申请/专利权人：中国矿业大学(北京);北京合生元生态环境工程技术有限公司

申请日：2019-06-12

公开（公告）日：2020-10-16

公开（公告）号：CN110200018B

主分类号：A01N63/30(20200101)

分类号：A01N63/30(20200101);A01P21/00(20060101);C09K17/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.16#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.06#公开

摘要：本发明公开了一种促进植物生根的最佳DSE接菌量。本发明公开的促进植物生根的最佳DSE接菌量中菌丝干重为0.468‑1.404mgmL，利用菌丝干重为0.468‑1.404mgmL的含有深色有隔内生真菌的液体浸泡植物组织或器官，实现促进植物生根，采用深色有隔内生真菌的培养液处理植物器官后的根长、根数以及根直径均显著增加，且以深色有隔内生真菌的浓度稀释为20％即菌丝干重为0.468mgmL最佳。本发明利用植物生根的最佳DSE接菌量处理植物组织或器官可以辅助植物生根，促进植物生长，对于提高土地复垦效率具有积极的生态意义，也为矿区土地复垦和生态重建提供一种微生物技术支撑。

主权项：1.促进中糯一号生根的方法，包括：利用深色有隔内生真菌处理中糯一号组织或器官，实现促进中糯一号生根；所述深色有隔内生真菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.17464的菌株。

