申请/专利权人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

申请日：2017-07-10

公开（公告）日：2020-07-17

公开（公告）号：CN107356752B

主分类号：G01N33/569(20060101)

分类号：G01N33/569(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.17#授权;2017.12.12#实质审查的生效;2017.11.17#公开

摘要：本发明涉及一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其检测方法和保存方法，属禽类免疫学技术领域。所述鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒包括：a乳胶检测试剂、b阳性对照品、c阴性对照品；其中，所述乳胶检测试剂是鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂，其能与鸭疫里默氏菌抗体产生特异性反应。本发明提供的检测试剂盒能直接对临床血清样品进行快速检测，且对各种血清型鸭疫里默氏菌抗体特异，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的特点，无需特殊仪器设备，操作简单、方便快捷、检测成本低，肉眼可判断结果，适合产品研发和大规模生产的要求。

主权项：1.一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：乳胶检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；其中，所述乳胶检测试剂是鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂，其由下述方法制备得到：（I）鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备；（II）鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备；其中，步骤（I）鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备包括：（一）所述鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的表达，具体步骤如下：（1）将pET-28a+-ompA重组质粒转化至感受态细胞BL21DE3；（2）挑取一个单菌落接种于5ml含50μgmL卡那霉素的LB液体培养液中，37℃振荡培养14h；（3）取4ml重组菌液接种于400ml含50μgmL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、160rmin振荡培养至OD600为0.7~0.75；（4）按体积比加入0.5%乙醇，同时加入终浓度为1.0mmolL的异丙基硫代半乳糖苷，26℃、160rmin诱导12h；（5）4℃、8000rmin离心10min，弃上清，沉淀用BufferA或PBS重悬，冰浴超声破菌，直到液体澄清透明；（6）4℃、8000rmin离心10min，收集上清，得鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA；其中，所述pET-28a+-ompA重组质粒由下述方法构建得到：根据GenBank公布的鸭疫里默氏菌ompA基因全序列，设计特异性引物，并分别在上游与下游插入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点；上游引物F：5’-CCCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3’，下游引物R：5’-CCGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTAC-3’；将以Ⅰ型鸭疫里默氏菌代表菌株的基因组为模板扩增的ompA基因与原核表达载体pET-28a+连接，转化后挑取20-25个单菌落提取质粒；（二）鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的纯化：将步骤（一）得到的含有鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的上清经过装有His-Bind树脂填料的镍亲和层析柱进行纯化；所述步骤（二）鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的纯化的具体过程如下：（1）先在空柱中加入3ml灭菌去离子水浸润滤芯，再取5mLNi-NTAHis-Bind树脂装入层析柱中，然后加入5个柱体积的结合缓冲液平衡柱子；（2）将步骤（一）制备好的含有鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的上清加入制备好的层析柱中，速度控制在0.6-1mLmin；（3）先后加入10个柱体积的结合缓冲液、6个体积的漂洗缓冲液洗掉杂蛋白；（4）封闭柱子底部，加入5个柱体积的洗脱缓冲液，静置15min后，打开柱子底部，收集洗脱溶液，重复数次，直至将吸附于柱材料上的目的蛋白全部洗脱；其中，所述结合缓