申请/专利权人：郑州安图生物工程股份有限公司

申请日：2017-11-16

公开（公告）日：2020-11-24

公开（公告）号：CN107619849B

主分类号：C12Q1/04(20060101)

分类号：C12Q1/04(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.24#授权;2018.02.16#实质审查的生效;2018.01.23#公开

摘要：本发明公开了一种采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，首先确定两个检测微孔，记为甲孔和乙孔；甲孔内加入适量葡萄糖或和脲酶抑制剂，乙孔中加入锰镁溶液，干燥后使葡萄糖或和脲酶抑制剂附着在甲孔内壁上，锰、镁离子附着在乙孔内壁上；将待测样本加入脲原体培养基中，混合均匀后分别加入到甲孔和乙孔中，37℃培养24~48小时；根据甲孔和乙孔的变色情况即可确定样本中是否含解脲脲原体和微小脲原体。按照本发明方法制备成试剂盒更加方便使用。本发明的鉴定方法操作简单，一步即可精确区分标本中是否包含微小脲原体和解脲脲原体，同时能与药敏检测结合在一起，同时做出鉴别和药敏结果；鉴定结果直观、精确，方便临床推广使用。

主权项：1.一种区分检测脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的反应板，其特征在于：所述反应板具有两个检测微孔，分别记为甲孔和乙孔，所述甲孔内附着有葡萄糖或和脲酶抑制剂，葡萄糖的含量为0.2～1.2mg，脲酶抑制剂的含量为0.001～0.1mg；乙孔内添加有锰镁溶液，所述锰镁溶液中锰离子的含量为0.2～2μmol，镁离子的含量为0～5μmol，经干燥后，锰离子和镁离子附着在乙孔内壁上。

