申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2017-10-20

公开（公告）日：2020-09-01

公开（公告）号：CN107574229B

主分类号：C12Q1/6841(20180101)

分类号：C12Q1/6841(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.09.30#未缴年费专利权终止;2018.02.06#实质审查的生效;2018.01.12#公开

摘要：本发明提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用。探针组包括Aml、ACT6、GAA6、TTG6四种探针，其中Aml的碱基序列为：5′‑GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT‑3′；ACT6的碱基序列为：5′‑ACTACTACTACTACTACT‑3′；GAA6的碱基序列为：5′‑GAAGAAGAAGAAGAAGAA‑3′；TTG6的碱基序列为：5′‑TTGTTGTTGTTGTTGTTG‑3′。该探针组为识别燕麦属植物染色体的18‑51bp寡序列探针，有助于建立稳定便捷的荧光原位杂交反应体系。

主权项：1.一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，包括Aml、ACT6、GAA6、TTG6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：5′-GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT-3′，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体；所述ACT6探针的碱基序列为：5′-ACTACTACTACTACTACT-3′，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构；所述GAA6探针的碱基序列为：5′-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3′，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构；所述TTG6探针的碱基序列为：5′-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3′，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。

全文数据：一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用技术领域[0001]本发明属于荧光原位杂交探针的应用领域，具体涉及一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用。背景技术[0002]现有检测燕麦属植物染色体的方法有C带，GISH，FISH，等。C带能使异染色质着色，这种异染色质通常位于着丝粒周围并常含有高度重复序列的DNA，此方法观察到的图片为黑白图片，信号位置局限在着丝粒周围。GISH，即基因组原位杂交技术，是以总基因组序列为探针标记染色体，探针准备要求大量高浓度基因组DNA，局限在于基因组染色体亲缘关系近时不能被区别，另外封阻比例将影响杂交信号强弱，片子回收利用难度大，实验重复性不强，图片为彩色。FISH，即荧光原位杂交技术，多以几百碱基DNA片段为探针，探针浓度要求较低，使用量少，可以识别GISH不能识别的近缘基因组染色体，无需封阻，片子回收再利用容易，便于对同一片子进行多次杂交实验，图片为多色。[0003]本发明通过设计、合成用于检测燕麦属植物染色体的18-51bp的寡序列探针，建立稳定便捷的荧光原位杂交反应体系，克服了现有燕麦属植物染色体检测的诸多问题，为燕麦属植物染色体的检测提供新方法。发明内容[0004]针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用。本发明的技术方案为：[0005]第一个方面，本发明提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，包括Aml、ACT6、（GAA6、（TTG6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为:5-GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT-3，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体;所述ACT6探针的碱基序列为:5-ACTACTACTACTACTACT-3，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构;所述GAA6探针的碱基序列为：5-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构;所述TTG6探针的碱基序列为:5-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。[0006]进一步地，所述Aml探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。[0007]进一步地，所述ACT6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。[0008]进一步地，所述GAA6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。[0009]进一步地，所述TTG6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。