冲液主要含5mM咪唑，pH7.8；所述漂洗缓冲液主要含60mM咪唑，pH7.8；所述洗脱缓冲液主要含1M咪唑，pH7.8；所述步骤（II）鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备包括下述步骤：（1）取摇匀的羧化聚苯乙烯乳胶400ul，用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm离心10min，弃上清；再用pH7.4，0.01M的PBS洗3遍，12000rpm离心10min，弃上清；（2）沉淀用pH7.4，0.01M的PBS重悬，逐滴加入2000uL含0.02gEDC的PBS，边加边振荡，于25℃100rmin振摇5h，12000rpm离心20min，弃上清；（3）沉淀用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液2000ul悬浮，洗涤3次后重悬，悬浮乳胶浓度为2%，4℃保存备用；（4）向步骤（3）制得的悬浮乳胶中逐滴缓慢加入鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA2000ul，于一定致敏温度下100rmin振摇一段时间；（5）加入0.1M乙醇胺20ul，于25℃缓慢振摇10min终止反应，12000rpm离心20min；（6）沉淀用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，再用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液4000ul悬浮，25℃100rmin振摇20min，得致敏好的乳胶检测试剂；所述鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的蛋白含量为0.25mgmL，所述致敏温度为25℃，所述振摇时间为4h。

全文数据：一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其检测方法和保存方法技术领域[0001]本发明涉及一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其检测方法和保存方法，属禽类免疫学技术领域。背景技术[0002]鸭疫里默氏菌Riemerellaanatipestifer，RA病是重要的水禽细菌病，是由鸭疫里默氏菌引起家鸭、火鸡、鹅和其它多种禽类的一种接触性传染病，又名鸭传染性浆膜炎，其主要的剖检病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等。该病感染宿主范围广，发病率和死亡率很高，易产生耐药性，且血清型众多，不同血清型之间缺乏免疫保护，给该病的防治工作带来很大困难，已对养鸭业造成了巨大的经济损失。虽然国内外已经先后报道了检测RA血清抗体的琼脂扩散试验、间接ELISA以及间接免疫荧光检测方法等，但这些方法存在灵敏度低、操作步骤繁琐、技术要求高等缺点，且只能在设备齐全和有经过专业训练人员的实验室条件下进行，不利于疫病的临床快速筛查。发明内容[0003]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒适合临床快速检测鸭疫里默氏菌抗体，对由鸭疫里默氏菌引起的疫病的流行病学调查及防控有重要意义。[0004]本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为：[0005]—种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：[0006]a乳胶检测试剂、[0007]b阳性对照品、[0008]c阴性对照品；[0009]其中，所述乳胶检测试剂是鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂，其能与鸭疫里默氏菌抗体产生特异性反应。[0010]按上述方案，优选地，所述鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备步骤包括：[0011]1鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备；[0012]2鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备。[0013]按上述方案，更优选地，所述鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备包括下述步骤：[0014]—鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的表达，具体如下：[0015]1质粒构建步骤:根据GenBank公布的鸭疫里默氏菌ompA基因全序列，设计了特异性引物，并分别在上游与下游插入BamHI和XhoI酶切位点，由上海生物工程技术服务有限公司合成：上游引物F:5’-CCCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3’，下游引物R:5’-CCGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTAC-3’;将以I型鸭疫里默氏菌代表菌株的基因组为模板扩增的ompA基因与原核表达载体pET-28