全文数据：采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法技术领域[0001]本发明涉及生物检测技术，尤其是涉及一种采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法。背景技术[0002]脲原体（Ureaplasma最早作为T株于1954年从人生殖道标本中分离，并于1974年被ShepardMC等人单独命名为一个新种一解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum。解脲脲原体分为两个生物群:Parvo群和T960群，进一步可分为14个血清型，Parvo群由血清型1、3、6、14组成，，T960群则包括2、4、5、7、8、9、10、11、12、13共十种血清型。这两群培养形成的菌落外观一致，划分生物群只能依据基因组之间的差异，需要使用核酸检测的方法。也有文献说划分生物群主要基于对锰的敏感性、多肽图谱和DNA-DNA杂交实验百分率等差异。KongF等从系统发育关系上首次指出解脲脲原体这两个生物群应该分别命名为微小脈原体（Ureaplasmaparvum，UP和解脈脈原体（Ureaplasmaurealyticum，UU。2007年国际细菌学分类学会正式将解脲脲原体中Parvo群分离作为一个新物种一微小脲原体Ureaplasmaparvum,UP〇[0003]两种脲原体可以从临床标本中单独或同时分离，它们可以正常寄生在健康人的泌尿生殖道，也与一些侵入性的疾病有关，比如尿道炎（urethritis、产后子宫内膜炎postpartumendometritis、绒毛膜羊膜炎（chorioamnionitis、自然流产（spontaneousabortion、早产（prematurebirth以及与早产儿相关的疾病诸如新生儿低体重（lowbirthweight、肺炎pneumonia、菌血症bacteremia、脑膜炎（meningitis和新生儿呼吸系统综合征neonatalrespiratorydisease。事实上，UU及UP与各种疾病是否有相关性的问题争议比较大，根源就在于二者的区分研究本世纪才开始，过去的研究资料都是在UP包括在UU内进行的。目前比较一致的意见是UU与非淋菌性尿道炎（non-gonorrhealurethritis,NGU高度相关，而UP在男性尿道是正常菌群。临床生殖道标本中UP比UU更为常见，检出率远高于UU，UP常见于临床无症状携带，多数人认为UP属于正常菌群。UP与疾患关系目前尚不明确，临床研究多集中在对新生儿的影响方面（1、宫内感染UP引起新生儿先天性肺炎；2、在早产儿中，UP和UU呼吸道感染是导致支气管肺发育不良的重要危险因素，增加新生儿罹患支气管肺和持续动脉高压的风险及严重程度）。[0004]正是由于UP与N⑶无关，且人群携带率远高于UU，因此精确检测并鉴别出解脲脲原体UU就显得尤为必要。[0005]目前检测脲原体的方法包括培养法、免疫学方法、分子生物学方法等：培养法是基于脲原体具有脲酶分解尿素，可使培养基PH升高而变色，操作比较简单方便，一般24-48小时即可得出结果，并且还可以与药敏测定同时进行，但这种方法目前不能区分UU和UP，检测的是脲原体。虽然很多培养法的产品说是检测解脲脲原体UU，但其实检测的是脲原体，也就是将微小脲原体和解脲脲原体一起检测，并不能真正做到将二者进行区分，只是采用了解脲脲原体与微小脲原体分开前的名字一解脲脲原体。[0006]免疫学方法检测脲原体分两大类，即检测抗体和检测抗原，这又分微孔板式的酶联免疫吸附法和条或卡式的胶体金法。酶联免疫吸附法操作稍显复杂，胶体金法则操作简单，一般20分钟就可出结果，但无论哪种方法都不能区分UU和UP。现实中也存在与培养法同样的情况，即很多产品说是检测解脲脲原体UU，但其实是检测脲原体，也就是将解脲脲原体和微小脲原体一起检测，并不能对二者进行区分，只是采用了解脲脲原体与微小脲原体分开前的名字，统称为解脲脲原体。[0007]分子生物学方法有三种，单引物PCR、多引物的多重PCR和基因测序。单引物PCR也是不能区分UU和UP，所检测的还是UU和UP;多引物的多重PCR和基因测序能够区分UU和UP，但操作过于复杂，不适宜临床使用，而且无法同时进行药敏测定。发明内容[0008]本发明的目的在于提供一种采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，该方法简单直观，可一步精确区分解脲脲原体UU和微小脲原体UP;并能与药敏检测结合，同时得出鉴别和药敏结果。[0009]为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：本发明所述的采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，包括下述步骤：第一步，确定两个检测微孔，分别记为甲孔和乙孔；第二步，甲孔内加入适量葡萄糖或和脲酶抑制剂，其中葡萄糖的含量为0.2〜1.2mg，脲酶抑制剂的含量为〇.〇〇1〜〇.Img;乙孔中加入锰镁溶液，所述锰镁溶液中锰离子的含量为0.2〜2μηιο1，镁离子的含量为0〜5μηιο1;经干燥（自然干燥、冷冻干燥或热风烘干均可），使葡萄糖或和脲酶抑制剂附着在甲孔内壁上，锰、镁离子附着在乙孔内壁上；第三步，将待测样本加入脲原体培养基中，混合均匀后分别加入到甲孔和乙孔中，37°C培养24〜48小时；第四步，根据甲孔和乙孔的变色情况确定样本中是否含解脲脲原体和微小脲原体：如果甲孔和乙孔均变色均为阳性），说明样本中有脲原体，既有解脲脲原体也有微小脲原体；如果甲孔变色（阳性），乙孔未变色（阴性），说明样本中有脲原体，所含的脲原体为解脲脲原体，但未有微小脲原体；如果甲孔未变色（阴性），乙孔变色（阳性），说明样本中有脲原体，所含的脲原体为微小脲原体，但样本中没有解脲脲原体。[0010]本发明所用的脲酶抑制剂为硫脲、硼酸、硫酸铜、丁基磷酰三胺NBT或正丁基硫代磷酸三胺等中的一种或两种以上混合溶液。[0011]本发明中所用的锰镁溶液为由硫酸锰或氯化锰或硝酸锰或醋酸锰与硫酸镁或氯化镁或硝酸镁或醋酸镁配制而成的混合溶液。[0012]本发明的方法在制备检测解脲脲原体和微小脲原体试剂盒中的应用。[0013]由于微小脲原体UP和解脲脲原体UU对锰离子的敏感性不同，UU对锰离子的耐受性低，而锰离子对UU和UP的抑制作用受镁离子解除效应不同，锰离子对UP的抑制作用更容易被镁离子所解除。另外虽然UU和UP都具有脲酶，但二者代谢生长速度差异大，UU的生长速度要快于UP，而且UU不利用葡萄糖，UU的脲酶受脲酶抑制剂的影响要小于UP。[0014]基于上述原理的本发明的鉴定方法，其优点在于操作简单，一步即可精确区分标本中是否包含微小脲原体和解脲脲原体，同时该方法能与药敏检测结合在一起，同时做出鉴别和药敏结果;按照本发明方法原理制成的检测试剂盒，鉴定结果直观、精确，方便临床推广使用。具体实施方式[0015]下面结合具体实施例对本发明做更加详细的说明。[0016]本发明所述的采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，包括下述步骤：第一步，确定两个检测微孔，分别记为甲孔和乙孔；第二步，甲孔内加入葡萄糖溶液，溶液中葡萄糖含量为0.2〜1.2mg实际使用时，甲孔内也可以加入0.001〜0.1mg的脲酶抑制剂，或者同时加入葡萄糖和脲酶抑制剂，使孔内葡萄糖含量为〇.4〜1.2mg，脲酶抑制剂含量为0.001〜0.1mg;乙孔中加入锰镁溶液，使溶液中锰离子的含量为〇.2〜2μηιο1，镁离子的含量为0〜5μηιο1;使用自然干燥、冷冻干燥或热风烘干等方法脱去水分，使葡萄糖或和脲酶抑制剂附着在甲孔内壁上，锰、镁离子附着在乙孔内壁上待用。[0017]实际制备时，脲酶抑制剂可采用硫脲、硼酸、硫酸铜、丁基磷酰三胺NBT或正丁基硫代磷酸三胺等中的其中一种或任意两种或多种混合溶液;所用的锰镁溶液为由硫酸锰或氯化锰或硝酸锰或醋酸锰与硫酸镁或氯化镁或硝酸镁或醋酸镁配制而成的混合溶液。[0018]对于多数UU菌种来说，采用较低的锰离子浓度如l-5mmolL就可以抑制其生长，这时，可仅采用锰离子也就是说乙孔中所加的溶液中可以不含镁离子），但对于少部分UU菌种来说，较低的锰离子浓度是不足以抑制它们的生长的，所以就需要提高锰离子的浓度，但是其中一些UP则耐受不了较高浓度的锰离子，这种情况下就需要添加一定量的镁离子以让受到锰离子抑制的UP复苏，所以乙孔中所加的溶液就需要采用同时含锰离子和镁离子的混合溶液;所加的锰镁溶液中的锰离子含量和镁离子含量可以在本发明公开的范围内进行调整。[0019]为方便使用，按照上述方法可以制备成更加方便使用的鉴定试剂盒:如采用带有两个检测微孔的反应板，其中一个微孔设为甲孔）内加入用水配制的葡萄糖和硼酸的混合溶液IOOul，其中葡萄糖的浓度为0.8%，硼酸的浓度为410000;而在另一微孔设为乙孔）中加入用水配制的氯化猛和硫酸镁混合溶液IOOul，称为猛镁溶液，其中溶液中氯化猛浓度7mmoll，硫酸镁浓度30mmoll;经自然干燥脱去水分，使葡萄糖和硼酸附着在甲孔内壁上，锰离子和镁离子附着在乙孔内壁上，然后将该反应板封闭保存即可。[0020]使用时，按常规方法将待测样本加入脲原体培养基中，混合均匀后分别在甲孔和乙孔中各加IOOul，37°C培养24〜48小时，根据甲孔和乙孔的变色情况确定样本中是否含解脲脲原体和微小脲原体：如果甲孔和乙孔均变色（均为阳性），说明样本中有脲原体，既有解脲脲原体UU也有微小脲原体UP;如果甲孔变色（阳性），乙孔未变色（阴性），说明样本中有脲原体，所含的脲原体为解脲脲原体UU，但未有微小脲原体UP;如果甲孔未变色（阴性），乙孔变色（阳性），说明样本中有脲原体，所含的脲原体为微小脲原体UP，但样本中没有解脲脲原体UU。[0021]本发明的临床效果统计：采用本发明实施例制备的试剂盒与UUUP多重实时荧光PCR试剂盒对比：使用263份泌尿生殖道标本，其中男性尿道试子标本64份，男性前列腺试子标本19份，女性阴道试子标本118份，女性宫颈拭子标本62份。[0022]统计结果见下表：从上表可以看出：其微小脲原体UP的灵敏度为95.45%105110，特异性为96.72%148153;解脲脲原体UU的灵敏度为94.74%3638，特异性为98.67%222225。[0023]对比结果表明：本发明方法或制备的试剂盒可以从标本中精确鉴定出解脲脲原体UU和微小脲原体UP，且操作方法非常简单，还可以同时进行药敏测定，完全可以用于临床。