[0010]第二个方面，本发明提供一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，包括：[0011]1上述探针组；[0012]2酶解液；[0013]34%多聚甲醛液；[0014]⑷2XSSC缓冲液；[0015]⑸70%FA液；[0016]⑹杂交液。[0017]进一步地，所述酶解液的配制方法为:每ImL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶;其中柠檬酸缓冲液的配制方法为:每50mL的ddH20加0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g梓檬酸。[0018]进一步地，所述4%多聚甲醛液的配制方法为:每IOOmL的IXPBS缓冲液加入4g多聚甲醛，在60°C水浴锅中水浴2-3h，其中所述IXPBS缓冲液的配制方法为：每IOOOmL的ddH2〇加入8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.42g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾。[0019]进一步地，所述2XSSC缓冲液的配制方法为:每IOOOmL的ddH20加入8.823g梓檬酸三钠和17.532g氯化钠。[0020]进一步地，所述70%FA液由去离子甲酰胺FA和2XSSC缓冲液按照体积比7:3组成。[0021]进一步地，所述杂交液由等体积的IXTE和2XSSC缓冲液组成;其中IXTE的配制方法为：每800mL的CldH2O中加入1.211gTris和0.372gEDTANa2·2H20,用HCl调pH到8.0,定容到lOOOmL，灭菌后即得。[0022]第三个方面，本发明提供一种用于检测燕麦属植物染色体的方法，是采用上述试剂盒，包括以下步骤：[0023]1燕麦属植物染色体载玻片标本的制备:将燕麦属植物种子用双蒸水浸泡，置于4°C环境中放置24h，吸去多余水分，并于22°C恒温培养，待根尖长至1.5〜2.Ocm时，剪取1〜1.5cm根尖组织，依次用N2O处理5h、冰醋酸处理5min，然后置于75%酒精中于-20°C保存；[0024]将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1〜2mm，置于酶解液中于37°C酶解45min，去除酶解液，依次用双蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生组织后室温晾干;在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液;将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检，镜检良好的玻片于_20°C保存；[0025]2荧光原位杂交:将载玻片置于4%多聚甲醛中处理IOmin，然后用2XSSC缓冲液处理两次，每次5min，再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干后滴加70%FA液，盖上盖玻片，于80°C变性2min;[0026]载玻片变性完成后于5s内依次放入-20°C的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干;在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液，每张载玻片滴加10μL放有探针的杂交液，其中每种探针含有0.5yL，剩余为杂交液;盖上盖玻片，于黑暗条件下在杂交盒中于37°C恒温孵化1.5〜2h;[0027]将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2XSSC缓冲液清洗3min、双蒸水清洗2min，室温瞭干；[0028]3信号检测:晾干后的载玻片上加入DAPI，盖上盖玻片，采用荧光显微镜对载玻片进行检测，采集检测图像；[0029]4载玻片回收:信号采集之后回收制片并放入2XSSC缓冲液中于60°C水浴5min，依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度处理，每次5min，处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h;-20°C保存以备下次使用。[0030]本发明的有益效果在于:本发明基于荧光原位杂交技术，提供了一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，该探针组为识别燕麦属植物染色体的18_51bp的寡序列探针，有助于建立稳定便捷的染色体荧光原位杂交反应体系;本发明还提供了一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，该试剂盒应用于检测燕麦属植物染色体，具有重复性好，操作简便的优点；其中杂交液的组成比前人报道的简单了很多，只包含两种极易配制的液体。本发明还提供了一种用于检测燕麦属植物染色体的方法，该方法可反复使用制片，并且探针准备容易、快速，灵敏度高，需求探针DNA量少，价廉物美，根尖制片容易，易于获取中期染色体，对避光要求相对较低，整个实验流程的时间缩短，操作简便。附图说明[0031]图1为本发明的ACT6探针标记的燕麦属二倍体植物AA基因组的信号位点分布图像，其中图a〜f分另Ij表不Avenawiestii，AvenaIongiglumis，Avenabrevis,Avena5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μπι;[0032]图2为本发明的ACT6探针标记的燕麦属四倍体植物AABB基因组）的信号位点分布图像，其中图a〜c分别表不Avenabarbata，Avenaabyssinica，Avenavaviloviana的信号位点分布图像；（ACT6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μηι;[0033]图3为本发明的ACT6探针标记的燕麦属二倍体植物CC基因组的信号位点分布图像，其中图a和b分别表示Avenaventricosa，Avenaeriantha的信号位点分布图像；ACT6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μπι;[0034]图4为本发明的ACT6探针单独标记及和Aml探针混合标记的燕麦属四倍体植物AACC基因组）的信号位点分布图像，其中图a〜f表示:A.insularisa〜b，A.magnac〜1，六.11111印117；[6〜；0，0：1'6探针采用?