a+连接，转化后挑取20-25个单菌落提取质粒并用BamHI和乂11〇1双酶切验证，电泳可见约120^口的条带、测序〇11^^基因全长为116仙口即为所构建重组质粒；[0016]2将已构建的pET-28a+-OmpA重组质粒转化至感受态细胞BL21DE3;[0017]3挑取一个转化后的单菌落接种于5ml含50ygmL卡那霉素的LB液体培养液中，37°C振荡培养14h;[0018]4取4ml重组菌液接种于400ml含50ygmL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、160rmin振荡培养至OD6QQ为0.7〜0.75大概需要3.5h;[0019]5按体积比加入0.5%乙醇，同时加入终浓度为1.0mm〇lL异丙基硫代半乳糖苷IPTG开始诱导，26°C、160rmin诱导12h;[0020]64°C、8000rmin离心lOmin，弃上清，沉淀用BufferA或PBS重悬，冰浴超声破菌，超声功率为300W，每破碎Imin休息2min，将菌体完全破碎，直到液体澄清透明（此时，鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA主要以可溶性形式表达在上清中）；[0021]74°C、8000rmin离心10min，收集上清（含有可溶性鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA，备用。[0022]二鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的纯化，即将步骤一得到的含有鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的上清经过装有His-Bind树脂填料的镍亲和层析柱，具体过程如下：[0023]1先在空柱中加入3ml灭菌去离子水浸润滤芯，再取5mLNi-NTAHis-Bind树脂装入层析柱中，然后加入5个柱体积的结合缓冲液平衡柱子；[0024]2将步骤一）制备好的含有鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的上清加入制备好的层析柱中，速度控制在0.6-lmLmin;[0025]3先后加入10个柱体积的结合缓冲液、6个体积的漂洗缓冲液洗掉杂蛋白；[0026]4封闭柱子底部，加入5个柱体积的洗脱缓冲液，静置15min后，打开柱子底部，收集洗脱溶液，重复数次，直至将吸附于柱材料上的目的蛋白全部洗脱下来。[0027]按上述方案，更优选地，所述结合缓冲液主要含5mM咪唑，pH7.8;所述漂洗缓冲液主要含60mM咪唑，pH7.8;所述洗脱缓冲液主要含IM咪唑，pH7.8。[0028]按上述方案，更优选地，所述鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备包括下述步骤：[0029]1取摇匀的羧化聚苯乙烯乳胶400ul，用pH9.6,0.IM碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm离心IOmin，弃上清；再用pH7·4，0·0IM的PBS洗3遍，12000rpm离心IOmin，弃上清；[0030]⑵沉淀用pH7·4，0·0IM的PBS重悬，逐滴加入2000uL含0·02gEDC的PBS，边加边振荡，于25°C100rmin振摇5h，12000rpm离心20min，弃上清；[0031]⑶沉淀用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液2000ul悬浮，洗涤3次后重悬，悬浮乳胶浓度为2%，4°C保存备用；[0032]4向步骤⑶制得的悬浮乳胶中逐滴缓慢加入鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA2000ul，于一定致敏温度下lOOrmin振摇一段时间；更优选地，所述鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的蛋白含量为0.25mgmL，所述致敏温度为25°C，所述振摇时间为4h此为最佳致敏条件；[0033]5加入0.1M乙醇胺20ul，于25°C缓慢振摇IOmin终止反应，12000rpm离心20min;[0034]6沉淀用pH8.0，0.0IM硼酸盐缓冲液洗3遍，再用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液4000ul悬浮，25°C100rmin振摇20min，即得致敏好的乳胶检测试剂，4°C保存。[0035]按上述方案，优选地，所述阳性对照品为抗鸭疫里默氏菌的鸭血的离心上清;所述阴性对照品为健康无鸭疫里默氏菌抗体的鸭血的离心上清。[0036]按上述方案，优选地，所述阳性对照品和阴性对照品的提取方法如下：[0037]分别采集相应的抗鸭疫里默氏菌的鸭血（阳性对照品）和健康无鸭疫里默氏菌抗体的鸭血（阴性对照品），5000rpm离心5min取上清。[0038]本发明还提供所述鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：[0039]1分别在IOu1阳性对照品、IOu1阴性对照品和IOu1待检样品中滴加IOu1所述的乳胶检测试剂，充分混匀，缓慢摇动，在浅黑色背景下观察2分钟；[0040]2结果判定：对照品2分钟内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照品与乳胶检测试剂作用出现“+++”以上的乳胶凝集，阴性对照品与乳胶检测试剂作用呈现原有的均匀乳状不凝集;待检样品在2分钟内如出现“++”以上的乳胶凝集判为阳性即待检样品中含有鸭疫里默氏菌抗体），如呈现原有均匀乳状判定为阴性即待检样品中不含有鸭疫里默氏菌抗体）。