申请/专利权人：北京佑仁生物科技集团有限公司;河北佑仁生物科技有限公司;秦皇岛佑仁生物科技有限公司

申请日：2019-06-30

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN110218699B

主分类号：C12N5/0775(20100101)

分类号：C12N5/0775(20100101);C12N5/077(20100101);A61K35/32(20150101);A61P19/08(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.10#公开

摘要：本发明通过提供一种分离及培养脂肪干细胞的方法，其中使用了细胞活性激发肽来提高细胞的繁殖活性，增加细胞的繁殖速度，特别是在后期的诱导分化过程中也能够很好的提高分化细胞的生长速度，提高分化成功率和效果，具有较好的应用前景。

主权项：1.一种诱导脂肪干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于：（1）分离并培养脂肪干细胞：取皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2～3次，在无菌条件下把脂肪组织剪碎成0.5mm2的组织块，加入2倍体积容量的0.075%Ⅰ型胶原酶和0.1％胰酶在37℃下20rmin振荡消化1h，进行消化分离；经70μm细胞筛过滤，4℃下1500rmin离心10min，弃上清；红细胞裂解液处理5min，加入PBS，4℃下1500rmin离心10min，弃上清；以4000细胞cm2的密度接种于培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清以及0.05%细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM；48h后首次换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞；此后每3d换液，观察细胞的形态变化，去除未贴壁细胞，直至不含有未贴壁的细胞；当纯净的细胞达到80%融合时，按1∶3进行传代，传代培养基为含10％胎牛血清以及0.1%细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM；（2）诱导分化前述分离培养的脂肪干细胞：使用含有l0nM的地塞米松和15mgL羟基磷灰石的DMEM诱导步骤（1）的人脂肪干细胞成骨分化24h；第二天细胞更换至成骨培养液:细胞培养基DMEM+10%胎牛血清,10mM3-磷酸甘油醛，60mM抗坏血酸，10nM地塞米松，0.05%细胞活性激发肽SEQIDNO：1和15mgL羟基磷灰石；成骨培养液每两天更换一次，培养8-14d即可。