六1标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，Aml探针米用TAMRM标记5’端，显不杂交信号如图中红色信号，标尺为5μηι;[0035]图5为本发明的ACT6探针单独标记及和Aml探针混合标记的燕麦属六倍体植物AACOD基因组）的信号位点分布图像;其中图a〜d表示:A.sativaa〜b，A.fatuac〜d，ACT6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，Aml探针采用TAMRM标记5’端，显示杂交信号如图中红色信号，标尺为5μπι;[0036]图6为本发明的GAA6探针标记的燕麦属二倍体植物AA基因组的信号位点分布图像，其中图a、b、e是采用TAMRM标记GAA6探针的5’端，如图中箭头所示显示红色信号，分别表示Avenaatlantica，Avenabrevis，Avenanuda的信号位点分布图像；图c、d、f是采用FAM标记GAA6探针的5’端，如图中箭头所示显示绿色信号，分别表示Avenacanariensis，Avenalongiglumis，Avenastrigosa的信号位点分布图像;标尺为5μηι;[0037]图7为本发明的GAA6探针标记的燕麦属四倍体植物AABB基因组）的信号位点分布图像，其中图a、b、c是采用FAM标记GAA6探针的5’端，如图中箭头所示显示绿色信号，分别表不Avenaabyssinica，Avenabarbata，Avenaagadiriana的信号位点分布图像；图d是采用TAMRM标记（GAA6探针的5’端，如图中箭头所示显示红色信号，表示Avenavavi1οViana的信号位点分布图像;标尺为5μηι;[0038]图8为本发明的GAA6探针标记的燕麦属二倍体植物CC基因组的信号位点分布图像，其中图a和b分别表示Avenaeriantha，Avenaventricosa的信号位点分布图像；GAA6探针采用TAMRM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示红色信号，标尺为5μπι;[0039]图9为本发明的GAA6探针标记的燕麦属四倍体植物AACC基因组）的信号位点分布图像，其中图a和b是采用TAMRM标记GAA6探针的5’端，显示红色信号，分别表示Avenainsularis，Avenamagna的信号位点分布图像；图c是采用FAM标记GAA6探针的5’端，显示绿色信号，表示Avenamurphyi的信号位点分布图像;标尺为5μηι;[0040]图10为本发明的GAA6探针标记的燕麦属六倍体植物AACXDD基因组）的信号位点分布图像，其中图a采用FAM标记GAA6探针的5’端，显示绿色信号，表示Avenasativa的信号位点分布图像；图b采用TAMRM标记（GAA6探针的5’端，显示红色信号，表示Avenafatua的信号位点分布图像;标尺为5μηι;[0041]图11为本发明的（TTG6探针标记的燕麦属二倍体植物AA基因组）的信号位点分布图像，其中图a〜d分另Ij表不Avenalongiglumis,Avenanuda,Avenacanariensis，Avenastrigosa的信号位点分布图像；（TTG6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μηι;[0042]图12为本发明的（TTG6探针标记的燕麦属四倍体植物AABB基因组）的信号位点分布图像，其中图a〜d分别表不Avenabarbata，Avenavaviloviana，Avenaabyssinica，Avenaagadiriana的信号位点分布图像；（TTG6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μπι;[0043]图13为本发明的（TTG6探针标记的燕麦属二倍体植物CC基因组）的信号位点分布图像，其中图a和b分别表示Avenaeriantha，Avenaventricosa的信号位点分布图像；TTG6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，标尺为5μπι;[0044]图14为本发明的（TTG6和Aml探针混合标记的燕麦属四倍体植物AACC基因组）的信号位点分布图像;其中图a〜c表示:A.magna，A.murphyi，A.insularis;TTG6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，Aml探针采用TAMRM标记5’端，显示杂交信号如图中红色信号，标尺为5μπι;[0045]图15为本发明的（TTG6和Aml探针混合标记的燕麦属六倍体植物AACXDD基因组）的信号位点分布图像。其中图a和b分别表示A.sativa，fatua的信号位点分布图像；（TTG6探针采用FAM标记5’端，显示杂交信号如图中箭头所示绿色信号，Aml探针采用TAMRM标记5’端，显示杂交信号如图中红色信号，标尺为5μπι;具体实施方式[0046]本发明实施所采用的探针组均由北京生工公司合成，合成的探针用IXTE稀释至100Μ的浓度保存于-20°C，探针工作浓度需要再稀释为10Μ，也于-20°C保存。[0047]本发明实施所采用的18个燕麦属物种材料如表1所示，包括9个二倍体，7个四倍体，2个六倍体物种。其中二倍体物种包含7个AA基因组物种和2个CC基因组物种；四倍体物种包含4个AABB基因组物种和3个AACC基因组物种;六倍体物种基因组为AACCDD。