NIb和CP。为了调查我国核果类果树上PPV的发病情况、强化我国李痘病毒病检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测PPV快速、经济、准确、高通量的检测技术。与常规的指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点，是植物病毒检测和调查最常用的方法。目前已有关于PPV抗体制备和血清学方法的报道，但已报道的PPV抗体和血清学方法的检测灵敏度欠佳，准确率不高。为此，本发明以重组的PPV衣壳蛋白CP作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗PPV的特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PPV的高通量的血清学方法，从而为我国李痘病毒的检测和诊断、进出口岸检验检疫、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株4A8，它能分泌抗李痘病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株4A8于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17283。一种所述的杂交瘤细胞分泌抗李痘病毒单克隆抗体，抗李痘病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与李痘病毒36kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用TAS-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测PPV感染病叶粗提液的灵敏度达到1:20480和1:5120倍稀释。抗李痘病毒单克隆抗体能与李痘病毒有特异性反应，而不与马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、苹果茎痘病毒和相应健康植物叶片粗提液反应。抗李痘病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本发明与现有技术相比具有的有益效果：1提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗李痘病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的TAS-ELISA、dot-ELISA血清学检测方法和免疫学试剂盒能高度特异、灵敏、准确地检测李痘病毒；2利用本发明所制备的单克隆抗体检测李痘病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于果园桃、杏、李等核果类果树李痘病毒的检测和诊断，也可用于该病毒病的进出口岸检验检疫和科学防控等方面。附图说明图1dot-ELISA方法检测PPV的特异性分析；样品1-1、样品1-2、样品2-1和样品2-2分别是感染PPV的上海、南京、武汉梅、山西杏叶片组织；3-4：分别是感染PVY和PVA的马铃薯叶片；5是感染ASPV的梨树叶片组织；6-8：分别是健康梅、杏和马铃薯叶片组织。图2dot-ELISA方法检测PPV的灵敏度分析；图3dot-ELISAA、TAS-ELISAB和RT-PCRC检测果园果树样品中PPV代表性结果；a1-5、b1-5、c1-5、d1-5、e1-5、f1-2分别是果园样品，f3和f4分别为感染PPV梅叶的阳性对照和健康梅叶的阴性对照。生物保藏分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株4A8于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.17283。具体实施方式分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株4A8于2019年1月25日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17283，它能分泌抗李痘病毒中国分离物单抗。一种所述的杂交瘤细胞分泌抗李痘病毒单克隆抗体，抗李痘病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与李痘病毒36kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用TAS-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测PPV感染病叶粗提液的灵敏度达到1:20480和1:5120倍稀释。抗李痘病毒单克隆抗体能与李痘病毒有特异性反应，而不与马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、苹果茎痘病毒和相应健康植物叶片粗提液反应。抗李痘病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗李痘病毒单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测PPV的高通量的血清学方法可成功应用于果园间PPV的检测和诊断、进出口岸检验检疫和科学防控等方面。下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备1.免疫原及检测抗原的制备根据GenBank中已经报道的PPV全基因组序列登录号：NC_001445，设计PPVCP基因的特异性引物：PPV-CP-F5’-GCCATGGCTGATATCGGATCCGCGGACGAAAGAGAAGACGA-3’,8577-8597nt和PPV-CP-R5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCACTCCCCTCACACCGAGG-3’,9502-9521nt。