权利要求：1.一种采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，其特征在于:包括下述步骤：第一步，确定两个检测微孔，分别记为甲孔和乙孔；第二步，甲孔内加入适量葡萄糖或和脲酶抑制剂，其中葡萄糖的含量为0.2〜1.2mg，脲酶抑制剂的含量为〇.〇〇1〜〇.Img;乙孔中加入锰镁溶液，所述锰镁溶液中锰离子的含量为0.2〜2μπι〇1，镁离子的含量为0〜5μπι〇1;经干燥，使葡萄糖或和脲酶抑制剂附着在甲孔内壁上，锰、镁离子附着在乙孔内壁上；第三步，将待测样本加入脲原体培养基中，混合均匀后分别加入到甲孔和乙孔中，37°C培养24〜48小时；第四步，根据甲孔和乙孔的变色情况确定样本中是否含解脲脲原体和微小脲原体：如果甲孔和乙孔均变色，说明样本中有脲原体，既有解脲脲原体也有微小脲原体；如果甲孔变色，乙孔未变色，说明样本中有脲原体，所含的脲原体为解脲脲原体，但未有微小脲原体；如果甲孔未变色，乙孔变色，说明样本中有脲原体，所含的脲原体为微小脲原体，但样本中没有解脲脲原体。2.根据权利要求1所述的采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，其特征在于:所述脲酶抑制剂为硫脲、硼酸、硫酸铜、丁基磷酰三胺或正丁基硫代磷酸三胺中的一种或两种以上混合溶液。3.根据权利要求1所述的采用培养法区分脲原体中解脲脲原体和微小脲原体的方法，其特征在于:所述锰镁溶液为由硫酸锰或氯化锰或硝酸锰或醋酸锰与硫酸镁或氯化镁或硝酸镁或醋酸镁配制而成的混合溶液。4.权利要求1的方法在制备检测解脲脲原体和微小脲原体试剂盒中的应用。

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