[0048]表1本发明实施所米用的燕麦属物种材料[0050]下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。[0051]—方面，本发明具体实施例提供一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，包括Aml、ACT6、（GAA6、（TTG6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：S'-GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT-S'SEQIDN0:1，采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体;所述ACT6探针的碱基序列为^-ACTACTACTACTACTACT-SSEQIDN0:2，采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构;所述GAA6探针的碱基序列为:5-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3SEQIDN0:3，采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构;所述TTG6探针的碱基序列为：5-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3SEQIDN0:4，采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。[0052]第二个方面，本发明具体实施例提供一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，包括：[0053]1上述探针组；[0054]2酶解液，配制方法为:每ImL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶;其中柠檬酸缓冲液的配制方法为:每50mL的CldH2O加0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g柠檬酸；[0055]34%多聚甲醛液，配制方法为:每IOOmL的IXPBS缓冲液加入4g多聚甲醛，在60°C水浴锅中水浴2-3h，其中所述IXPBS缓冲液的配制方法为:每IOOOmL的ddH20加入8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.42g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾；[0056]42XSSC缓冲液，配制方法为：每IOOOmL的ddH20加入8.823g柠檬酸三钠和17.532g氯化钠；[0057]570%FA液，由去离子甲酰胺FA和2XSSC缓冲液按照体积比7:3组成；[0058]6杂交液，由等体积的IXTE和2XSSC缓冲液组成;其中IXTE的配制方法为:每800mL的CldH2O中加入1.211gTris和0.372gEDTANa2·2H20,用HCl调pH到8.0,定容到1000mL，灭菌后即得。[0059]第三个方面，本发明具体实施例提供一种用于检测燕麦属植物染色体的方法，是采用上述试剂盒，包括以下步骤：[0060]1燕麦属植物染色体载玻片标本的制备:将燕麦属植物种子用双蒸水浸泡，置于4°C环境中放置24h，吸去多余水分，并于22°C恒温培养，待根尖长至1.5〜2.Ocm时，剪取1〜1.5cm根尖组织，依次用N2O处理5h、冰醋酸处理5min，然后置于75%酒精中于-20°C保存；[0061]将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1〜2mm，置于酶解液中于37°C酶解45min，去除酶解液，依次用双蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生组织后室温晾干;在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液;将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检，镜检良好的载玻片于_20°C保存；[0062]2荧光原位杂交:将载玻片置于4%多聚甲醛中处理IOmin，然后用2XSSC缓冲液处理两次，每次5min，再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干后滴加70%FA液，盖上盖玻片，于80°C变性2min;[0063]载玻片变性完成后于5s内依次放入-20°C的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干;在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液，每张载玻片滴加10μL放有探针的杂交液，其中每种探针含有0.5yL，剩余为杂交液;盖上盖玻片，于黑暗条件下在杂交盒中于37°C恒温孵化1.5〜2h;[0064]将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2XSSC缓冲液清洗3min、双蒸水清洗2min，室温瞭干；[0065]3信号检测:晾干后的载玻片上加入DAPI，盖上盖玻片，采用荧光显微镜对载玻片进行检测，采集检测图像；[0066]4载玻片回收:信号采集之后回收制片并放入2XSSC缓冲液中于60°C水浴5min，依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度处理，每次5min，处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h;-20°C保存以备下次使用。[0067]实施例1[0068]本实施例采用试剂盒中的（ACT6探针标记6种燕麦属二倍体植物AA基因组）：Avenawiestii?Avenalongiglumis，Avenabrevis，Avenanuda，Avenastrigosa，Avenacanariensis。