[0041]乳胶凝集结果判定：[0042]++++为100%的乳胶凝集，乳胶形成大的颗粒聚集在液滴边缘，液体呈现完全透明的状态如图Ι-a所示）；[0043]+++为75%的乳胶凝集，有明显的颗粒形成，液体稍浑浊如图Ι-b所示）；[0044]++为50%的乳胶凝集，有明显但较细的颗粒形成，液体比较浑浊如图1-c所示）；[0045]+为有些许的凝集，液体呈浑浊状态如图Ι-d所示）；[0046]-为不凝集，液滴呈现原有的均匀乳状如图Ι-e所示）。[0047]本发明还提供所述鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的保存方法，其特征在于，保存条件如下：[0048]a乳胶检测试剂，4°C保存；[0049]b阳性对照品，-20°C保存；[0050]c阴性对照品，-20°C保存。[0051]本发明原理如下：[0052]乳胶凝集试验是以聚苯乙烯乳胶颗粒为载体，将抗原或抗体吸附到载体上，用以检测相应的抗体或抗原的方法。常用的致敏乳胶的方式主要是物理吸附法和化学交联法，物理吸附法稳定性和敏感性较低，难以适合产品开发的需要。本发明选用化学交联法，利用带有羧基基团（-C00H的羧化聚苯乙烯乳胶为载体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺EDC为介质，通过化学反应将抗体分子偶联到乳胶表面，其稳定性和敏感性有很大的提高。此夕卜，鸭疫里默氏菌是一种重要的水禽病原，分为21个血清型，但一直缺乏一种可针对多种血清型适用的抗体检测试剂盒。外膜蛋白是革兰氏阴性菌特有的一种结构蛋白，具有良好的免疫原性，是亚单位疫苗的候选组成部分，成为目前的研究热点。外膜蛋白AOutermembranceproteinA,OmpA是革兰氏阴性菌外膜蛋白的表面抗原，广泛存在于多种血清型的RA菌株中，是RA全基因序列中相对保守的基因序列，为各血清型菌株共有的抗原。本发明选取鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂，并以该乳胶检测试剂为核心组装了一种用于检测鸭疫里默氏菌抗体的试剂盒，该试剂盒可快速检测鸭疫里默氏菌抗体，对该病的流行病学调查及防控有重要意义。[0053]本发明与现有技术相比，具有以下优点：[0054]1、本发明的检测试剂盒无需专门操作技能和任何特殊仪器设备，操作简单、方便快捷、检测成本低，肉眼可直接判断结果，适合临床现场快速筛查；[0055]2、本发明的检测试剂盒能直接对临床血清样品进行检测，且对各种血清型鸭疫里默氏菌抗体特异，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的特点；[0056]3、本发明的检测试剂盒利用带有羧基基团（-C00H的羧化聚苯乙烯乳胶为载体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺EDC为介质，通过化学反应将抗体分子偶联到乳胶表面，克服了乳胶致敏抗体时抗体容易脱落等缺点，提高了乳胶检测试剂的稳定性和敏感性，适合产品研发；[0057]4、本发明提供的试剂盒检测面宽，不受二抗的限制，不仅对鸭血清可直接进行检测，也可对鹅血清直接进行检测。附图说明[0058]图1为乳胶凝集结果判定图。具体实施方式[0059]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。[0060]实施例1[0061]鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备[0062]鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备包括表达和纯化，具体如下：[0063]1、质粒的构建:根据GenBank公布的鸭疫里默氏菌ompA基因全序列，设计了特异性引物，并分别在上游与下游插入BamHI和XhoI酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：上游引物F:5’-CCCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3’，下游引物R:5’-CCGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTAC-3’。将以I型鸭疫里默氏菌代表菌株的基因组为模板扩增的ompA基因与原核表达载体pET-28a+购自TaKaRa公司）连接，转化后挑取20-25个单菌落提取质粒。经用BamHI和XhoI双酶切验证，电泳可见约1200bp的条带、测序ompA基因全长为1164bp即为所构建重组质粒。