申请/专利权人：华南农业大学;肇庆大华农生物药品有限公司

申请日：2017-03-24

公开（公告）日：2020-10-30

公开（公告）号：CN106916842B

主分类号：C12N15/70(20060101)

分类号：C12N15/70(20060101);C07K14/435(20060101);C07K1/113(20060101);C07K1/22(20060101);C07K1/34(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.30#授权;2017.07.28#实质审查的生效;2017.07.04#公开

摘要：本发明公开一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：1使用如SEQIDNo.1和PCRSEQIDNo.2所示的引物对进行PCR扩增；2构建原核表达载体；3筛选；4诱导表达；5纯化和6复性。该方法各步骤操作简单，快速高效，是一种针对跳蚤唾液过敏原FSA1原核表达蛋白的纯化工艺，该工艺克服了已有工艺复性后复性浓度小，蛋白易聚集的缺陷，并且大大提高生产效率，降低生产成本，适合工业化大规模生产。

主权项：1.一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：1）PCR扩增：以人工合成的FSA1基因为模板，用如SEQIDNo.1所示的上游引物和SEQIDNo.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物,目的基因的序列如SEQIDNo.3所示；SEQIDNo.1：5’-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3’；SEQIDNo.2：5’-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3’；2）构建原核表达载体：将步骤1）得到的扩增产物用EcoRI、XhoI双酶切，与pET28a载体质粒连接，得到重组表达质粒；3）筛选：将步骤2）得到的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，种入LB平板培养基，筛选出含有重组质粒的阳性大肠杆菌；4）诱导表达：将所述阳性大肠杆菌种于含有卡那抗性的LB培养基，置于恒温振荡培养箱中培养，得到含有FSA1蛋白的菌体；5）纯化：将步骤4）的菌体从培养基中分离，重悬破碎，离心收集包涵体，洗涤包涵体，加入变性剂，通过柱层析去除杂质，得到含纯化的FSA1蛋白的洗脱液；所述变性剂为含有终浓度300mM的KCl、终浓度50mM的KH2PO4、终浓度6-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的pH为7.5-9.0；6）复性：将步骤5）得到的含纯化的FSA1蛋白的洗脱液浓缩，滴入蛋白复性缓冲液中复性，透析，获得纯化的rFSA1蛋白；所述复性缓冲液为含有1mM的EDTA、500mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8.0-9.0。