（ACT6探针的碱基序列为：5-ACTACTACTACTACTACT-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述6种燕麦属二倍体植物的杂交信号，它们的信号位点分布图像中除了Avenabrevis有四个信号外，其余都是两个信号，如图1所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为ACT6杂交信号。[0069]实施例2[0070]本实施例采用试剂盒中的ACT6探针标记3种燕麦属四倍体植物AABB基因组）：Avenabarbata，Avenaabyssinica，AvenaVavilovianac3ACTS探针的碱基序列为：5'-ACTACTACTACTACTACT-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述3种燕麦属四倍体植物的杂交信号，每个物种含有四个信号，如图2所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为ACT6杂交信号。[0071]实施例3[0072]本实施例采用试剂盒中的（ACT6探针标记2种燕麦属二倍体植物（CC基因组）：Avenaventricosa，Avenaeriantha。（△71'6探针的碱基序列为：5-厶7^7^7^^厶^厶0'-3、采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述2种燕麦属二倍体植物的杂交信号，每个物种含有六个信号，如图3所示，图中的标尺为5μηι，箭头所指为ACT6杂交信号。[0073]实施例4[0074]本实施例采用试剂盒中的ACT6探针单独标记或者与Aml探针混合标记3种燕麦属四倍体植物AACC基因组）：Avenainsularis，Avenamagna，AvenamurphyijACT6探针的碱基序列为:5-ACTACTACTACTACTACT-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，单独标记或者混合标记的探针用量均为〇.5yLJml探针采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为〇.5以匕通过荧光显微镜可以清楚观察到4代11111811148显示14个仏：1'6信号，Avenamagna和Avenamurphyi显示10个ACT6信号，3个物种均显示14条Aml染色体信号，Avenainsularis显不6个AC染色体易位信号，Avenamagna，Avenamurphyi显不8个AC染色体易位信号，如图4所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为ACT6的杂交信号。[0075]实施例5[0076]本实施例采用试剂盒中的ACT6单独标记或者与Aml探针混合标记2种麦属六倍体植物（厶厶^00基因组）：厶¥6仙831：；[¥3，厶¥6113€31：1^。（厶]1'6探针的碱基序列为：5-ACTACTACTACTACTACT-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，单独标记或者混合标记的探针用量均为〇.5yLJml探针采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过焚光显微镜可以清楚观察到，Avenasativa含有14个ACT6信号，Avenafatua含有12个ACT6信号，2个物种均显示14条Aml染色体信号，Avenasativa显示12个AD-C染色体易位信号，Avenafatua显示10个AD-C染色体易位信号，如图5所示，图中的标尺为5μηι，箭头所指为ACT6杂交信号。[0077]实施例6[0078]本实施例采用试剂盒中的（GAA6探针标记6种燕麦属二倍体植物AA基因组）：Avenaatlantica,Avenabrevis,Avenacanariensis,Avenalongiglumis,Avenanuda，5’端，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，或者采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述6种燕麦属二倍体植物的杂交信号，每个物种含有两个信号，如图6所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为GAA6杂交信号。[0079]实施例7[0080]本实施例采用试剂盒中的GAA6探针标记4种燕麦属四倍体植物AABB基因组）：Avenaabyssinica,Avenabarbata,Avenaagadiriana,Avenavaviloviana。（GAA6探针的碱基序列为:5-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，或者采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述4种燕麦属四倍体植物的杂交信号，Avenaabyssinica含有14个信号，Avenabarbata含有12个信号，Avenaagadiriana含有2个信号，Avenavaviloviana含有10个信号，如图7所不，图中的标尺为5μηι，箭头所指为GAA6杂交信号。[0081]实施例8[0082]本实施例采用试剂盒中的（GAA6探针标记2种燕麦属二倍体植物（CC基因组）：Avenaeriantha，Avenaventricosa。（GAA6探针的碱基序列为：S'-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3、采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述2种燕麦属二倍体植物的杂交信号，每个物种含有2个信号，如图8所示，图中的标尺为5μηι，箭头所指为GAA6杂交信号。