[0064]2、蛋白的表达:从已构建的pET_28a+-ompA重组质粒中筛选出两个重组质粒转化至感受态细胞BL21DE3购自TaKaRa公司）；在转化的平皿中挑取一个单菌落接种于含50ygmL卡那霉素的5mlLB液体培养液中，37°C振荡培养14h;按照体积比1:100取4ml重组菌液接种于含50ygmL卡那霉素的400mlLB液体培养基中，于37°C振荡培养3.5h此时OD600约0.75;从中取出2ml重组菌液作未诱导对照，向其余菌液中加入终浓度为I.OmmolL的IPTG开始诱导表达目的蛋白，26°C条件下160rmin诱导12h后，4°C条件下8000rmin离心IOmin，弃上清，收集沉淀用BufferA或I3BS重悬，冰浴超声破菌超声条件为功率:300W，时间间隔:每破碎Imin休息2min，将菌体完全破碎，直到液体澄清透明，4°C条件下8000rmin离心1〇!11；[11，收集上清含有重组蛋白011^^。[0065]3、蛋白的纯化:将上述步骤1收集的含有重组蛋白ompA的上清过装有His-Bind树脂填料的镍亲和层析柱进行，过程如下：先在空柱中加入3ml灭菌去离子水浸润滤芯，再取5mLNi-NTAHis-Bind树脂装入层析柱中，加入5个柱体积的结合缓冲液主要含5mM咪唑，pH7.8平衡柱子;将步骤1制备好的含有重组蛋白ompA的上清加入制备好的层析株柱中，速度控制在0.6-lmLmin以内；先后加入10个体积的结合缓冲液、6个体积的漂洗缓冲液主要含60mM咪唑，pH7.8洗掉杂蛋白；封闭柱子底部，加入5个柱体积的洗脱缓冲液主要含IM咪唑，PH7.8，静置15min后，打开柱子底部，收集洗脱溶液，重复数次，直至将吸附于柱材料上的目的蛋白全部洗脱下来，得鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA。其中，结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液均由Ni-NTA缓冲液试剂盒采购自Merckmillipore公司）提供。[0066]实施例2[0067]鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA致敏乳胶试剂的制备[0068]鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA致敏乳胶试剂的制备，具体步骤如下：[0069]1取摇匀的羧化聚苯乙烯乳胶400ul放入IOml圆底EP管中；[0070]2用ρΗ9·6,0·IM碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm离心10min，弃上清；[0071]3再用pH7·4，0·0IM的PBS洗3遍，12000rpm离心IOmin，弃上清；[0072]⑷用ρΗ7·4,0·01Μ的PBS重悬，逐滴加入2000uL含0.02gEDC的PBS，边加边振荡，于摇床中25°C100rmin振摇5h，12000rpm离心20min，弃上清；[0073]5沉淀用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液2000ul悬浮，洗涤3次后重悬，悬浮乳胶浓度为2%，4°C保存备用；[0074]6向悬浮乳胶中逐滴缓慢加入实施例1制备的鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA2000ul所述重组蛋白含量0.25mgmL，于25°C100rmin振摇4h;[0075]7加入0.1M乙醇胺20ul，于25°C摇床中缓慢振摇IOmin终止反应，12000rpm，离心20min，收集上清；[0076]8沉淀用pH8.0，0.0IM硼酸盐缓冲液洗3遍，再用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液4000ul悬浮，25°C100rmin振摇20min即为致敏好的乳胶检测试剂，4°C保存。[0077]实施例3[0078]鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA致敏乳胶试剂的最佳致敏条件的确定[0079]通过一系列试验摸索，确定了鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA致敏乳胶试剂的最佳致敏条件：重组蛋白ompA最佳致敏蛋白量为0.25mgmL、最佳致敏时间为4h、最佳致敏温度为25°C。此时，蛋白的结合效率达到最大，乳胶检测的灵敏度最高，稳定性最好。具体摸索试验如下：[0080]1、2%羧化乳胶的制备:具体步骤同实施例2中步骤⑴至⑶。[0081]2、最佳致敏蛋白量的确定：[0082]将制备好的IOOu12%乳胶分别与IOOu1稀释好的不同浓度的重组蛋白ompA原液、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16进行偶联于25°C条件下100rmin振摇4h，然后加入0.IM乙醇胺5ul，于25°C摇床中缓慢振摇IOmin终止反应，12000rpm，离心20min，收集上清，测定上清中剩余的蛋白量，并按照下述公式计算蛋白的结合效率：[0083]初始蛋白含量-结合后上清蛋白含量初始蛋白含量X100%。[0084]同时将沉淀用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液洗3遍，再用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液200ul悬浮，25°C100rmin振摇20min，得致敏好的乳胶检测试剂。[0085]将致敏好的乳胶分别与阳性血清、阴性血清、BBS缓冲液、PBS缓冲液进行反应。