全文数据：一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法技术领域[0001]本发明涉及一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，属于生物工程技术领域。背景技术[0002]跳蚤是世界农场动物以及犬、猫等家养动物最重要的、最常见外寄生昆虫，对犬、猫等小动物的感染率极高，危害极大。跳蚤过敏性皮炎Fleaallergydermatitis，FAD是由跳蚤叮咬引起的一种过敏性的皮肤病，造成犬、猫及其它动物的皮炎、剧烈瘙痒以及抓挠导致的二次感染。随着社会经济的快速发展，城市逐渐兴起了宠物热，犬猫的跳蚤问题也成为了人类所面临的问题。根据文献提供的数据，在美国每年用于防治宠物跳蚤的费用超过10亿美元。跳蚤侵扰不仅损害动物健康而且给人类造成大量的经济损失。[0003]猫桎首蚤是跳蚤中分布最广、宿主多的蚤种，在北京郊区猫的猫桎首蚤感染率达到100%，因此也是危害最大的一种蚤类。它的唾液中含有多种过敏原物质，其中最主要的一种是跳蚤唾液过敏原Fleasalivaryantigen1，FSA1，能诱导机体产生IgE介导的I型过敏反应和IV型过敏反应。[0004]临床诊断FAD可以通过跳蚤提取物的皮试反应，及针对FAD的ELISA检测血清特异性IgE。但是跳蚤提取物依赖于进口，费用昂贵，因此需要找到一种专一性好，价格低廉，检出效果好的替代方法。[0005]经试验证实，利用rFSAl能引发跳蚤过敏性皮炎患犬阳性的皮内测试反应，阳性检出率达到S0%。利用rFSAl能刺激FAD患病犬猫外周血T淋巴细胞的增殖。利用rFSAl作为包被抗原，建立的跳蚤过敏性皮炎ELISA检测方法阳性检出率达到80%以上。利用rFSAl和与之编码相匹配的核酸疫苗预防或治疗跳蚤过敏性皮炎可取得理想效果。采用基因工程技术获得过敏原单一组分，其成分单一，纯度高、特异性好、价格低廉，可以提高诊断的精准性，同时能用于犬猫FAD的防治。因此，如何提供一种FSA1过敏原基因克隆、表达、纯化的方法，提高产物的纯度，提高阳性率是本领域技术人员亟待解决的技术问题。不仅具有重要的经济意义，而且具有重要的社会意义。发明内容[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、高效、稳定的猫桎首圣跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法。[0007]实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：[0008]一种猫桎首圣跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：[0009]1PCR扩增：以人工合成的FSA1基因为模板，用如SEQIDNo.l所示的上游引物和SEQIDNo.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；[0010]SEQIDNo.1：-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3,；[0011]SEQIDNo.2：5'-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3,；[0012]其中划线部分为酶切位点；[0013]2构建原核表达载体:将步骤D得到的扩增产物用EcoRI、XhoI双酶切，与载体质粒连接，得到重组表达质粒；[0014]3筛选:将步骤2得到的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，种入LB平板培养基，筛选出含有FSA1重组质粒的阳性大肠杆菌；[0015]4诱导表达:将所述阳性大肠杆菌种于含有卡那抗性的LB培养基，置于恒温振荡培养箱中培养，得到含有FSA1蛋白的菌体；[0016]5纯化:将步骤4的菌体从培养基中分离，重悬破碎，离心收集包涵体，洗涤包涵体，加入变性剂，通过柱层析去除杂质，得到含纯化的FSA1蛋白的洗脱液；[0017]6复性:将步骤5得到的含纯化的FSA1蛋白的洗脱液浓缩，滴入蛋白复性缓冲液中复性，透析，获得纯化的rFSAl蛋白。[0018]作为优选，步骤1中，PCR扩增体系25uL:Exteq酶12.5yL，DNA模板lyL，上游引物和下游引物各〇.5yL，补加ddH20至25yL。[0019]作为优选，步骤1中，PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C30s，53°C30s，72C30s，共35个循环，最后72°C延伸lOmin。[0020]作为优选，步骤2中，载体质粒为pET28a。[0021]作为优选，步骤4中，待0D600=0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为O.lmM进行诱导表达，[0022]作为优选，步骤5中，所述变性剂为BufferA。[0023]作为优选，步骤5中，柱层析的柱体为Ni-NTA柱，先采用5倍体积BufferA平衡层析柱，接着用BufferA+B洗脱杂蛋白，最后用BufferB洗脱收集目的蛋白，其中BufferA+B为vBufferA:vBufferB=1:5-16。