[0083]实施例9[0084]本实施例采用试剂盒中的GAA6探针标记3种燕麦属四倍体植物AACC基因组）：Avenainsularis，Avenamagna,Avenamurphyi〇GAA6探针的碱基序列为：5-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，或者采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为〇.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述3种燕麦属四倍体植物的杂交信号，Avenainsularis含有两个信号，Avenamagna含有8个信号，Avenamurphyi含有4个信号，如图9所示，图中的标尺为5μηι，箭头所指为GAA6杂交信号。[0085]实施例10[0086]本实施例采用试剂盒中的（GAA6探针标记2种燕麦属六倍体植物AACCDD基因组）：Avenasativa，Avenafatua。（6446探针的碱基序列为：5-64464464464464464六-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，或者采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述2种燕麦属六倍体植物的杂交信号，Avenasativa含有8个信号，Avenafatua含有2个信号，如图10所示，图中的标尺为5μηι，箭头所指为GAA6杂交信号。[0087]实施例11[0088]本实施例采用试剂盒中的（TTG6探针标记4种燕麦属二倍体植物AA基因组）：Avenalongiglumis,Avenanuda,Avenacanariensis,Avenastrigosa。（TTG6探针的碱基序列为：5-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述4种燕麦属二倍体植物的杂交信号，每个物种含有六个信号，如图11所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为TTG6杂交信号。[0089]实施例12[0090]本实施例采用试剂盒中的（TTG6探针标记4种燕麦属四倍体植物AABB基因组）：Avenabarbata,Avenavaviloviana,Avenaabyssinica,Avenaagadiriana。（TTG6探针的碱基序列为:5-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述4种燕麦属四倍体植物的杂交信号，Avenabarbata含有8个信号，Avenavaviloviana含有10个信号，Avenaabyssinica含有14个信号，Avenaagadiriana含有10个信号，如图12所示，图中的标尺为5μηι，箭头所指为TTG6杂交信号。[0091]实施例13[0092]本实施例采用试剂盒中的（TTG6探针标记2种燕麦属二倍体植物（CC基因组）：Avenaeriantha，Avenaventricosa。（TTG6探针的碱基序列为A'-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3、采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到上述2种燕麦属二倍体植物的杂交信号，每个物种含有4个信号，如图13所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为TTG6杂交信号。[0093]实施例14[0094]本实施例采用试剂盒中的（TTG6与Aml探针混合标记3种燕麦属四倍体植物AACC基因组）：Avenamagna，Avenamurphyi，AvenainsulariseCTTGn探针的碱基序列为：5'-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。Aml探针采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到，Avenamagna显不12个（TTG6信号，Avenamurphyi显不10个（TTG6信号，Avenainsularis显示8个（TTG6信号，3个物种均显示14条Aml染色体信号，Avenamagna，Avenamurphyi显示8个AC染色体易位信号，Avenainsularis显示6个AC染色体易位信号，如图13所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为TTG6杂交信号。[0095]实施例15[0096]本实施例采用试剂盒中的TTG6与Aml探针混合标记2种麦属六倍体植物AACCDD基因组）：Avenasativa，AvenafatuaDTTG6探针的碱基序列为：5'-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，采用FAM标记其5’端，显示绿色信号，探针用量为0.5yL。Aml探针采用TAMRM标记其5’端，显示红色信号，探针用量为0.5yL。通过荧光显微镜可以清楚观察到，Avenasativa含有18个TTG6信号，Avenafatua含有16个TTG6信号，2个物种均显示14条Aml染色体信号，Avenasativa显示12个AD-C染色体易位信号，Avenafatua显示10个AD-C染色体易位信号，如图13所示，图中的标尺为5μπι，箭头所指为TTG6杂交信号。[0097]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