下划线处分别为BamHI、SalI酶切位点，引物由杭州擎科生物技术有限公司合成。按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒BiosciencesTaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit为TaKaRa公司产品中的方法提取感染PPV中国分离物的梅树叶片的总RNA具体操作参照试剂说明书进行，将提纯的RNA放置65℃金属浴中加热变性5min，取出后迅速冰上放置5min。反转录反应体系10μL如下：总RNA0.5μL4×DNMasterMix2μL混匀，37℃反应5min之后加入5×RTMasterMixⅡ2μL。RT-PCR程序设置：37℃45min；50℃5min；98℃5min后立即放在冰上，可保存在-20℃冰箱。PCR反应体系50μL如下：PCR程序设置：94℃变性3min；98℃变性10sec；55℃退火30sec；68℃延伸40sec；设置32个循环后68℃延伸10min，4℃保存。取PCR产物电泳检测。PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用DNA凝胶回收试剂盒AxyGEN回收PPVCP基因片段，具体操作参照试剂盒说明书进行。将纯化的PPVCP基因和pET-28a载体分别用BamHI和SalI进行双酶切，PPVCP基因和pET-28a载体的酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用DNA凝胶回收试剂盒AxyGEN分别回收酶切片段，酶切回收的PCR产物和pET-28a载体T4DNAligase连接后构建成重组载体pET-28a-PPV-CP，并42℃热击转化入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒AxyGEN提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR鉴定后通过测序验证重组克隆载体pET-28a-PPV-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST、GenBank数据库。把原核表达质粒pET-28a-PPV-CP42℃热击转化入大肠杆菌表达菌株BL21DE3中，挑取单菌落接种到含卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜，第二天早上按1:100的比例将培养物接种于含卡那霉素抗性的新鲜LB培养基中，振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为1mMIPTG诱导表达4h，离心收集菌体。部分菌体加入2×SDS-PAGE上样缓冲液悬浮，沸水中处理5-l0min，12000rpm离心后取上清10μ1进行12.5％SDS-PAGE电泳分析，其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书用Ni2+-NTAagaroseQiagen纯化目的蛋白，用尿素法洗脱PPVCP，重组表达蛋白经纯化后得到大小为44kDa的重组PPVCP蛋白。纯化的重组CP蛋白要进行透析处理除去尿素，之后作为免疫原及检测抗原制备杂交瘤细胞和单抗。2.免疫动物用透析PPVCP蛋白免疫7周龄BALBc雌性小鼠：纯化PPVCP重组蛋白100μL只与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹腔注射200μL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射200μL每只进行加强免疫，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。3.细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP20按5:1的比例在无血清的RPMI-1640Gibco培养基中混匀，1500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL50％PEG分子量1500融合剂，融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆细胞培养箱中培养5d后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％以上时，以表达纯化的PPVCP蛋白为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获63个阳性孔。对63孔进行特异性分析，筛选出10个呈特异性的细胞株，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗PPV的特异性单抗的杂交瘤细胞株4A8。经4个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。5.单克隆抗体腹水制备及纯化取8周龄左右BALBc小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷Sigma，7-10天后腹腔注入7×105个杂交瘤细胞，注射杂交瘤细胞后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.75％生理盐水稀释，室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液pH7.0，4℃过夜，10,000rpm离心20min，2mL0.85％生理盐水悬浮沉淀，在4℃透析24h后即获纯化的单抗，-80℃保存。