[0024]作为优选，步骤5中，洗涤所采用的洗涤液为含有10-lOOmMTris-HCl、l-10mMEDTA、l-5vt%Triton-X100、20-200raMNaCl的水溶液，洗涤液的pH为7.5-9•0。[0025]作为优选，步骤5中，所述变性剂为含有60—600mM的KC1、终浓度l〇-l〇〇mM的KH2P〇4、终浓度6-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的pH为7•5-9.0。[0026]作为优选，步骤6中，所述复性缓冲液为含有ImM的EDTA、250-700mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8.0-9.0。[0027]相比现有技术，本发明的有益效果在于：[0028]本发明在整个工艺中所采用的试剂可以通过多种商业途径得到，且各步骤操作简单，快速高效，是一种针对跳蚤唾液过敏原FSA1原核表达蛋白的纯化工艺，该工艺克服了己有工艺复性后复性浓度小，蛋白易聚集的缺陷，并且大大提高生产效率，降低生产成本，适合工业化大规模生产。附图说明[0029]图1为实施例1的PCR扩增结果图；[0030]图2为实施例1的重组表达质粒pET28a-FSAl双酶切鉴定；[0031]图3为实施例2的重组FSA1的诱导结果图；[0032]图4为实施例3的rFSAl纯化结果图；LUU」图5为rFSAl蛋白对T淋巴细胞增殖反应的影响图；[0034]图6为血清中特异性IgE结果图。具体实施方式[0035]下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：[0036]以下具体实施方式中，如未特殊说明，所采用的试剂或器材均可通过市售方式或常规试验手段获得。[⑻37]实施例1:重组FSA1表达质粒的构建[0038]以人工合成FSA1为模板，以SEQIDNo.l和SEQID如.2作为特异性引物进行卩0?扩增;取5uL反应产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果，扩增结果如图1所示。[0039]SEQIDNo•1:5’-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3,；[0040]SEQIDNo.2:5’-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3,；[0041]PCR扩增体系25yL:Exteq酶12.5yL，DNA模板1此，上游引物和下游引物各0.5此，补加ddH20至25uL;[0042]PCR扩增反应程序为：94°C预变性51^11，9413〇3,531：3〇3,721：3〇3，共35个循环，最后72°C延伸lOmin。[0043]将得到的PCR扩增产物用胶回收纯化试剂盒纯化后，用Ec〇RI和XhoI双酶切扩增产物，同时pET28a也用EcoRI和XhoI双酶切，双酶切鉴定结果如图2所示，切胶回收纯化经双酶切目的基因和pET28a载体片段，目的基因的序列如SEQIDNo.3所示，放置于连接仪16°：过夜连接，得到重组质粒pET28a-FSAl，将所述重组质粒转化大肠杆菌BL21DE3感受态细胞，涂布LB平板，挑取单个菌落，接种于LB培养基中培养，碱裂解法抽提质粒，经双酶切和PCR鉴定后，获得包含重组质粒pET28a-FSAl的阳性重组大肠杆菌。[0044]实施例2:FSA1原核表达蛋白的诱导表达和粗纯化[0045]将实施例1得到的阳性重组大肠杆菌划线接种于卡那抗性的LB平板培养，37°C培养过夜，次日挑取单菌落接种于10mLLB培养液中，200rpm振荡培养，培养至㈤600达0•6。加入IPTG至终浓度为0.lmmo1L进行诱导表达，诱导表达4h后，将诱导表达的菌液进行超声波破碎，经超声波破碎后的所述诱导表达的菌液离心并收集包涵体，用洗涤液洗涤包涵体，洗涤液为含有终浓度5011^1丨3-11：1、11111£0了八、体积比1%1'1^1:〇11-100、10011^旭：1的水溶液，该包涵体洗漆液的pH为8.0。洗漆后8000rpmmin离心10min倒去上清，连续3次;最后用含变性剂溶解包涵体，变性剂为含有终浓度300mM的KC1、终浓度50mM的KH2P〇4、终浓度5-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的pH为8.0;过夜搅拌溶解，包涵体的电泳条带图如图3所示。用0.45um孔径的滤膜过滤后即得溶液澄清、杂质少的包涵体变性可溶性蛋白。[0046]实施例3:FSA1原核表达蛋白Ni-NTA柱亲和层析精纯化[0047]用5倍柱体积BufferA平衡亲和层析柱，将实施例2得到的可溶性蛋白通过Ni-NTA柱亲和层析纯化以吸附目的蛋白，然后再用5倍柱体积BufferA平衡层析柱，接着用10倍柱体积BufferA+B洗脱杂蛋白，最后用BufferB洗脱收集目的蛋白，所收集的目的蛋白溶液经蛋白显色液检测为接近无色确认收集完成。BufferA为含有终浓度300mM的KC1、终浓度50mM的KH2P〇4、终浓度5-10M的尿素的水溶液;BufferB为含有终浓度300mM的KC1、终浓度50mM的KH2P〇4、终浓度猢的尿素、5〇〇禮咪唑的溶液，BufferA+B为VBufferA:VBufferB=1:10。目的蛋白的蛋白电泳条带图如图4所示。