全文数据：一种促进植物生根的最佳DSE接菌量技术领域本发明涉及生物技术领域中，一种促进植物生根的最佳DSE接菌量。背景技术深色有隔内生真菌DarkSeptateEndophytes，DSE具有与菌根真菌类似的生物学功能，主要定殖于健康植物根的表皮、皮层甚至维管束组织的细胞内或细胞间隙，形成共生体，而不引起植物病变。DSE生态分布广泛，在不同生境植物中的定殖表明它们很少或没有宿主特异性，并能与植物建立了互惠互利以及相互调节的生理整体，但各自具有其形态特征。研究表明，DSE在胁迫环境中发挥着更为重要的作用，其通过菌丝的生长扩大了植物根系吸收面积，提高了原根系吸收范围之外的营养元素吸收能力。发明内容本发明所要解决的技术问题是如何促进植物生根。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种促进植物生根的方法，所述方法包括：利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官，实现促进植物生根。上述方法中，利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官可包括：利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官。上述方法中，含有所述深色有隔内生真菌的液体中菌丝干重可为0.468-1.404mgmL。含有所述深色有隔内生真菌的液体中菌丝干重具体可为0.468mgmL或1.404mgmL。所述菌丝干重为利用滤纸过滤含有所述深色有隔内生真菌的液体收集菌丝并烘干至恒重得到的菌丝干重。上述方法中，所述含有所述深色有隔内生真菌的液体可为所述深色有隔内生真菌的培养液或所述培养液的稀释液。所述培养液可为利用MMN培养基培养所述深色有隔内生真菌所得培养液。所述稀释液可利用水稀释所述培养液得到。所述MMN培养基可通过将CaCl20.05g，MgSO40.15g，NaCl0.025g，FeCl30.01g，KH2PO40.5g，VitaminB1硫胺素0.0001g，NH42HPO40.25g，Glucose葡萄糖10g，Citricacid柠檬酸0.2g和Maltextract麦芽提取物10g混合后，加入蒸馏水1000ml，灭菌得到。上述方法中，利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官时，所述植物组织或器官的一半可处于空气中。在处理过程中，可通过添加所述MMN培养基以使所述植物组织或器官的一半处于空气中。上述方法中，所述处理的时间为15天。所述处理的条件可为：前3天在黑暗中进行，温度为22℃，空气相对湿度为70％；处理三天后，光照培养，光照强度为1500-2000Lux，光周期为16h光照8h黑暗，光照和黑暗下培养温度分别为25和22℃，空气相对湿度70％。上述方法中，所述促进植物生根可体现在促进植物根的伸长、根数增加和或根的加粗上。上述方法中，所述植物器官可为植物种子。上述方法中，所述深色有隔内生真菌可为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.17464。上述方法中，所述植物可为a1或a2或a3：a1单子叶植物或双子叶植物；a2禾本科植物；a3玉米。所述植物组织或器官可为无菌组织或器官。所述处理可在无菌环境中进行。所述促进植物生根的方法的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：X1植物生产；X2植物种植；X3促进植物生长；X4促进土地复垦。所述植物可为a1或a2或a3：a1单子叶植物或双子叶植物；a2禾本科植物；a3玉米。在本发明的一个实施例中，所述玉米为中糯一号。本发明的促进植物生根的方法中，采用深色有隔内生真菌的培养液处理植物器官后的根长、根数以及根直径均显著高于未利用深色有隔内生真菌处理的对照组，在利用深色有隔内生真菌处理植物器官时，以深色有隔内生真菌的浓度为20％最佳。本发明的促进植物生根的方法可以辅助植物生根，促进植物生长，对于提高土地复垦效率具有积极的生态意义，也为矿区土地复垦和生态重建提供一种微生物技术支撑。生物材料保藏说明生物材料的分类命名：Darksideazeta生物材料的菌株编号：针A1-3生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心生物材料的保藏单位简称：CGMCC生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101生物材料的保藏日期：2019年4月8日生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.17464附图说明图1为不同浓度的DSE培养液浸种对玉米根的影响。CK表示利用无菌水浸种，MMNCK表示利用无菌MMN液体培养基浸种，20％、40％和60％分别表示利用20％DSE培养液、40％DSE培养液和60％DSE培养液浸种；同图中，标有不同小写字母的数据间有显著差异，标有相同小写字母的数据间无显著差异。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，接菌的实验方法如无特殊说明，均在无菌操作台中完成。DSE与玉米种子共培养在人工气候箱中RXZ智能型人工气候箱。实施例1、不同浓度的DSE培养液对玉米生根的影响深色有隔内生真菌DSEDarksideazeta其名称为针A1-3：由发明人从内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系中分离纯化所得菌株，按照如下方法鉴定为深色有隔内生真菌：检测该菌株的ITS序列，其序列为序列表中序列1。该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17464。玉米品种为中糯一号认证号：0103006-2000，北京中农作科技发展有限公司。一、DSE的培养PDA培养基：将马铃薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和琼脂14.0g混合后，加入蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。将DSE接种到PDA培养基中，28℃下黑暗倒置培养15天。二、DSE培养液的制备MMN液体培养基：将CaCl20.05g，MgSO40.15g，NaCl0.025g，FeCl30.01g，KH2PO40.5g，VitaminB1硫胺素0.0001g，NH42HPO40.25g，Glucose葡萄糖10g，Citricacid柠檬酸0.2g和Maltextract麦芽提取物10g混合后，加入蒸馏水1000ml，分装，121℃高压灭菌15min，备用。在步骤一培养结束后，取直径6mm的菌饼，接种到MMN液体培养基中，在25℃震荡培养，摇床转速第一天为180rmin，第二天开始改为160rmin，培养15天后，得到DSE培养液，1mLDSE培养液中DSE菌丝干重即DSE培养液经滤纸过滤，收集菌丝烘干至恒重后的菌丝干重为2.34mg，备用。三、不同浓度的DSE培养液对植物生根效果的影响用无菌水对步骤二所得的DSE培养液进行稀释，得到三个浓度的培养液，即20％DSE培养液20％DSE培养液：取步骤二所述DSE培养液20ml，用无菌水稀释至100ml、40％DSE培养液40％DSE培养液：取步骤二所述DSE培养液40ml，用无菌水稀释至100ml，和60％DSE培养液60％DSE培养液：取步骤二所述DSE培养液60ml，用无菌水稀释至100ml，待用。取无菌三角瓶100ml，分为五组，每组3个，每个三角瓶中放入5粒中糯一号玉米种子。将以上获得的三个浓度的DSE培养液分别加入三组三角瓶中，每组一种浓度的DSE培养液，保证每瓶培养液5ml即液体刚好没过种子的一半。剩下一组用无菌水作为对照，另一组采用无菌MMN液体培养基作为对照。所有三角瓶用无菌PVA膜封口。每隔5天添加一次无菌MMN营养液共培养15天后，利用CI600软件统计分析玉米根系生长情况。培养前3天在黑暗中进行，温度为22℃，空气相对湿度为70％；培养三天后，光照培养，光照强度为1800Lux在培养箱内，光照处于1500-2000Lux范围内，平均为1800Lux，光周期为16h光照8h黑暗，光照和黑暗下培养温度分别为25和22℃，空气相对湿度70％。不同浓度的DSE培养液浸种促生根的影响结果如图1和表1所示，加入量为20％DSE培养液的玉米平均单株总根长和平均根直径均显著高于其他各组植株根系的相应指标，20％和60％DSE培养液的玉米平均单株根数均显著高于其他各组。表明，20％DSE培养液有助于促进玉米种子生根。表1、不同浓度的DSE培养液浸种对玉米根的影响表1中，总根长表示平均单株总根长，根数表示平均单株根数；同一列的数据中，标有不同小写字母的数据间有显著差异，标有相同小写字母的数据间无显著差异。中国矿业大学（北京）、北京合生元生态环境工程技术有限公司一种促进植物生根的最佳DSE接菌量1PatentInversion3.51590DNA深色有隔内生真菌（Darksideazeta）1cttccgtaaggtgacctgcggaaggatcattacctggccttgggccgctcgcgggagcta60gtcgcttgcgacgacgctaccgagggcgcttagcccttgactatcaccttgactacgtgc120accttttgttgtttcctcggcaggtcacctgccgccaggaaccctctaaaccttttgcaa180tagcatccaaacttctgaaaacaaaccaaattatttacaacttttaacaatggatctctt240ggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtagtgtgaattgcagaattc300agtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccatggtattccgtggggcatgcct360gttcgagcgtcatttaccccctcaagctccgcttggtgttgggcgtctgtcccgcttcgc420gcgcggactcgccccaaaggtattggcagcggtcgtgccagcttctcgcgcagcacattg480cgcttctcgaggcaccggcgggcccgcgtccatcaagctcacccccccagtttgacctcg540gatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa590

权利要求：1.促进植物生根的方法，包括：利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官，实现促进植物生根。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官包括：利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：含有所述深色有隔内生真菌的液体中菌丝干重为0.468-1.404mgmL。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述含有所述深色有隔内生真菌的液体为所述深色有隔内生真菌的培养液或所述培养液的稀释液。5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官时，所述植物组织或器官的一半处于空气中。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述处理的时间为15天；和或，所述处理的条件为：前3天在黑暗中进行，温度为22℃，空气相对湿度为70％；处理三天后，光照培养，光照强度为1500-2000Lux，光周期为16h光照8h黑暗，光照和黑暗下培养温度分别为25和22℃，空气相对湿度70％。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述促进植物生根体现在促进植物根的伸长、根数增加和或根的加粗上；和或，所述植物器官为植物种子；和或，所述深色有隔内生真菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.17464。8.权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为a1或a2或a3：a1单子叶植物或双子叶植物；a2禾本科植物；a3玉米。9.权利要求1-8中任一所述方法的下述任一应用：X1植物生产；X2植物种植；X3促进植物生长；X4促进土地复垦。

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