6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALBc小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果分析4A8单抗亚类为IgG1、kappa轻链。以表达的纯化CP蛋白为包被抗原，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10－7。7.单克隆抗体的特异性检测以感染PPV的梅树叶和健康梅树叶分别为阳性对照和阴性对照，取感染PPV的杏叶、感染PVY的马铃薯叶片、感染PVA的马铃薯叶片、感染苹果茎痘病毒ASPV的梨树叶和对应健康的植物组织作为检测样品，用间接ELISA法测定单抗的特异性反应。间接ELISA方法的步骤：上述病毒感染的病叶和健康叶片分别用液氮研磨成粉末，按1:20wv,gmL加入ELISA包被液匀浆，5000rpm离心3min后100μl孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入1:5000倍稀释的单抗100μl孔，37℃1-2h；PBST洗涤三次后加1:8000倍稀释的碱性磷酸酯酶AP标记兔抗鼠IgG二抗Sigma公司100μl孔，37℃1-2h；PBST洗涤四次后用PNPP底物显色30-60min，2molL氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，与阴性OD值比值大于3.0的样品为阳性。结果发现，4A8单抗对PPV有特异性反应，而与感染PVY、PVA、ASPV的病叶和健康植物叶片粗提液均无任何反应。二、检测PPV血清学方法的建立1检测PPV的TAS-ELISA检测方法1.1TAS-ELISA方法的步骤：1PPV兔多抗血清用表达纯化的PPVCP蛋白免疫兔子获得用适量0.01MPBS稀释，100μL每孔加到ELISA板中，4℃包被过夜；2用PBS洗ELISA板3次，之后每孔加入250μL封闭液含3％脱脂奶的PBS，37℃封闭0.5-1h；3弃板中封闭液并洗净，将感染PPV病毒的梅树叶粗提液按1:20倍稀释wv,gmL加入ELISA板中，37℃孵育1h；4弃板中封闭液并洗净，加入100μL孔适当稀释的PPV单抗，37℃反应1h；5弃板中封闭液并洗净，加入100μL孔适当稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应1h；6PBST洗涤4次，毎次3min。毎孔加入100μLAP显色底物液后显色；7显色30-60min，使用Bio-Rad680酶标仪测OD405，记录数据。1.2检测PPVTAS-ELISA方法的建立将1:1000-1:128000倍比稀释的PPV多抗加入ELISA板过夜包被，之后加入感染PPV植物粗提液反应1h，加入1:1000-1:512000倍比稀释的PPV单抗反应1h，PBST洗涤后加入1:8000倍稀释液二抗反应。感染PPV梅树叶粗提液作为检测抗原的阳性对照，用健康梅树叶片的粗提液作为阴性对照，重复实验三次，选择检测最优组合为PPV多抗和一抗的最佳工作浓度。结果发现，PPV多抗和PPV单抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:5000倍稀释。根据PPV多抗、PPV单抗和AP标记的兔抗鼠IgG二抗的最适工作浓度建立检测PPV的TAS-ELISA方法。1.3TAS-ELISA方法及PPV单抗的特异性和灵敏度以感染PPV的梅树病叶和健康梅树叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PPV不同地方的梅树和杏树病叶、感染ASPV的梨叶、感染PVY的马铃薯叶片、感染PVA的马铃薯叶片和对应健康的植物组织粗提液作为检测样品，加到ELISA板中，重复实验三次，分析PPV单抗及建立的TAS-ELISA方法的特异性。该方法检测感染上海、南京和武汉的PPV梅树叶和感染PPV山西杏叶粗提液均呈强阳性反应，而检测感染ASPV、PVY、PVA植物叶片和对应健康植物叶片粗提液呈阴性反应，且对比差异极显著，说明该方法和单抗的特异性好。将感染PPV的梅树叶和健康梅树叶分别用PBS缓冲液从1:10倍至1:81,920倍wv,gmL倍比稀释，依次加到ELISA板，实验重复三次，分析TAS-ELISA方法检测PPV的灵敏度。结果表明，TAS-ELISA检测病叶的灵敏度达到1:20480倍稀释wv,gmL，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。2dot-ELISA检测方法的建立及其田间样品检测2.1方法步骤1用液氮研磨的梅树等叶片，按1:20wv,gmL比例加入0.01MPBS缓冲液，5000rpm离心3min，上清即为植物组织粗提液；2点样：取2-3μL粗提液点到NC膜上，37℃恒温箱烘干10min；337℃封闭液封闭0.5h后PPV单克隆抗体孵育1h；5洗膜：弃去一抗后用PBST洗膜3次，每次3min；637℃二抗孵育1h后洗膜4-5次，每次3min；7显色：用吸水纸把膜吸干，浸入NBTBCIP显色底物溶液中室温避光显色15-20min。当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变化时膜在自来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。2.2检测PPVdot-ELISA方法的建立从1:1000倍开始分别进行倍比稀释PPV单克隆抗体和AP标记的兔抗鼠IgG二抗，用方阵实验确定dot-ELISA方法中一抗和二抗的最适工作浓度。实验结果表明，一抗和二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:8000倍稀释。以一抗和二抗的最适工作浓度建立检测植物样品中PPV的dot-ELISA方法。