根据重组蛋白ompA与乳胶的结合效率以及致敏好的乳胶与阳性血清、阴性血清、BBS缓冲液、PBS缓冲液反应情况确定最佳致敏浓度。[0086]结果如表1和表2所示，据此判定：当加入的蛋白量为0.25mgmL时，结合效率达到最大，此时乳胶检测的灵敏度最高，稳定性最好，故选择该加入量为蛋白致敏的最佳量。[0087]表1加入蛋白量与致敏蛋白量的关系最佳致敏蛋白量的确定）[0088][0089]表2加入蛋白量与敏感性关系[0090][0091][0092]3、最佳致敏时间的选择：[0093]在IOOuL2%乳胶中，加入IOOuL最佳致敏量的蛋白（0.25mgmL，分别于25°C条件下100rmin振摇致敏不同时间（lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h，作用完后，加入0.IM乙醇胺5ul，于25°C摇床中缓慢振摇IOmin终止反应，12000rpm，离心20min，收集上清，测定上清中剩余的蛋白量，计算蛋白的结合效率计算公式同上）。[0094]同时将沉淀用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液洗3遍，再用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液200ul悬浮，25°C100rmin振摇20min，得致敏好的乳胶检测试剂。[0095]将致敏好的乳胶分别与阳性血清、阴性血清、BBS缓冲液、PBS缓冲液进行反应，最佳致敏时间的选择由致敏后乳胶特性及致敏效率决定。[0096]结果如表3和表4所示，据此判定：当结合时间达到4h时，结合效率达到最大，敏感性最高，所以选用4h作为最佳致敏时间。[0097]表3最佳致敏时间[0098][0099]表4不同偶联时间与敏感性关系[0100][0101][0102]4、最佳致敏温度的选择:不同致敏温度影响到乳胶对重组蛋白ompA的结合效率，故选取37°C、25°C分别进行试验，蛋白结合率计算公式同上。致敏后的乳胶分别与阳性血清、阴性血清、PBS缓冲液、BBS缓冲液进行反应，最佳致敏时间的选择由致敏效率及致敏后乳胶特性决定。结果如表5和表6所示，据此判定：当温度在25°C时结合效率最大，故选用25°C作为最佳致敏时间。[0103]表5最佳致敏温度[0104][0105]表6不同致敏温度与敏感性关系[0106][0107]乳胶凝集结果判定:++++为100%的乳胶凝集，乳胶形成大的颗粒聚集在液滴边缘，液体呈现完全透明的状态（如图l_a;+++为75%的乳胶凝集，有明显的颗粒形成，液体稍浑浊如图l_b;++为50%的乳胶凝集，有明显但较细的颗粒形成，液体比较浑浊如图ΙΟ;+有些许的凝集，液体呈浑浊状态如图Ι-d不凝集，液滴呈现原有的均匀乳状如图1-e。结果以出现++以上的乳胶凝集为阳性。[0108]实施例4[0109]鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的组装[0110]1、鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，包括[0111]1乳胶检测试剂1管ImV管[0112]2阳性对照品1管0.5ml管[0113]3阴性对照品1管0.5ml管[0114]2、相关溶液的制备[0115]1阳性对照品的制备:采集抗鸭疫里默氏菌的鸭血，5000rpm，5min离心取上清，-20°C保存备用；[0116]2阴性对照品的制备:采集健康无鸭疫里默氏菌抗体的鸭血，5000rpm，5min离心取上清，-20°C保存备用；[0117]3乳胶检测试剂的制备:具体步骤同实施例2,4°C保存备用。[0118]实施例5[0119]鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的使用方法[0120]1、样品的处理:将收集到的待检血清样品整理、编号。[0121]2、被检样品的检测：[0122]1于干净的玻片或玻板上分别滴加IOul阳性对照品、IOul阴性对照品和IOul待检样品。然后再向阳性对照品、阴性对照品、待检样品中滴加IOul所述的乳胶检测试剂，搅拌均匀，在浅黑色背景下观察2分钟。[0123]2结果判定：对照品2分钟内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照品与乳胶检测试剂作用出现+++以上的乳胶凝集，阴性对照品与乳胶检测试剂不凝集;待检样品在2分钟内出现++以上的乳胶凝集判为阳性，呈现原有均匀乳状判定为阴性。[0124]本发明的检测试剂盒能直接对临床血清样品进行检测，若样品中含有鸭疫里默氏菌抗体，则乳胶检测试剂在2分钟内出现++以上的乳胶凝集，即可判为阳性结果;若样品中不含有鸭疫里默氏菌抗体，则乳胶检测试剂在2分钟内液滴仍然呈现原有的均匀乳状，即可判为阴性结果。[0125]实施例6[0126]鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的初步应用[0127]1、灵敏性试验：将阳性血清系列稀释（1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640……），用实施例4组装的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒进行检测，检测结果表明血清稀释1:320倍时仍能检测到鸭疫里默氏菌特异性抗体，表明本发明的乳胶凝集抗体检测试剂盒具有很好的敏感性试验结果如表7。