全文数据：脂肪干细胞快速培养及分化方法技术领域本申请属于干细胞领域，具体涉及脂肪干细胞的快速培养方法。背景技术脂肪干细胞adiposetissue-derivedstemcells，ADSCs又称脂肪间充质干细胞或加工的脂肪吸收PLA细胞。于2001年由Zuk等首次从人类的抽脂手术切除的脂肪组织中分离获得。ADSCs是一种具有自我更新、活力持久和多向分化潜能的成体间充质干细胞，具有稳定的生长和增殖能力。与胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞相比，ADSCs易于获得，且无伦理学问题。在不同的诱导分化培养基中，ADSCs可分化成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、甚至神经细胞等中胚层细胞。此外，ADSCs还有广泛的分泌功能包括分泌抗炎性细胞因子、趋化因子和生长因子等。通过一系列的细胞因子、趋化因子和生长因子的旁分泌作用，ADSCs有抗细胞凋亡、促血管生成、抗炎和免疫调节等作用。目前脂肪干细胞的分离方法有很多种，主要有如下几种形式。组织块贴壁法：组织块贴壁法的主要操作步骤是将适宜大小和数目的脂肪组织块接种到培养瓶皿中，再加入培养液，2～3d即可看到从组织块中移行出来的细胞，10～12d达到90％左右的融合。此法操作简单、便捷、成本低，难处是在操作中组织块很容易脱落，导致样品的浪费。为提高脂肪组织块贴壁的牢固性，本实验室首先用无菌滤纸吸掉脂肪组织表面附着的水分，剪碎脂肪组织，接种，培养瓶皿置于培养箱内倒置培养20～30min后再轻柔地加入适量的培养液。酶消化法：酶消化法的主要步骤是将酶加入被剪成糜状的脂肪组织中，37℃消化一段时间后，再经过滤、洗涤、离心等步骤得到血管基质成分。此法存在的缺点：①操作时间过长、成本高，尤其在需要分离大批量样品时显得尤为突出。②在酶的种类、浓度、消化时间上参差不齐，缺乏标准，Ⅰ型胶原酶为主流的酶类，也有少数研究者采用Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅷ型胶原酶、胰酶或者胶原酶联合胰酶，酶的工作浓度从0.05～2.5gL不等，消化时间范围为0.5～3h。③酶的纯度不高，可能含有内毒素、色素、异种抗原等。④需要的样本量较大，当样本量不足时，不能得到足够量的脂肪干细胞用于实验研究。机械分离法：在装有吸脂产物的试管中加入适量磷酸盐缓冲液并用力摇晃试管1～2min，待脂肪组织出现明显分层时，收集下层液体，将上层漂浮的脂肪组织再次洗涤2～3次，然后将得到的所有下层液体1200rmin离心5min，最后接种细胞沉淀物即可得到人脂肪干细胞。与Ⅰ型胶原酶消化法相比较，两种方法获得的人脂肪干细胞拥有相似的成骨成脂分化能力，并且由直接离心法获得的人脂肪干细胞造血干细胞相关标志物CD34、CD45的表达量更低，脂肪干细胞相关的细胞表型标志物CD44、CD73、CD90的表达量更高，但是直接离心法的细胞产量比Ⅰ型胶原酶消化法低19倍，所需增殖时间比Ⅰ型胶原酶消化法长2.5倍。另有研究者将吸脂产物用800g或1280g离心15min后，用红细胞裂解液处理细胞5min，再600g离心10min，接种收集得到的细胞可分离出人脂肪干细胞，但是接种的细胞培养14d后失去了增殖能力。胶原酶结合组织块贴壁法：将Ⅰ型胶原酶消化所得的血管基质成分以及未消化完全的小鼠脂肪组织块一起接种到培养皿中，8～9d可得到小鼠脂肪干细胞。此法可以充分利用脂肪组织。悬浮培养法：本实验室将获取的SD大鼠脂肪组织剪成绿豆大小后接种到培养皿中，加入适量培养液使脂肪组织块处于悬浮状态，获得的脂肪干细胞具有较好的增殖能力，表达脂肪干细胞相关的细胞表型标志物CD29、CD44，并具有成脂成骨分化能力。将脂肪干细胞分离后，需要对干细胞进行培养。干细胞的培养方式有2D、3D两种。以培养瓶皿、细胞板为介质的2D平面培养是干细胞主要的培养方式，此方法操作简单、价格理想，缺点是无法模拟生物体内干细胞所存在的3D微环境、繁殖效率较低。3D培养方式的生物微环境与体内细胞生长环境有着较高的相似度，可更直观地观察干细胞的生物学特性。对于3D干细胞培养，其先决条件是构架适宜的3D支架。现有支架材料有天然材料如胶原、透明质酸、壳聚糖、纤维蛋白等，合成材料如聚乳酸、聚已酸内酯、聚乙烯对苯二甲酸酯等，新型复合材料如丝素蛋白壳聚糖、胶原纤维蛋白、聚己内酯壳聚糖等。相对于传统的2D培养，ASCs在3D培养方式中表现出更加优异的生物学特性。如人ASCs在3D培养方式下成脂成骨能力增强，细胞基质成分、血管生成因子、抗凋亡因子、抗氧化因子、抗炎性蛋白的表达量更高，培养液对肝细胞损伤和凋亡的保护作用更强，对小鼠肝纤维化、小鼠后肢缺血、缺血再灌注急性肾损伤大鼠的治疗效果更好。大鼠ASCs在3D培养方式下对人肝癌细胞株和人肝母细胞瘤细胞系HepG2生长的抑制作用增强，其原理是下调上皮间质转化信号。发明人在前期的研究发现，脂肪干细胞的分离方式以及诱导培养条件对于后续的靶向诱导细胞的获得有着巨大的影响。比如CN102002478B公开了一种脂肪干细胞的分离培养方法。方法包括从脂肪组织中分离获取、培养SVF细胞，其特征在于还包括以下步骤：用免疫磁珠分选法除去SVF细胞中的Lin+细胞，获得Lin-细胞群；用流式细胞分选法从获得的Lin-细胞群中富集CD271+Sca-1+细胞，得到脂肪干细胞；将获得的脂肪干细胞用含有LIF、FGF2的培养基培养。但是该方法获得脂肪干细胞传代次数较少，不适宜大规模推广应用。CN104164403B一种提取及培养脂肪干细胞的方法，步骤为：1取人脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗；2将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，3静置分层：将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞；4将获得的干细胞按照2-3×104cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于培养箱中进行培养。同样的，该方法制备得到的细胞传代次数也有待改进，细胞活性也有待加强。基于现有技术的缺陷，针对脂肪干细胞的分离以及培养方法需要迫切的改进和提高。发明内容本发明提供一种改进的脂肪干细胞的分离和培养方法。进一步的，本发明提供一种分离及培养脂肪干细胞的方法，取皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2～3次，在无菌条件下把脂肪组织剪碎成0.5mm2的组织块，加入2倍体积容量的0.075％Ⅰ型胶原酶和0.1％胰酶在37℃下20rmin振荡消化1h，进行消化分离。经70μm细胞筛过滤，4℃下1500rmin离心10min，弃上清。红细胞裂解液处理5min，加入PBS，4℃下1500rmin离心10min，弃上清。以4000细胞cm2的密度接种于培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清以及0.05％细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM。48h后首次换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞。此后每3d换液，观察细胞的形态变化，去除未贴壁细胞，直至不含有未贴壁的细胞。当纯净的细胞达到80％融合时，按1∶3进行传代，传代培养基为含10％胎牛血清以及0.1％细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM。本发明另外提供一种促进细胞生长的活性激发肽，其序列如SEQIDNO：1所示。本发明另外提供一种诱导脂肪干细胞分化成为成骨细胞的方法，使用含有l0nM的地塞米松Sigma,StLouis,MO,USA和15mgL羟基磷灰石的DMEM诱导传代16代的人脂肪干细胞成骨分化24h。第二天细胞更换至成骨培养液:细胞培养基DMEM+10％胎牛血清,10mM3-磷酸甘油醛，60mM抗坏血酸，1OnM地塞米松，0.05％细胞活性激发肽SEQIDNO：1和15mgL羟基磷灰石。成骨培养液每两天更换一次，培养8-14d即可。更进一步的，所述的诱导分化培养也可以是本领域常规的其他诱导培养基。再进一步的，所述的细胞分化效果采用本领域常规的检测方法进行检测。附图说明图1脂肪干细胞表面标志物检测图。图2加多肽培养基培养的脂肪干细胞生长曲线图。图3不加多肽培养基培养的脂肪干细胞生长曲线图。图4COL1A1蛋白表达情况分析图，其中泳道1是阴性对照蛋白表达量；泳道2是阳性对照蛋白表达量；泳道3是本发明诱导方法导致的蛋白表达量。有益效果本发明通过提供一种分离及培养脂肪干细胞的方法，其中使用了细胞活性激发肽来提高细胞的繁殖活性，增加细胞的繁殖速度，特别是在后期的诱导分化过程中也能够很好的提高分化细胞的生长速度，提高分化成功率和效果，具有较好的应用前景。具体实施方式下文将利用以下实例进一步说明本发明。应了解，这些实例只是出于说明的目的提供。因此，本发明不受下文所述说明性实例的限制，而是由上文所含权利要求书界定。所属领域技术人员显而易见，可在不偏离本发明精神和范围的情况下，进行许多改变和修改。实施例1脂肪干细胞的分离取健康志愿者皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2～3次，，在无菌条件下把脂肪组织剪碎成0.5mm2的组织块，加入2倍体积容量的0.075％Ⅰ型胶原酶和0.1％胰酶在37℃下20rmin振荡消化1h，进行消化分离。经70μm细胞筛过滤，4℃下1500rmin离心10min，弃上清。红细胞裂解液处理5min，加入PBS，4℃下1500rmin离心10min，弃上清。以4000细胞cm2的密度接种于培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清以及0.05％细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM。48h后首次换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞。此后每3d换液，观察细胞的形态变化，去除未贴壁细胞，直至不含有未贴壁的细胞。当纯净的细胞达到80％融合时，按1∶3进行传代，传代培养基为含10％胎牛血清以及0.1％细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM。另外，80％融合的细胞使用含1％BSA的PBS液冲洗，胰蛋白酶消化分离，再悬浮于PBS液中。5OuL细胞悬液在黑暗中与荧光染色的单核抗体共孵化1小时，使用PBS液冲洗3遍，最后使用流式细胞分析仪进行分析。结果如图1所示，CD105,CD73和CD90高表达，而CD45,CD34和CD14不表达，表明获得了较为纯净的脂肪干细胞。实施例2细胞的增殖速度实验采用MTT法，取P3，P4，P5代对数生长期细胞，以4000细胞孔接种96孔板，分为4组，每组三个复孔，37℃，5％CO2培养箱中培养。每隔24h加入MTT溶液5mgmL，继续孵育4h，终止培养，吸弃培养上清液。每孔加150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。比色:选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线，以不加多肽的培养基作为对照，从图2可以看出，本发明制备得到的脂肪干细胞培养方法具有较快的细胞培养速度，在培养时间为250h时OD达到了0.71±0.03。而从图3可以看出，不加多肽培养基培养的脂肪干细胞在250h时OD值只有0.52±0.04，细胞的繁殖速度相对不高。实施例3脂肪干细胞诱导分化能力鉴定使用含有l0nM的地塞米松Sigma,StLouis,MO,USA和15mgL羟基磷灰石的DMEM诱导传代16代的人脂肪干细胞成骨分化24h。第二天细胞更换至成骨培养液:细胞培养基DMEM+10％胎牛血清,10mM3-磷酸甘油醛，60mM抗坏血酸，1OnM地塞米松，0.05％细胞活性激发肽SEQIDNO：1和15mgL羟基磷灰石。成骨培养液每两天更换一次，培养8-14d即可。以不加肽的诱导能力为阳性对照，以不加诱导剂的DMEM和胎牛血清为阴性对照。qRT-PCR结果分析通过对诱导ADSCs基因表达量检测，分析了ADSCs成骨相关基因表达的影响。结果如下表1所示：相对表达量ALPCOL1A1OPNRunx2实施例31111阳性对照0.610.530.700.43阴性对照0.120.100.210.08另外提供WESTERNBLOT进行COL1A1蛋白表达情况分析，从图4可以看出，在蛋白层面上，COL1A1蛋白的表达量在本发明诱导方法情况下比不加肽的诱导能力有显著的提高。实施例4高传代成骨诱导及检测将实施例2培养的脂肪干细胞相同条件下继续传代培养至P60，然后按照实施例3的方法进行成骨诱导检测，结果发现该脂肪干细胞在P60时，仍具备较好的成骨诱导分化能力，成骨诱导后的细胞产生了大量钙盐并且可用茜素红-S染为红色，而没有添加肽传代的脂肪干细胞在60代之后基本无红色染色效果，无成骨诱导能力。这说明该活性肽能够较好的提高脂肪干细胞的生物活性以及维持干细胞状态。本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。序列表山东如戴生物科技有限公司脂肪干细胞快速培养及分化方法1SIPOSequenceListing1.0151PRT2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum1ArgAspTrpHisAsnGluProSerAsnGlnPheGlyHisPheAlaVal151015HisHisGlySerTrpGlnSerGlnArgCysPheHisPheProProGlu202530ArgProArgHisPheGluHisIleGlnLysSerHisGlnIleLeuLeu354045LysGlnHis50