[0048]实施例4:FSA1原核表达蛋白的复性与透析除盐[0049]将实施例3收集的目的蛋白溶液经孔径为l〇kd超滤柱浓缩后，以v目的蛋白：v蛋白复性液）=1:20逐滴加入蛋白复性液中复性48h，复性缓冲液的各组分终浓度分别为lmM的EDTA、500mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8•5。复性完成后对所述蛋白复性液置于透析袋中透析除盐。将复性蛋白装入透析袋孔径为6kd中，透析袋置于含有PBS透析液的装置，并不断缓慢搅拌，PBS进液管与初夜管流量保持相同，4°C持续透析36h，得到纯化的rFSAl蛋白。[0050]检测实施例[0051]1:FSA1原核表达蛋白的具体应用[0052]使用MTT法检测实施例4得到的纯化的rFSAl蛋白的T淋巴细胞增殖反应，结果如图5所示。该rFSAl蛋白对FAD患病猫外周血T淋巴细胞增殖活性检测影响如图，添加了rFSAl蛋白作为刺激药物组的T淋巴细胞增殖活性显著高于添加BSA作为刺激药物的对照组，说明rFSAl具有生物活性。[0053]2.检测患FAD猫血清特异性IgE[0054]以实施例4得到的纯化的rFSAl蛋白作为包被抗原，利用ELISA法检测的FAD患病猫的血清特异性IgE，其结果如图6所示，显示实验组的0D值显著高于健康猫对照组，说明该rFSAl蛋白具有较高的猫血清特异性IgE浓度。[0055]以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例己对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.一种猫桎首蚤跳蚤唾液过敏原FSA1的表达方法，包括以下步骤：1PCRf增：以人工合成的FSA1基因为模板，用如SEqID恥.丨所示的上游引物和SEQIDNo•2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；SEQIDNo•1:5’-CGGGAATTCATGGAAGATATTTGG-3’；SEQIDNo_2:5’-CGGCTCGAGTTATTTATTTTTTGG-3’；2构建原核表达载体:将步骤1得到的扩增产物用EcoRi、xh〇I双酶切，与载体质粒连接，得到重组表达质粒；3筛选:将步骤2得到的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，种入LB平板培养基，筛选出含有重组质粒的阳性大肠杆菌；4诱导表达:将所述阳性大肠杆菌种于含有卡那抗性的LB培养基，置于恒温振荡培养箱中培养，得到含有FSA1蛋白的菌体；5纯化:将步骤4的菌体从培养基中分离，重悬破碎，离心收集包涵体，洗涤包涵体，力口入变性剂，通过柱层析去除杂质，得到含纯化的FSA1蛋白的洗脱液；6复性:将步骤5得到的含纯化的FSA1蛋白的洗脱液浓缩，滴入蛋白复性缓冲液中复性，透析，获得纯化的rFSAl蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，PCR扩增体系25yL:Exteq酶12•5UL，DNA模板1uL，上游引物和下游引物各0•5uL，补加ddH20至25uL。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1中，PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C3〇s，53°C30s，72°C3〇s，共35个循环，最后72。：延伸1Omin。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2中，载体质粒为pET28a。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，待0D600=0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.ImM进行诱导表达。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，所述变性剂为BufferA。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，柱层析的柱体为Ni-NTA柱，先采用5倍体积BufferA平衡层析柱，接着用BufferA+B洗脱杂蛋白，最后用BufferB洗脱收集目的蛋白，其中BufferA+B为vBufferA:vBufferB=l:5-16。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，洗涤所采用的洗涤液为含有10-100mMTris-HCl、l_l〇mMEDTA、：L-5vt%Triton-X100、20-200mMNaCl的水溶液，洗涤液的pH为7_5-9.0。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，所述变性剂为含有60-600mM的KC1、终浓度10-100mM的KHfO4、终浓度6-10M的尿素的水溶液，该包涵体变性剂的PH为7.5-9.0。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6中，所述复性缓冲液为含有ImM的EDTA、250-700mM的L-Arg，该复性缓冲液pH为8•0-9•0。

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