[0128]表7灵敏性试验结果[0129][0130]2、特异性试验:在相同条件下，用实施例4组装的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒检测鸭大肠杆菌阳性血清、鸭黄病毒阳性血清及鸭副粘病毒阳性血清等鸭主要疫病血清以及鸭疫里默氏菌阳性血清，检测结果表明除与鸭疫里默氏菌阳性血清呈阳性反应夕卜，与鸭大肠杆菌阳性血清、鸭黄病毒阳性血清等鸭其它主要疫病阳性血清均呈阴性反应，表明试剂盒具有很好的特异性试验结果如表8。[0131]表8特异性试验结果[0132][0133]3、重复性试验[0134]3.1、批内重复性试验:按照实施例4的步骤制备3批鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒试剂盒批号分别为1601、1602、1603，每批次5个，在每批次试剂盒中随机抽取3个试剂盒对阳性对照品、阴性对照品、鸭大肠杆菌阳性血清、鸭黄病毒阳性血清及鸭副粘病毒阳性血清进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性，并检测乳胶是否自凝试验结果如9。结果表明其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明批内重复性良好。[0135]表9批内重复性试验[0136][0137]3.2、批间重复性试验:选取在不同时间按照实施例4的步骤制备的3批鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒试剂盒批号分别为1601、1602、1603，对同一份阳性对照品、阴性对照品、鸭大肠杆菌阳性血清、鸭黄病毒阳性血清及鸭副粘病毒阳性血清进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性，并检测乳胶是否自凝试验结果如表10。结果表明其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明批间重复性良好。[0138]表10批间重复性试验[0139][0140]4、符合率试验:分别采用本发明实施例4组装的乳胶凝集抗体检测试剂盒和ELISA检测方法同时对无鸭疫里默氏菌疫苗免疫的鸭血清30份和免疫了鸭疫里默氏菌疫苗的鸭血清30份样品进行检测试验结果如表11，比较两种方法的符合率。结果显示本发明组装的乳胶凝集抗体检测试剂盒检出阳性样品28份，阳性检出率为93.33%;检出阴性样品32份，阴性检出率为100%;与ELISA检测结果比较，总符合率为96.67%。说明该乳胶凝集抗体检测试剂盒具有与ELISA检测方法相当的敏感性，同时具有更高的特异性。[0141]表11符合率试验结果[0142]

权利要求：1.一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：a乳胶检测试剂、b阳性对照品、c阴性对照品；其中，所述乳胶检测试剂是鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂。2.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为抗鸭疫里默氏菌的鸭血的离心上清；所述阴性对照品为健康无鸭疫里默氏菌抗体的鸭血的离心上清；所述阳性对照品和阴性对照品的提取方法如下：分别采集相应的抗鸭疫里默氏菌的鸭血和健康无鸭疫里默氏菌抗体的鸭血，5000rpm离心5min取上清。3.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂由下述方法制备得到：I鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备；II鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备。4.根据权利要求3所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述步骤I鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的制备包括下述步骤：一鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的表达：1将pET-28a+-ompA重组质粒转化至感受态细胞BL21DE3;⑵挑取一个单菌落接种于5ml含50ygmL卡那霉素的LB液体培养液中，37°C振荡培养14h；3取4ml重组菌液接种于400ml含50ygmL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、160rmin振荡培养至0D_为0·7〜0·75;⑷按体积比加入〇.5%乙醇，同时加入终浓度为I.OmmolL的异丙基硫代半乳糖苷，26°C、160rmin诱导12h;54°C、8000rmin离心IOmin，弃上清，沉淀用BufferA或I3BS重悬，冰浴超声破菌，直到液体澄清透明；64°C、8000rmin离心IOmin，收集上清，得鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA。二鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的纯化：将步骤一得到的含有鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的上清经过装有His-Bind树脂填料的镍亲和层析柱进行纯化。