权利要求：1.一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，包括Aml、（ACT6、（GAA6、TTG6四种探针，其中所述Aml探针由51个碱基对组成，其碱基序列为：5-GATCCATGTGTGGTTTGTGGAAAGAACACACATGCAATGACTCTAGTGGTT-3，用于特异性识别燕麦属C基因组所有染色体;所述ACT6探针的碱基序列为:5-ACTACTACTACTACTACT-3，用于识别偏好C基因组部分染色体的部分结构，也微弱识别A染色体组部分染色体的部分结构;所述GAA6探针的碱基序列为：5-GAAGAAGAAGAAGAAGAA-3，用于识别偏好A和C基因组部分染色体的部分结构;所述TTG6探针的碱基序列为:5-TTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，用于识别偏好A基因组部分染色体部分结构，微弱识别C基因组部分染色体的部分结构。2.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述Aml探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。。3.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述ACT6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。4.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述GAA6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。5.根据权利要求1所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组，其特征在于，所述TTG6探针采用FAM或者TAMRA标记其序列的5’端。6.—种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，包括：1上述探针组；⑵酶解液；34%多聚甲醛液；⑷2XSSC缓冲液；⑸70%FA液；⑹杂交液；所述杂交液的由等体积的IXTE和2XSSC缓冲液组成；其中IXTE的配制方法为：每800mL的CldH2O中加入1.211gTris和0.372gEDTANa2·2H20,用HCl调pH到8.0,定容到1000mL，灭菌后即得。7.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述酶解液的配制方法为:每ImL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶;其中柠檬酸缓冲液的配制方法为:每50mL的CldH2O加0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g柠檬酸。8.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述2XSSC缓冲液的配制方法为:每IOOOmL的CldH2O加入8.823g柠檬酸三钠和17.532g氯化钠。9.根据权利要求6所述的一种用于检测燕麦属植物染色体的试剂盒，其特征在于，所述70%FA液由去离子甲酰胺FA和2XSSC缓冲液按照体积比7:3组成。10.—种用于检测燕麦属植物染色体的方法，是采用权利要求6〜9任意一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：1燕麦属植物染色体载玻片标本的制备:将燕麦属植物种子用双蒸水浸泡，置于4°C环境中放置24h，吸去多余水分，并于22°C恒温培养，待根尖长至1.5〜2.Ocm时，剪取1〜1.5cm根尖组织，依次用N2O处理5h、冰醋酸处理5min，然后置于75%酒精中于-20°C保存；将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1〜2_，置于酶解液中于37°C酶解45min，去除酶解液，依次用双蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生组织后室温晾干;在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液;将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检，镜检良好的玻片于_20°C保存；2荧光原位杂交:将载玻片置于4%多聚甲醛中处理IOmin，然后用2XSSC缓冲液处理两次，每次5min，再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干后滴加70%FA液，盖上盖玻片，于80°C变性2min;载玻片变性完成后于5s内依次放入-20°C的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理，每次5min，室温晾干;在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液，每张载玻片滴加IOyL放有探针的杂交液，其中每种探针含有〇.5yL，剩余为杂交液;盖上盖玻片，于黑暗条件下在杂交盒中于37°C恒温孵化1.5〜2h;将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2XSSC缓冲液清洗3min、双蒸水清洗2min，室温晾干；3信号检测：晾干后的载玻片上加入DAPI，盖上盖玻片，采用荧光显微镜对载玻片进行检测，采集检测图像；4载玻片回收:信号采集之后回收制片并放入2XSSC缓冲液中于60°C水浴5min，依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度处理，每次5min，处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h;-20°C保存以备下次使用。

百度查询： 四川农业大学 一种用于检测燕麦属植物染色体的探针组、试剂盒及应用

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