权利要求：1.一种诱导脂肪干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于：1分离并培养脂肪干细胞：取皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2～3次，在无菌条件下把脂肪组织剪碎成0.5mm2的组织块，加入2倍体积容量的0.075％Ⅰ型胶原酶和0.1％胰酶在37℃下20rmin振荡消化1h，进行消化分离。经70μm细胞筛过滤，4℃下1500rmin离心10min，弃上清；红细胞裂解液处理5min，加入PBS，4℃下1500rmin离心10min，弃上清；以4000细胞cm2的密度接种于培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清以及0.05％细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM。48h后首次换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞；此后每3d换液，观察细胞的形态变化，去除未贴壁细胞，直至不含有未贴壁的细胞；当纯净的细胞达到80％融合时，按1∶3进行传代，传代培养基为含10％胎牛血清以及0.1％细胞活性激发肽SEQIDNO：1的DMEM；2诱导分化前述分离培养的脂肪干细胞：使用含有l0nM的地塞米松和15mgL羟基磷灰石的DMEM诱导步骤1的人脂肪干细胞成骨分化24h；第二天细胞更换至成骨培养液:细胞培养基DMEM+10％胎牛血清,10mM3-磷酸甘油醛，60mM抗坏血酸，1OnM地塞米松，0.05％细胞活性激发肽SEQIDNO：1和15mgL羟基磷灰石；成骨培养液每两天更换一次，培养8-14d即可。2.一种促进细胞生长的活性激发肽，其序列如SEQIDNO：1所示。3.权利要求2所述的激发肽在促进脂肪干细胞生长及成骨分化中的用途。4.权利要求1所述的方法诱导产生的成骨细胞在治疗疾病中的用途。

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