2.3dot-ELISA方法的检测PPV的特异性和灵敏度以感染PPV的梅树病叶和健康梅树叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PPV不同地方的梅树和杏树病叶、感染ASPV的梨叶、感染PVY的马铃薯叶片、感染PVA的马铃薯叶片和对应健康的植物组织粗提液作为检测样品，进行dot-ELISA方法的特异性分析。该方法检测感染上海、南京和武汉的PPV梅树叶和感染PPV山西杏叶粗提液均呈强阳性反应，而检测感染ASPV、PVY、PVA植物叶片和对应健康植物叶片粗提液呈阴性反应图1，说明该方法和单抗的特异性好。取感染PPV的梅树叶研磨成粉末，用0.01MPBS从1:10至1:10240倍倍比稀释wv,gmL，同样对健康梅树叶片粗提液作相同的倍比稀释。用dot-ELISA方法检测感染PPV病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当PPV病叶粗提液稀释到1:5120倍wv,gmL时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:5120倍稀释图2。2017-2018年从南京、上海、山西等地的发病果园收集100份疑似发病样品，用制备的PPV单克隆抗体为核心建立的TAS-ELISA方法和dot-ELISA方法进行样品检测，用RT-PCR方法进行验证，并选取部分阳性样品进行测序验证。dot-ELISA方法和TAS-ELISA方法进行样品检测检测顺序一致,f3为阳性对照，f4为阴性对照，结果发现，27个代表性检测样品中有17个样品产生紫色的阳性斑点图3，并且在TAS-ELISA检测结果中，这17个dot-ELISA阳性样品也呈强阳性反应，且与阴性样品对比差异显著图4，这些样品进一步用RT-PCR检测分析，结果表明所有的dot-ELISA和TAS-ELISA阳性样品均检测到PPV特异性的PCR产物，而血清学方法检测阴性的样品中没有检测到特异性PCR产物，即RT-PCR检测阴性图5。PCR产物核酸测序和序列比对表明阳性样品确实感染PPV。说明dot-ELISA和TAS-ELISA方法能准确、可靠地用于核果类果树样品中PPV的检测。3.李痘病毒dot-ELISA检测试剂盒1试剂盒主要成分：以上试剂均保存于4℃硝酸纤维素膜NC10张2检测果树样品的操作步骤：a.果树组织称重、在研钵中研磨，按1:20比例wv,gmL加入0.01MPBSpH7.4后匀浆；b.匀浆液5000rpm离心3min；c.取2.5μl上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PPV的梅树组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST含0.05％Tween-20的0.01MPBS封闭液中室温封闭30min；e.NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:5000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；g.PBST洗膜4-5次，每次3min；h.66μlNBT和33μlBCIP底物加入到10mL底物缓冲液0.1MTrisCl、0.1MNaCl、0.025MMgCl、pH9.5中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。3保存及有效期：于2-8℃避光保存，有效期12个月。4缓冲液配方：磷酸盐缓冲液0.01MPBS，pH7.4：加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mLELISA洗涤液0.01MPBST：1000mL0.01MPBS中加0.5mLTween-20ELISA封闭液：0.01MPBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％wv,gmL。

权利要求：1.一种分泌抗李痘病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A8，其特征在于能分泌抗李痘病毒单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞株4A8于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17283。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗李痘病毒单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单克隆抗体与李痘病毒36kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用TAS-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测PPV感染病叶粗提液的灵敏度达到1:20480和1:5120倍稀释。3.如权利要求2所述的抗李痘病毒单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体能与李痘病毒有特异性反应，而不与马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、苹果茎痘病毒和健康植物叶片粗提液反应。4.一种如权利要求2所述的抗李痘病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

百度查询： 浙江大学 分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用

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