5.根据权利要求4所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述pET-28a⑴-ompA重组质粒由下述方法构建得到：根据GenBank公布的鸭疫里默氏菌ompA基因全序列，设计特异性引物，并分别在上游与下游插入BamHI和XhoI酶切位点；-CCCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3,，下游弓I物R:5’-CCGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTAC~3,；将以I型鸭疫里默氏菌代表菌株的基因组为模板扩增的ompA基因与原核表达载体pET-28a⑴连接，转化后挑取20-25个单菌落提取质粒。6.根据权利要求4所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述步骤二鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的纯化的具体过程如下：1先在空柱中加入3ml灭菌去离子水浸润滤芯，再取5mLNi-NTAHis-Bind树脂装入层析柱中，然后加入5个柱体积的结合缓冲液平衡柱子；⑵将步骤一）制备好的含有鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的上清加入制备好的层析柱中，速度控制在〇.6-lmLmin;⑶先后加入10个柱体积的结合缓冲液、6个体积的漂洗缓冲液洗掉杂蛋白；⑷封闭柱子底部，加入5个柱体积的洗脱缓冲液，静置15min后，打开柱子底部，收集洗脱溶液，重复数次，直至将吸附于柱材料上的目的蛋白全部洗脱；其中，所述结合缓冲液主要含5mM咪唑，pH7.8;所述漂洗缓冲液主要含60mM咪唑，PH7.8;所述洗脱缓冲液主要含IM咪唑，pH7.8。7.根据权利要求3所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，所述步骤II鸭疫里默氏菌外膜蛋白ompA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂的制备包括下述步骤：⑴取摇匀的羧化聚苯乙烯乳胶400ul，用pH9.6，0.IM碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm离心IOmin，弃上清;再用pH7·4，0·OlM的PBS洗3遍，12000rpm离心IOmin，弃上清；⑵沉淀用PH7·4，0·0IM的PBS重悬，逐滴加入2000uL含0·02gEDC的PBS，边加边振荡，于25°C100rmin振摇5h，12000rpm离心20min，弃上清；3沉淀用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液2000ul悬浮，洗涤3次后重悬，悬浮乳胶浓度为2%，4°C保存备用；⑷向步骤3制得的悬浮乳胶中逐滴缓慢加入鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA2000ul，于一定致敏温度下l〇〇rmin振摇一段时间；；⑶加入0·IM乙醇胺20ul，于25°C缓慢振摇IOmin终止反应，12000rpm离心20min;6沉淀用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液洗3遍，再用pH8.0，0.OlM硼酸盐缓冲液4000ul悬浮，25°C100rmin振摇20min，得致敏好的乳胶检测试剂。8.根据权利要求7所述的鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于，步骤⑷中，所述鸭疫里默氏菌重组蛋白ompA的蛋白含量为0.25mgmL，所述致敏温度为25°C，所述振摇时间为4h。9.权利要求1-8任一项所述鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：1分别在IOul阳性对照品、IOul阴性对照品和IOul待检样品中滴加IOul所述的乳胶检测试剂，混匀，观察2分钟；2结果判定：对照品2分钟内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照品与乳胶检测试剂作用出现“+++”以上的乳胶凝集，阴性对照品与乳胶检测试剂作用呈现原有的均匀乳状不凝集；待检样品在2分钟内如出现“++”以上的乳胶凝集判为阳性，如呈现原有均匀乳状判定为阴性。10.权利要求1-8任一项所述鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的保存方法，其特征在于，保存条件如下：a乳胶检测试剂，4°C保存；b阳性对照品，-20°C保存；c阴性对照品，_20°C保存。

百度查询： 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鸭疫里默氏菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其检测方法和保存方法

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